一種雙通道輸出檢測食源性致病菌的適體傳感器的制備方法及其應用與流程

文檔序號:18178607發布日期:2019-07-13 10:33
一種雙通道輸出檢測食源性致病菌的適體傳感器的制備方法及其應用與流程

本發明涉及一種適體傳感器,尤其是涉及一種雙通道輸出檢測食源性致病菌的適體傳感器的制備方法及其應用。



背景技術:

食源性致病菌是指可以引起食物中毒或以食品為傳播媒介的致病性細菌。食品在采集、加工、運輸等環節中很容易受到食源性致病菌的污染,因之而起的食物中毒和疾病爆發事件頻頻發生,我國每年因食源性致病菌造成的經濟損失高達170億美元。常見的食源性致病菌有:副溶血性弧菌、創傷弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等。

現有的用于檢測食源性致病菌的各種方法,如:酶聯免疫、DNA探針和環介導等溫擴增法等,這些方法大多因為步驟繁瑣存在耗時長的問題。為了有效地縮短分析時間,提高檢測效率,聚合酶鏈式反應(PCR)得到發展,通過檢測食源性致病菌的特定基因來達到分析目的。但是在實際應用中,PCR方法對設備和操作要求較高,很大程度上限制了它的進一步發展。電化學發光(ECL)和差分脈沖伏安法(DPV)具有簡單、快速、高靈敏度、易于使用、高可控性和低背景信號等顯著特征,已廣泛應用于生物分析。然而采用單一方法的檢測結果容易出現假陽性或假陰性,造成不必要的麻煩。因此,開發一種基于ECL和DPV兩種方法同時檢測一種目標物的免疫傳感器至關重要。

目前,大多數的免疫傳感器都是基于抗體-抗原的免疫反應,然而,這些免疫檢測嚴重依賴于所用抗體的質量,通過動物免疫制備抗體是耗時的(幾個月),并且抗體可能變得易受穩定性或修飾問題的影響。為了解決抗體的這些缺陷,具有高效率和選擇性的適體開始出現。適體是短的單鏈DNA或RNA分子,通過體外選擇或通過指數富集(SELEX)系統進化配體來選擇。適體比抗體具有許多競爭優勢,適體可以通過化學合成常規生產,具有純度高、成本低的優點。適體可以用各種化學標簽進行靈活修飾,這些標簽不會影響它的效果。此外,適體的分子量小,穩定性優異,并且可以承受重復的變性和復性??傊?,這些獨特的特性使適體成為生物傳感器的理想識別元件。目前,國內外還沒有公開任何關于法拉第籠式ECL和DPV雙通道輸出檢測食源性致病菌適體傳感器的制備方法及其應用。



技術實現要素:

本發明所要解決的技術問題是提供一種高靈敏度、高精確性以及操作簡單快速的雙通道輸出檢測食源性致病菌的適體傳感器的制備方法及其應用。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種雙通道輸出檢測食源性致病菌的適體傳感器的制備方法,包括以下步驟:

(1)發光功能化Ru-MOF的合成

將18 mg的[Ru(dcbpy)3]2+溶解在10 mL的正丙醇(NPA)和去離子水的混合溶液中;然后,將54 mg的Zn(NO3)2溶解在以上制備的溶液中并超聲處理1小時后,在室溫下反應24小時,于8000 rpm,4℃溫度下離心5 min獲得所得的復合物,并用去離子水洗滌三次得到發光功能化Ru-MOF納米顆粒產物,最后將產物分散在去離子水中;其中正丙醇和去離子水混合溶液中正丙醇和去離子水體積比為3:1;

(2)信號單元[email protected]2+-Apt2的合成

將1.5 mL 2.0 mg/mL Ru-MOF納米顆粒分散在3 mL 10 mM Pb(NO3)2溶液中,并在室溫下反應24小時,于12000 rpm離心5分鐘后,將得到的沉淀用去離子水洗滌三次得到[email protected]2+復合物,然后取200μL 100 μg/mL [email protected]2+復合物和400 μL EDC/NHS復合物于玻璃瓶中,混合均勻后,采用1.0 mol/L HCl溶液調溶液pH為5,震蕩孵育1 h,于8000 r離心15 min,去離子水洗滌3次,去除偶聯試劑;向玻璃瓶內加入50 μL 10 μmol/L的第二適體Apt2,混合均勻后采用1.0 mol/L NaOH溶液調溶液pH為9,震蕩孵育4小時,于8000 rpm離心15 min,去離子水洗三次,洗滌至中性,取出上清液,將沉淀分散在50 μL DNA雜交緩沖溶液中即得到信號單元[email protected]2+-Apt2溶液;

