一種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針的制作方法

文檔序號:10532762
一種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針,由光纖琺珀干涉結構器件、光纖琺珀干涉結構器件端面的化學修飾層以及固定在化學修飾層上的生物分子敏感膜構成,光纖琺珀干涉結構器件由一段光子晶體光纖熔接兩段普通單模光纖制成;化學修飾層為生物相容性材料;生物分子敏感膜為具有特異性識別功能生物分子。檢測時,待測物與探針上的生物分子發生特異性結合,引起生物分子敏感層的有效折射率和厚度變化,通過光纖琺珀干涉傳感系統測得干涉譜的變化,實現對待測物的檢測。該生物傳感探針結構緊湊、制作簡單、靈敏度高,消除了溫度、光源擾動等對檢測光信號的影響,可實現對生物分子的免標記檢測和生物反應的動態實時監測。
【專利說明】
一種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針
技術領域
[0001]本發明屬于生物傳感技術領域,具體涉及一種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針。
【背景技術】
[0002]生物傳感技術對于分子生物學、臨床醫學和免疫檢測、環境和食品安全檢測、藥物研制及軍事生化檢測等具有重要的研究和應用價值。生物傳感器按是否使用標記物可分為兩類:一類是標記型生物傳感器,檢測時先用熒光素、放射性同位素或酶等標記物對待測物進行標記,然后通過檢測標記物的信號來獲取待測物的信息;另一類是免標記型生物傳感器,不需要對待測物進行標記,而是直接通過生物復合物形成時的物理、化學變化對生物對象進行檢測,其中免標記光纖生物傳感器是免標記生物傳感器家族中的重要一員。
[0003]光纖生物傳感器是上世紀70年代誕生的新型傳感技術,它將具有特異性識別功能的生物分子(如酶、抗原、抗體、核酸、病原體等)固定在光纖表面,利用生物反應引起的光參數(光強、波長、相位等)變化,對待測物進行檢測。與傳統的電化學生物傳感器相比,光纖生物傳感器具有體積小、結構靈活、抗電磁干擾、耐腐蝕、生物相容性好、靈敏度高、成本低、可實現原位在線以及遠距離監測等優點,尤其適用于對生物活體的體內檢測。
[0004]免標記光纖生物傳感器可直接將生物反應引起的生物分子層有效折射率或厚度的變化轉變為可測光信號,不需要使用標記物,極大地簡化了操作過程,并且不會污染樣本,基本不影響生物分子的活性,安全可靠,可對生物反應過程進行實時、原位及真實的檢測,具有極大的應用價值,近年來受到廣泛關注。
[0005]目前研究較多的免標記光纖生物傳感器有光纖表面等離子體共振傳感器、光纖光柵傳感器、光纖倏逝波傳感器等。然而現有的免標記光纖生物傳感器仍存在諸多問題,包括:光纖表面等離子體共振(SPR)傳感器往往需要在光纖表面進行金屬鍍膜處理,利用識別反應發生時金屬薄膜表面的折射率變化繼而改變表面波的共振角度這一變量來檢測,但SPR生物傳感器制作工藝比較復雜,制備和使用成本高;光纖光柵傳感器利用傳輸光譜的諧振波長變化來檢測,但其普遍存在溫度交叉敏感的問題;光纖倏逝波傳感器需要將光纖進行腐蝕或拉錐處理,機械強度差,易損壞,其光傳輸損耗大,并且檢測光強信號容易受到光源擾動及外界環境因素的干擾,穩定性較差。
[0006]生物傳感檢測領域往往具有自身的特殊性,檢測環境的復雜、待測物的微量低濃度以及對于快速便捷檢測的需求等,對生物傳感器的小型化、穩定可靠、精確靈敏及快速簡便等提出了較高的要求。針對生物傳感檢測,如何開發出適用性強、制備簡單成本低、穩定性高、復用性好、檢測靈敏度高的免標記光纖生物傳感器,仍是本領域技術人員亟待解決的問題。

