食品中致病菌檢測的巨磁阻抗效應生物傳感器的制造方法

文檔序號:8297951
食品中致病菌檢測的巨磁阻抗效應生物傳感器的制造方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種食品中致病菌檢測的巨磁阻抗效應生物傳感器,屬于食品中致病 菌的檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 微生物的快速檢測對臨床檢驗、食品安全以及環境監測都是至關重要的。據WHO 估計,全世界每年發生食源性疾病數十億人,每年約有二百萬兒童死于腹瀉.其中66%以 上是由致病菌所致。食品中致病菌一般包括沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結 腸炎耶爾森氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸桿菌〇157:H7、副溶 血性弧菌、霍亂弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌等,其中以沙門氏菌、大腸桿菌0157 :H7、李斯特 氏菌、副溶血弧菌等引起的食源性疾病尤為突出。因此,建立對食品中不同致病菌的快速、 準確、特異性強、簡便的檢測方法,對保障食品安全十分必要。
[0003] 目前食品衛生中常規的微生物檢測方法是增菌培養、平板計數法,由于其檢測周 期長、工作量大、容易造成誤差、漏檢率高、程序復雜等缺點已遠遠不能滿足現代檢測要求。 隨著現代科學技術的不斷發展和分子細菌學研宄的開展,特別是免疫學、生物化學、分子生 物學的不斷發展,出現了一些較為先進的、快速的檢測方法,如聚合酶鏈反應(PCR)、多重 PCR、熒光PCR、免疫學檢測、質譜測定、DNA探針法等檢測方法,但是大都普遍存在儀器成本 昂貴、操作復雜等缺點,不易在實際應用中普及和現場快速檢測和診斷。
[0004] 生物傳感器是近幾十年來發展起來的一種新的傳感器技術,它是利用生物活性材 料(酶、蛋白質、DNA、抗體、抗原、生物膜等)與物理化學換能器(電化學、光學、機械、熱、 電、磁等)有機結合構成的一種生物信息檢測分析工具。生物傳感器由于其獨特的優勢, 如能在渾濁溶液中操作、選擇性好、靈敏度高等,其所測的信號通常是電信號的變化,可以 直接測量,便于儀器自動化、小型化和智能化。然而傳統的生物傳感器的分析操作步驟太 多、分析周期長、價格昂貴、體積大、昂貴的光學檢測設備及需要訓練有素的專業人員才能 完成等。近年來,由于免疫磁珠技術的不斷進展和微傳感器技術的發展,科學家們提出了 將微納磁傳感器并結合磁性標簽研制用于生物學、醫學、遺傳學、毒物學等生物信息探測 的新型生物傳感器。利用磁傳感器并結合磁性標簽用于探測生物分子的理念最早是由美 國海軍實驗室的Baselt等[BaseltD.R.,LeeG.U.,NatesanM.,MetzgerS.W.,Sheehan P.E.,ColtonR. ,Abiosensorbasedonmagnetoresistancetechnology,Biosens. Bioelectr. 17(1998)731.]于1998年提出的,由此開啟了磁生物傳感器研宄的熱潮。
[0005]經對現有技術的文獻檢索發現,Kurlyandskaya等(Kurlyandskaya G. V.,Sanchez M.L.,Hernando B.)在《Appl.Phys.Lett.》(美國應用物理快報)《Vol.82,pp.3〇53,2〇〇3》 首次提出使用巨磁阻抗效應傳感器來探測磁性納米粒子,并利用CoFeMoSiB非晶帶材制 備了探測裝置,成功實現了對商業FerroHuicf液體中磁性納米粒子以及Dynabeads1 M-450磁珠的探測。2007年,Kurlyandskaya等(A. Kumar, S. Mohapatra, V. F. Miyar, A. Cerdeira,J.A. Garcia, H. Srikanth,J.Gass and G. V. Kurlyandskaya)在〈〈Appl. Phys. Lett.》(美國應用物理快報)《Vol. 91,pp. 143902, 2007》報道了利用巨磁阻抗效應傳感器 對吞噬Fe304納米粒子的人體胚腎細胞(HEK293)進行檢測,證明了巨磁阻抗效應在生物醫 學檢測領域的可行性,但該研宄工作只是得到了巨磁阻抗效應傳感器對Fe304磁性納米粒 子的響應,沒有實現對細胞樣品的標記和分型檢測。
[0006] 隨著微機電系統(MEMS)技術的發展,利用MEMS技術制備的微流控芯片已應用于 生物與醫學檢測領域,而MEMS技術同樣可用來制造小型化、集成化的巨磁阻抗效應傳感 器。將生物信息的固定與小型化巨磁阻抗效應傳感器相結合構建新型致病菌檢測系統,利 用磁性標簽對致病菌進行檢測,具有重要的研宄意義和臨床價值。通過文獻和專利檢索,沒 有發現關于將巨磁阻抗效應傳感器用于致病菌檢測的相關研宄成果。
[0007] 中國專利申請號為201210397978. 7,公開號102937649A,該專利公開了一種血清 腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器,包括微型化磁通門傳感器、生物芯片、施加軸 向磁場的螺線管線圈、以及與微型化磁通門傳感器連接的信號采集系統,其中:所述生物芯 片位于微型化磁通門傳感器的敏感軸上,所述生物芯片由位于玻璃基片上的Au膜、位于Au 膜上的生物敏感膜、位于生物敏感膜上的磁性標簽組成。但是該發明專利只是針對血清腫 瘤標志物進行檢測,無法實現對致病菌的檢測。