(3)雙通道適配體傳感器的制備

A.將直徑為3 mm的金電極依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3拋光粉在麂皮上拋光至鏡面,用水沖洗干凈,再依次在乙醇、水中超聲洗滌,清洗后的電極放入由濃H2SO4和H2O2按體積比7:3混合成的混合溶液中浸泡5~10 min,取出洗凈,然后在0.5 mol/L硫酸溶液中用循環伏安掃描處理,掃描速度為50 mV/s,電壓范圍為0~1.6 V,持續掃描得到穩定的循環伏安圖后,取出用水洗凈待用;

B.在上述處理好的金電極上滴入10 μL 第一適體Apt1,于37℃條件下孵育16 h,隨后加入10μL 2 mM 6-巰基-1-己醇,以封閉金電極表面非特異性活性位點,37℃條件下繼續孵育1 h,用去離子水洗滌,洗掉未結合的6-巰基-1-己醇;接著將10 μL 食源性致病菌目標物溶液滴涂在上述修飾有Apt1的金電極上,37℃條件下扣帽孵育1 h,使Apt1和食源性致病菌充分反應,隨后用去離子水充分洗滌除去多余的食源性致病菌;向反應區域滴加10 μL 上述步驟(2)制備的信號單元[email protected]2+-Apt2溶液,在37℃條件下靜置60 min,利用食源性致病菌和Apt2的特異性結合,將[email protected]2+引入到整個傳感器中分別作為電化學發光和電化學的信號物,反應完成后用去離子水洗滌2~3次,除去未被食源性致病菌捕獲的信號單元[email protected]2+-Apt2,即制備得到雙通道輸出檢測食源性致病菌的適體傳感器。

所述的食源性致病菌包括副溶血弧菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。

所述的副溶血弧菌的第一適體Apt1的序列為:5′-SH-TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT-3′,第二適體Apt2的序列為5′-NH2-TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT-3′。

所述的沙門氏菌第一適體Apt1的序列為:5′- SH-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3′,第二適體Apt2的序列為5′- NH2-SH-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3′。

所述的金黃色葡萄球菌第一適體Apt1的序列為:5'-SH-TCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATC CCACAGCTACGTC- 3',第二適體Apt2的序列為:5'- NH2-TCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATC CCACAGCTACGTC- 3。

步驟(2)中所述的EDC/NHS復合物中EDC濃度為100 mg/mL、NHS濃度為10 mg/mL。

上述雙通道輸出檢測食源性致病菌的適體傳感器檢測食源性致病菌的方法,包括以下步驟:

(1)ECL法檢測食源性致病菌:將制備好的雙通道輸出檢測食源性致病菌的適體傳感器作為工作電極,Ag/AgCl電極作為參比電極,鉑絲電極作為對電極,組成三電極體系放在電化學發光測試中進行測試,根據食源性致病菌不同濃度下對應的電化學發光強度值得到電化學發光法的工作曲線,從而對待測溶液中食源性致病菌濃度進行定量檢測;當加入的食源性致病菌濃度越高,其捕獲的信號單元越多,被負載的Ru-MOF含量越多,而Ru-MOF本身具有電化學發光,因此電化學發光強度也越大;

(2)DPV法檢測食源性致病菌:DPV的測試液為pH=4.5的HAc-NaAc緩沖溶液,電壓范圍0.3V~0.8V,掃速為0.1 V/s,根據食源性致病菌不同濃度下的電流值得到差分脈沖伏安法的工作曲線,從而對待測溶液中食源性致病菌濃度進行定量檢測。檢測原理同ECL法:當加入的食源性致病菌濃度越高,其捕獲的信號單元越多,被負載的[email protected]2+含量越多,而Ru-MOF具有大的比表面積,吸附的Pb2+含量也會越多,電化學還原電流強度越大,