【發明內容】

[0007]針對現有技術中免標記光纖生物傳感器存在的問題,發明人通過研究,結合光纖傳感器和生物傳感檢測技術,提出一種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針,該生物傳感探針具有結構緊湊、制作簡單、靈敏度高等特點,消除了溫度、光源擾動等對檢測光信號的影響,能夠實現對生物分子的免標記檢測和生物反應的動態實時監測。
[0008]具體的,本發明涉及以下技術方案:
[0009]首先,本發明的目的之一在于提供一種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針,由光纖琺珀干涉結構器件、光纖琺珀干涉結構器件端面的化學修飾層以及固定在化學修飾層上的生物分子敏感膜構成,其中,光纖琺珀干涉結構器件由一段光子晶體光纖熔接兩段普通單模光纖制作而成。
[0010]本發明所述的光纖琺珀干涉結構器件為一種在線型光纖琺珀傳感器結構,即采用一段光子晶體光纖作為一個琺珀干涉腔,利用最簡單的電弧放電光纖熔接方法將該段光子晶體光纖與兩根普通單模光纖熔接起來,并將尾端的單模光纖切至一定長度,形成反射式探針型光纖琺珀傳感器結構。根據菲涅爾反射原理,由于界面兩邊折射率不同,光子晶體光纖與單模光纖的熔接界面以及單模光纖末端端面會形成三個反射面,產生的反射光相互干涉形成琺珀干涉譜。
[0011]優選的技術方案中,所述光子晶體光纖為空芯光子晶體光纖??招竟庾泳w光纖具有特殊的空芯結構,和普通單模光纖纖芯的折射率差較大,根據菲涅爾反射理論,較大的折射率差能提供較大的界面反射率,并且空芯光子晶體光纖的光傳輸損耗較小,從而有利于提高干涉譜的對比度和傳感器的信噪比。此外,空芯光子晶體光纖具有較低的溫度敏感性。所述空心光子晶體光纖的使用,明顯提高了琺珀干涉傳感器檢測的溫度穩定性、分辨率和檢測精度,降低了傳輸損耗。
[0012]所述化學修飾層為涂覆在光纖琺珀干涉儀端面的生物相容性材料,包括水凝膠、聚合電解質、氧化石墨烯等材料,以此作為固定生物分子的基底,有利于提高生物分子固定密度,保持生物分子的活性。發明人通過研究發現,生物相容性材料,如水凝膠、聚合電解質、氧化石墨烯等材料的化學修飾層要明顯優于偶聯反應或自組裝的生物材料(如生物素-蛋白偶聯);水凝膠、聚合電解質、氧化石墨烯等材料的化學修飾層,接觸光纖琺珀干涉結構器件的端面,直接影響反射條紋對比度,通過其可進一步提高本發明所述傳感探針的檢測靈敏度。
[0013]所述生物分子敏感膜為具有特異性識別功能的生物分子,能夠和待測物發生特異性結合??蓸嫵擅舾心さ纳锓肿影?、抗原、抗體、核酸、病原體等,具體根據待測物的特性而決定。
[0014]其次,本發明的另一目的在于提供上述基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針的制備方法,包括以下步驟:
[0015](I)選擇一根普通單模光纖,使用切割刀對普通單模光纖的一端進行切割;
[0016](2)選擇一根空芯光子晶體光纖,使用切割刀對其一端進行切割,之后使用熔接機將切割好的空芯光子晶體光纖和上述步驟(I)切割好的普通單模光纖進行熔接。為避免熔接點附近空芯光子晶體光纖空氣孔的熔融塌陷,選用手動熔接方式,設置合適的熔接參數,采用較低的熔接強度和較短的放電時間;
[0017](3)使用切割刀切去多余的空芯光子晶體光纖,保留預先設計的長度,一般保留長度為幾十微米較為合適,切割操作可在顯微鏡下進行;
[0018](4)選擇另一根普通單模光纖,型號與上述步驟(I)所選普通單模光纖相同,使用切割刀對其一端進行切割,之后與上述步驟(3)切割的光子晶體光纖端面進行熔接,熔接參數與上述步驟(2)所使用的參數相同;