【發明內容】

[0008] 針對現有技術中的缺陷,本發明的目的是提供一種食品中致病菌檢測的巨磁阻抗 效應生物傳感器。該巨磁阻抗效應傳感器芯片采用MEMS加工工藝制作,與致病菌捕獲芯片 配套使用,與配套的檢測電路一起可實現整個系統的小型化,對致病菌的檢測,具有檢測芯 片面積大,檢測靈敏度高,不需要對生物樣本進行增菌培養和PCR擴增,可以直接檢測液體 食品中的致病菌,其檢測靈敏度為l〇-l〇〇CFU/ml。
[0009] 為了實現上述目的,本發明所述食品中致病菌檢測的巨磁阻抗效應生物傳感器包 括巨磁阻抗效應傳感器芯片、致病菌捕獲芯片、施加軸向磁場的磁芯螺線管線圈、以及與 巨磁阻抗效應傳感器連接的信號采集系統,其中:所述致病菌捕獲芯片由玻璃基片上的Au 膜、Au膜上修飾了一層生物敏感膜、生物敏感膜固定了致病菌單克隆抗體,致病菌單克隆抗 體捕獲帶有磁性標簽的致病菌,致病菌與生物素修飾的致病菌單克隆抗體結合,致病菌通 過生物素與親和素作用與磁性標簽相連,磁性標簽為鏈酶親和素修飾的磁性納米粒子或由 其構成的磁珠,采用磁分離技術對帶有磁性標簽的致病菌進行富集和分離。
[0010] 優選地,上述的巨磁阻抗效應傳感器芯片由位于玻璃基片上的F/Cu/F(F=軟磁 薄膜)多層膜構成,Cu膜寬度小于軟磁薄膜F的寬度,傳感器外形呈曲折形結構,并采用 MEMS工藝制作,其中軟磁薄膜F為NiFe薄膜或CoZrNb薄膜或CoFeSiB薄膜等。
[0011] 優選地,所述的致病菌捕獲芯片上的Au膜為濺射的Cr/Au薄膜,用于修飾生物敏 感膜;所述的生物敏感膜可以連接各種致病菌單克隆抗體,致病菌單克隆抗體可以和被檢 測的致病菌結合。致病菌與生物素修飾的致病菌單克隆抗體結合,致病菌通過生物素與親 和素作用與磁性標簽相連,磁性標簽為鏈酶親和素修飾的磁性納米粒子或由其構成的磁 珠,采用磁分離技術對致病菌進行富集和分離。
[0012] 優選地,所述施加軸向磁場的磁芯螺線管線圈為一繞制在PVC上的小型化磁芯螺 線管線圈,通過外接的直流電源產生軸向均勻磁場,磁場高達l〇〇〇e,而空心的螺線管是無 法達到的;巨磁阻抗效應傳感器的敏感軸放置在磁芯螺線管線圈的軸向位置上,致病菌捕 獲芯片位于巨磁阻抗效應傳感器芯片的上方,間距不超過100ym。
[0013] 優選地,所述生物敏感膜連接各種致病菌單克隆抗體,致病菌單克隆抗體捕獲被 檢測的帶有磁性標簽的致病菌。
[0014] 優選地,所述的信號采集系統為HP4294A或E4991A阻抗分析儀或采用信號發生 器、交流恒流源、鎖相放大原理等構成的信號采集系統,可測量磁性標簽引起的阻抗大小 或電壓信號與檢測致病菌之間的關系。
[0015] 磁分離技術是以納米或微粒級的磁性顆粒為載體,利用結合于磁性顆粒表面修 飾的蛋白質所提供的蛋白-蛋白之間的特異親和特性,在施加磁場的裝置控制下,通過免 疫親和吸附、清洗、解吸操作,從復雜的生物樣本中分離得到目標生物分子,具有磁性分離 簡單方便、親和吸附高特異性及高敏感性等眾多優點。本發明采用磁分離技術利用磁性標 簽對致病菌進行富集和分離,其具體操作過程殘見實施例。
[0016] 與現有技術相比,本發明具有如下的有益效果:
[0017] (1)本發明采用巨磁阻抗效應傳感器檢測致病菌,芯片采用MEMS技術制作,具有 較大的傳感器芯片面積,傳感器具有高的磁場檢測靈敏度;
[0018] (2)致病菌捕獲芯片采用MEMS技術設計制作,致病菌捕獲芯片表面上的Au膜修飾 了生物敏感膜,生物敏感膜固定了致病菌單克隆抗體,致病菌單克隆抗體可以捕獲致病菌; 采用磁分離技術對致病菌進行富集和分離,不需要對生物樣品進行增菌培養和PCR擴增, 致病菌與生物素修飾的致病菌單克隆抗體結合,致病菌通過生物素與親和素作用與磁性標 簽相連,磁性標簽為鏈酶親和素修飾的磁性納米粒子或由其構成的磁珠。采用磁分離技術 將帶有磁性標簽的致病菌從生物樣本中分離出來,大大縮短了檢測時間;
[0019] (3)生物樣品本身不帶磁性,能提供一個很低噪聲的磁測量環境,相對于熒光分 子、放射性同位元素、酶等標簽,磁性標簽非常穩定;
[0020] (4)本發明中的食品中致病菌檢測系統具有檢測速度快、可重復使用、無特殊環境 和存放要求、體積小、靈敏度高等優點,缺點是不能對固體樣品中的致病菌直接進行檢測; 本發明的巨磁阻抗效應傳感器不需要依賴于操作人員的生物學醫學經驗以及龐雜、昂貴的 熒光檢測設備,就可實現特定的生化分析或致病菌檢測,這將有利于實現便攜式、成本低 廉、快速診
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