步驟(1)中電化學發光測試采用計時電流法作為激發信號,電壓范圍0~1.5V,脈沖寬度為0.25s,脈沖周期為30s,微弱發光儀的光電倍增管的高壓值800V。

發明原理:本發明利用法拉第籠式結構,結合超大比表面積的納米材料Ru-MOF,構建了一種檢測食源性致病菌的ECL/DPV雙通道輸出適體傳感器。將食源性致病菌的適體Apt1標記在活化后的金電極表面,作為捕獲單元,通過Au-S鍵固載在金電極上的捕獲單元適體Apt1具有特異性捕獲食源性致病菌的功能;食源性致病菌的適體Apt2標記在[email protected]2+上作為傳感器的信號單元,信號單元中的適體Apt2可以通過適配體特異性結合,被食源性致病菌捕獲,從而使[email protected]2+信號標簽成功地負載在傳感器上。[email protected]2+不僅可以自身產生很強的電化學發光信號,還可以作為DPV的信號標簽,并且Ru-MOF具有較大的比表面積,可以吸附更多Pb2+,使DPV信號強度更明顯,得益于法拉第籠式的分析模式,二維納米材料像一張網一樣搭接到電極表面,使所有的信號標簽都能有效,進一步提高了兩種方法的靈敏度。當食源性致病菌不存在時,信號單元[email protected]2+-Apt2無法被連接到電極表面;當體系中存在食源性致病菌時,Apt2可以利用核酸適配體的特異性結合被食源性致病菌捕獲,調整食源性致病菌的用量大小,可以實現[email protected]2+負載量大小的調控,由此控制電化學發光的強度大小和電流信號的強弱。電化學發光強度及電流強度與食源性致病菌濃度呈現一定的關系,在特定的工作曲線下,可以實現樣品中食源性致病菌的未知濃度的檢驗。

與現有技術相比,本發明的優點在于:

(1)DPV法提高靈敏度:Ru-MOF是一種二維納米材料,具有更大的比表面積,可以吸附更多的信號標記物Pb2+,使電流信號強度增強,進而在一定程度上降低其檢測限。

(2)ECL測試步驟簡單、提高靈敏度:Ru-MOF本身可以產生電化學發光信號,不用額外標記發光體,進一步簡化了操作步驟,并且ECL本身就是一種非常靈敏的分析方法,利用法拉第籠模式,可以有效地拓寬電極的外亥姆霍茲層(OHP),使信號單元中的所有電化學發光體都可以參與電極反應,信號單元成為電極表面的一部分,從而大大提高了檢測靈敏度。

(3)雙通道輸出避免假陽性出現:通過海水的加標回收實驗,驗證雙通道免疫傳感器的可行性??梢园l現ECL法檢測VP的回收率在92.8%~109.6%之間,相對標準偏差為 4.8%~8.3%,DPV法檢測VP的回收率在93.5%~110.2%之間,相對標準偏差為 4.9%~8.6%,證明兩者單獨檢測的準確性較好;利用t檢驗進行ECL和DPV兩種方法的顯著性差異的比較,所得P值0.12大于0.05,證明兩種方法之間不存在顯著性差異,也就是可以實現相互佐證檢驗VP的目的,有效地避免假陽性的出現。

綜上所述,本發明首次制備了一種ECL和DPV雙通道輸出檢測食源性致病菌傳感器的制備方法及其應用,該傳感器中[email protected]2+不僅能夠產生電化學發光,而且還能作為DPV還原的信號物。利用兩種方法的雙通道適體傳感器檢測食源性致病菌,檢測結果的相互佐證可以有效地避免假陽性的出現,達到精確檢測食源性致病菌的目的,因而具有高靈敏度、簡單、快速、易于操作、實驗成本低等優點,可以實現對超低濃度食源性致病菌的檢測,具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1為本發明ECL和DPV雙通道輸出檢測VP傳感器的制備流程和檢測原理圖;

圖2為電化學發光法ECL檢測不同VP濃度下的電化學發光強度值關系圖;

圖3為不同VP濃度與電化學發光強度的線性關系圖;

圖4為DPV檢測不同VP濃度下的電流強度關系圖;

圖5為不同VP濃度與電流強度線性關系圖((a) 5 CFU/mL, (b) 10 CFU/mL, (c) 102CFU/mL, (d) 103 CFU/mL,(e) 104 CFU/mL,(f) 105 CFU/mL,(g) 106 CFU/mL, (h) 107CFU/mL, (i) 108 CFU/mL);

圖6為表1中8種海水樣品,用ECL法檢測VP濃度對數(y)- DPV法檢測VP濃度對數(x)線形圖;