[0019](5)使用切割刀切去多余的上述步驟(4)熔接的普通單模光纖,保留預先設計的長度,一般保留長度為空芯光子晶體光纖長度的十倍左右(幾百微米)較為合適;至此光纖琺珀干涉結構器件的制作部分完成;
[0020](6)使用常規光纖表面清潔處理方法對光纖琺珀干涉結構器件的端面進行清潔,之后對光纖琺珀干涉儀端面進行生物相容性材料的涂覆,使其端面形成化學修飾層;
[0021](7)將處理后的光纖琺珀干涉結構器件浸入到一定濃度的生物分子溶液中,使生物分子吸附固定在光纖琺珀干涉結構器件端面的化學修飾層上,形成生物分子敏感膜,固定時間與環境和溶液濃度有關,達到飽和吸附為止,之后取出使用磷酸鹽緩沖液進行清洗,去掉多余的未固定的生物分子,即得到基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針。
[0022]優選的,所述步驟(1)-(5)中,切割普通單模光纖和空芯光子晶體光纖的切割刀均為普通光纖切割刀。
[0023]所述步驟(2)、(4)中,熔接機為普通電弧放電熔接機。
[0024]所述步驟(6)中,常規光纖表面清潔方法包括使用酒精和去離子水清洗等。
[0025]所述步驟(6)中,光纖琺珀干涉結構器件端面化學修飾層的生物相容性材料包括水凝膠、聚合電解質、氧化石墨烯等,具體涂覆方法根據所選材料而定。
[0026]所述步驟(7)中,固定在光纖琺珀干涉儀端面的生物分子為具有特異性識別功能的生物分子,包括酶、抗原、抗體、核酸、病原體等,具體根據待測物而定。
[0027]所述步驟(7)中,在生物分子固定完成之后,通常還要使用無關的、不干擾生物反應的小蛋白分子(如小牛血清蛋白)封閉殘存的結合位點,有利于穩定固定的生物分子并抑制非特異性吸收。
[0028]進一步的,本發明還提供一種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感器系統,包括光源、光譜儀、光纖耦合器,以及上述的基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針。
[0029]此外,利用上述基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針或傳感系統進行生物物質檢測的方法,也是本發明的目的之一。
[0030]本發明所述基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針檢測的原理為:在對待測物進行檢測時,將探針浸入到待測物溶液中,待測物與探針上的生物分子發生特異性結合,弓丨起生物分子敏感層的有效折射率及厚度變化,光纖琺珀干涉結構器件能夠感知外界折射率及厚度的變化,并將其最終轉變為干涉譜的變化。
[0031]根據菲涅爾反射原理可知,由于普通單模光纖的纖芯折射率(nSMF)與空芯光子晶體光纖的纖芯折射率(Mcpcf)不同,會在兩種光纖的熔接界面處會產生菲涅爾反射,其光強反射率為[(nSMFUHCPCF)/(nSMF+nHCPCF) ]2;同樣,由于普通單模光纖的纖芯折射率(nSMF)與外界折射率(IlEX)不同,會在光纖末端端面產生菲涅爾反射,其光強反射率為[(nSMF-ΠΕΧ)/(n SMF+ηΕΧ)]2。普通單模光纖與空芯光子晶體光纖的兩個熔接界面,以及普通單模光纖末端端面的反射光發生干涉,形成干涉條紋。其中,末端端面光強反射率和外界折射率有關,當外界折射率發生變化時,其光強反射率發生變化。根據琺珀干涉原理可知,干涉光束光強的變化會引起干涉條紋對比度發生變化,此外,由生物分子敏感層厚度變化引起的干涉光束光程差的變化會改變干涉條紋的相位。因此,通過光纖琺珀干涉傳感系統測得干涉條紋的變化,即可對待測物及生物反應過程進行檢測?;诂m珀干涉的免標記光纖生物傳感探針,其干涉譜信號對外界溫度變化和光源擾動等因素不敏感,因此信號穩定。此外,待測物與生物分子敏感層可通過解離液進行解離,光纖生物傳感探針可重復使用。
[0032]本發明取得了以下有益效果:
[0033](I)本發明提供了一種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針,采用全光纖探針式結構,具有體積小、結構靈活、抗電磁干擾、耐腐蝕、靈敏度高等優點,所需樣本量少,可實現對待測物的原位在線及遠距離檢測;
[0034](2)生物分子在光纖表面的固定是影響光纖生物傳感器性能的關鍵,直接固定在光纖表面的生物分子活性較低,本發明通過生物相容性材料的化學修飾,并篩選使用合適材料,可以很好地保持生物分子的活性,提高固定密度,從而改善傳感器性能;
[0035](3)本發明采用免標記生物檢測方式,不需要加入標記物,極大地簡化了操作過程,不會污染樣本,基本不影響生物分子的活性,安全可靠,可實現對生物反應的動態真實檢測;
[0036](4)本發明采用光纖琺珀干涉儀,結構緊湊,機械強度高,重復利用性好,而且對溫度和光源擾動等不敏感,穩定性好;
[0037](5)本發明提出的基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針,制作簡單,不需要特殊的工藝設備,成本低。
【附圖說明】
[0038]圖1是一種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針示意圖;
[0039]圖2是使用本探針進行檢測時,待測物與探針上的生物分子發生特異性結合的示意圖。
[0040]圖中:I為普通單模光纖,2為空芯光子晶體光纖,3為化學修飾層,4為生物分子敏感層,5為待測物。
【具體實施方式】
:
[0041]下面以層層自組裝聚合電解質膜(PAH/PSS)2Q作為化學修飾層,固定羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)作為生物分子敏感層,檢測兔IgG為例,結合附圖對本發明作進一步說明。
[0042]—種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針,由光纖琺珀干涉結構器件、光纖琺珀干涉結構器件端面的化學修飾層3以及固定在化學修飾層上的生物分子敏感膜4構成。其中,光纖琺珀干涉結構器件由普通單模光纖I和空芯光子晶體光纖2制作而成。
[0043]其中,普通單模光纖I的包層直徑為125μπι,纖芯直徑為9μπι,纖芯折射率約為1.4682;空芯光子晶體光纖2的型號為!1(:19-1550,其包層直徑為1154111,纖芯直徑為2(^111,纖芯折射率為I;化學修飾層3為通過靜電層層自組裝技術涂覆在光纖端面的聚合電解質膜,聚合電解質材料為聚丙烯胺鹽酸鹽(PAH)和聚苯乙烯磺酸鈉(PSS);生物分子敏感膜4為固定在化學修飾層上的羊抗兔IgG。
[0044]—種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針,其制備方法包括以下步驟:
[0045](I)選擇一根普通單模光纖I,使用切割刀對普通單模光纖I的一端進行切割;
[0046](2)選擇一根空芯光子晶體光纖2,使用切割刀對其一端進行切割,之后使用熔接機將切割好的空芯光子晶體光纖2和上述步驟(I)切割好的普通單模光纖I進行熔接。為避免熔接點附近空芯光子晶體光纖空氣孔的熔融塌陷,選用手動熔接方式,設置合適的熔接參數,采用較低的熔接強度和較短的放電時間;
[0047](3)使用切割刀切去多余的空芯光子晶體光纖2,保留長度約50μπι,切割操作可在顯微鏡下進行;
[0048](4)選擇另一根普通單模光纖I,型號與上述步驟(I)所選普通單模光纖I相同,使用切割刀對其一端進行切割,之后與上述步驟(3)切割的光子晶體光纖2端面進行熔接,熔接參數與上述步驟(2)所使用的參數相同;
[0049](5)使用切割刀切去多余的上述步驟(4)熔接的普通單模光纖I,保留長度600μπι,至此光纖琺珀干涉結構器件的制作部分完成;
[0050](6)使用酒精和去離子水對光纖琺珀干涉結構器件的端面進行清潔;
[0051 ] (7)將清潔好的光纖琺珀干涉結構器件端面浸入Piranha溶液中30分鐘,之后用去離子水充分清洗,室溫下用氮氣吹干;
[0052 ] 其中,P iranha溶液為98 %濃H2 SO4:30% H2O2 = 7:3(體積比)的混合物。
[0053](8)將上述處理好的光纖琺珀干涉結構器件端面交替浸入聚合電解質PAH溶液和PSS溶液中各5分鐘,進行層層自組裝,每次取出后都要用去離子水清洗,氮氣吹干,最終完成(PAH/PSS) 2Q化學修飾層3的涂覆;
[0054](9)將上述處理好的光纖琺珀干涉結構器件端面浸入到0.05mg/ml的羊抗兔IgG溶液中,在37°C下反應I小時,使生物分子吸附固定在光纖琺珀干涉結構器件端面的化學修飾層3上,形成生物分子敏感膜4,之后取出使用磷酸鹽緩沖液進行清洗,去掉多余的未固定的生物分子;
[0055](10)將上述處理好的端面浸入2mg/ml的牛血清蛋白(BSA)溶液中,在37°C下反應30分鐘,目的是封閉殘存的結合位點,穩定固定的生物分子并抑制非特異性吸收。最后用磷酸鹽緩沖液進行清洗,即得到基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針。
[0056]上述步驟(1)-(5)中,切割普通單模光纖和空芯光子晶體光纖的切割刀均為普通光纖切割刀。
[0057]上述步驟(2)、(4)中,熔接機為普通電弧放電熔接機。
[0058]上述步驟(7)、(8)中,操作均在室溫下進行。
[0059]—種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針,在對待測物5兔IgG進行檢測時,將探針浸入到一定濃度的兔IgG溶液中,室溫下充分反應一段時間后,用磷酸鹽緩沖液洗去未結合的兔IgG。待測物5兔IgG與探針上的羊抗兔IgG發生特異性結合,引起生物分子敏感層4的有效折射率及厚度變化。通過光纖琺珀干涉傳感系統測得干涉譜的變化,即可對待測物5兔IgG及生物反應過程進行檢測。待測物5兔IgG與生物分子敏感層4可通過解離液進行解離再生,光纖生物傳感探針可重復使用。
[0060]本發明所述傳感器的非本征型光纖法布里-珀羅的反射譜,其干涉條紋的對比度較高,達到12dB左右,經檢測,傳感器對于IgG的檢測限可達0.02Uimol/L。通過干擾試驗檢測,本發明所述傳感器與雜蛋白無特異性結合,具有較強的抗干擾能力和良好的溫度穩定性。[0061 ]其中,解離液通常為強酸緩沖液、強堿緩沖液或高鹽溶液,較為常見的如二乙胺水溶液(0.051,?!1=11.5),617-!1(:1解離液(0.謂,?!1=2.3)等。
[0062]上述雖然結合附圖對本發明的【具體實施方式】進行了描述,但并非對本發明保護范圍的限制,所屬領域技術人員應該明白,在本發明的技術方案的基礎上,本領域技術人員不需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護范圍以內。
【主權項】
1.一種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針,其特征在于,由光纖琺珀干涉結構器件、光纖琺珀干涉結構器件端面的化學修飾層以及固定在化學修飾層上的生物分子敏感膜構成,其中,光纖琺珀干涉結構器件由一段光子晶體光纖熔接兩段普通單模光纖制作而成。2.根據權利要求1所述的免標記光纖生物傳感探針,其特征在于,所述光子晶體光纖為空芯光子晶體光纖。3.根據權利要求1或2所述的免標記光纖生物傳感探針,其特征在于,所述化學修飾層為涂覆在光纖琺珀干涉儀端面的生物相容性材料,優選的,選自水凝膠、聚合電解質、氧化石墨稀材料。4.根據權利要求1或2所述的免標記光纖生物傳感探針,其特征在于,所述生物分子敏感膜為具有特異性識別功能的生物分子,能夠和待測物發生特異性結合,生物分子選自酶、抗原、抗體、核酸、病原體中的一種。5.權利要求1-4任一項所述的免標記光纖生物傳感探針的制備方法,包括以下步驟: (1)選擇一根普通單模光纖,使用切割刀對普通單模光纖的一端進行切割; (2)選擇一根光子晶體光纖,使用切割刀對其一端進行切割,之后使用熔接機將切割好的光子晶體光纖和上述步驟(I)切割好的普通單模光纖進行熔接; (3)使用切割刀切去多余的空芯光子晶體光纖,保留預先設計的長度; (4)選擇另一根普通單模光纖,型號與上述步驟(I)所選普通單模光纖相同,使用切割刀對其一端進行切割,之后與上述步驟(3)切割的光子晶體光纖端面進行熔接,熔接參數與上述步驟(2)所使用的參數相同; (5)使用切割刀切去多余的上述步驟(4)熔接的普通單模光纖,保留預先設計的長度,形成光纖琺珀干涉結構器件; (6)使用常規光纖表面清潔處理方法對光纖琺珀干涉結構器件的端面進行清潔,之后對光纖琺珀干涉結構器件端面進行生物相容性材料的涂覆,使其端面形成化學修飾層; (7)將步驟(6)處理后的光纖琺珀干涉結構器件浸入到一定濃度的生物分子溶液中,使生物分子吸附固定在光纖琺珀干涉結構器件端面的化學修飾層上,形成生物分子敏感膜,之后取出使用磷酸鹽緩沖液進行清洗,去掉多余的未固定的生物分子,即得到基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針。6.根據權利要求5所述的免標記光纖生物傳感探針的制備方法,其特征在于,所述步驟(1)-(5)中,切割普通單模光纖和空芯光子晶體光纖的切割刀均為普通光纖切割刀;所述步驟(2)、(4)中,熔接機為普通電弧放電熔接機。7.根據權利要求5所述的免標記光纖生物傳感探針的制備方法,其特征在于,所述步驟(6)中,常規光纖表面清潔方法包括使用酒精和去離子水清洗; 所述步驟(6)中,光纖琺珀干涉結構器件端面化學修飾層的生物相容性材料選自水凝膠、聚合電解質、氧化石墨烯中的一種。8.根據權利要求5所述的免標記光纖生物傳感探針的制備方法,其特征在于,所述步驟(7)中,固定在光纖琺珀干涉儀端面的生物分子為具有特異性識別功能的生物分子,選自酶、抗原、抗體、核酸、病原體中的一種; 所述步驟(7)中,在生物分子固定完成之后,使用無關的、不干擾生物反應的小蛋白分子封閉殘存的結合位點。9.一種基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感器系統,包括光源、光譜儀、光纖耦合器,以及權利要求1-4任一項所述的基于琺珀干涉的免標記光纖生物傳感探針。10.權利要求1-4任一項所述的免標記光纖生物傳感探針或權利要求9所述傳感系統在生物物質檢測中的應用。
【文檔編號】G01N21/45GK105891155SQ201610218447
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月8日
【發明人】姜明順, 劉曉慧, 張雷, 張法業, 隋青美
【申請人】山東大學
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