圖7為VP傳感器分別對空白、105 CFU/mL哈維氏弧菌、105 CFU/mL陰溝腸桿菌、105CFU/mL希瓦氏菌、105CFU/mL創傷弧菌和102 CFU/mL副溶血弧菌進行電化學發光檢測的強度值;

圖8為VP傳感器分別對空白、105 CFU/mL哈維氏弧菌、105 CFU/mL陰溝腸桿菌、105CFU/mL希瓦氏菌、105CFU/mL創傷弧菌和102 CFU/mL副溶血弧菌進行DPV檢測的電流強度值。

具體實施方式

以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。

具體實施例一

一種ECL和DPV雙通道輸出檢測副溶血弧菌(VP)的適體傳感器的制備方法,如圖1所示,包括以下步驟:

(1)發光功能化Ru-MOF的合成

將18 mg的[Ru(dcbpy)3]2+溶解在10 mL的NPA/H2O混合溶液中,然后將54 mg的Zn(NO3)2溶解在以上制備的溶液中并超聲處理1小時后,在室溫下反應24小時,于8000 rpm,4 ℃溫度下離心5 min,取沉淀并用去離子水洗滌三次得到Ru-MOF納米顆粒,最好將Ru-MOF納米顆粒分散在2 mL的去離子水中,其中NPA/H2O混合溶液中NPA和H2O體積比為3:1;

(2)信號單元([email protected]2+-Apt2)的合成

將1.5 mL 2.0 mg/mL Ru-MOF納米顆粒分散在3 mL 10 mM Pb(NO3)2溶液中,并在室溫下反應24小時,于12000 rpm離心5分鐘后,將得到的沉淀用去離子水洗滌三次得到[email protected]2+復合物,然后取200 μL 100 μg/mL [email protected]2+復合物和400 μL EDC/NHS復合物 (EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽),N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),EDC/NHS復合物中EDC濃度為100 mg/mL、NHS濃度為10 mg/mL)于玻璃瓶中,混合均勻后,采用1.0 mol/L HCl溶液調溶液pH為5,震蕩孵育1 h,于8000 r離心15 min,去離子水洗滌3次,去除偶聯試劑;向玻璃瓶內加入50 μL 10 μmol/L的第二適體Apt2,混合均勻后采用1.0 mol/L NaOH溶液調溶液pH為9,震蕩孵育4小時,于8000 rpm離心15 min,去離子水洗三次,洗滌至中性,取出上清液,將沉淀分散在50 μL DNA雜交緩沖溶液中即得到信號單元[email protected]2+-Apt2溶液;

(3)雙通道適配體傳感器的制備

A.將直徑為3 mm的金電極依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3拋光粉在麂皮上拋光至鏡面,用水沖洗干凈,再依次在乙醇、水中超聲洗滌,清洗后的電極放入由濃H2SO4和H2O2按體積比7:3混合成的混合溶液中浸泡5~10 min,取出洗凈,然后在0.5 mol/L硫酸溶液中用循環伏安掃描處理,掃描速度為50 mV/s,電壓范圍為0~1.6 V,持續掃描得到穩定的循環伏安圖后,取出用水洗凈待用;

B.在上述處理好的金電極上滴入10 μL 第一適體Apt1,于37℃條件下孵育16 h,隨后加入10μL 2 mM 6-巰基-1-己醇,以封閉金電極表面非特異性活性位點,37℃條件下繼續孵育1 h,用去離子水洗滌,洗掉未結合的6-巰基-1-己醇;接著將10 μL VP目標物溶液滴涂在上述修飾有Apt1的金電極上,37℃條件下扣帽孵育1 h,使Apt1和VP充分反應,隨后用去離子水充分洗滌除去多余的VP;向反應區域滴加10 μL 上述步驟(2)制備的信號單元[email protected]2+-Apt2溶液,在37℃條件下靜置60 min,利用VP和Apt2的特異性結合,將[email protected]2+引入到整個傳感器中分別作為電化學發光和電化學的信號物,反應完成后用去離子水洗滌2~3次,除去未被VP捕獲的信號單元[email protected]2+-Apt2,即制備得到雙通道輸出檢測VP的適體傳感器。

上述Apt1是VP的第一適體序列為:5′-SH-TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT-3′

Apt2是VP的第二適體序列為:5′-NH2-TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT-3′

不同的致病菌具有與之對應的不同的核酸適配體,例如:沙門氏菌的特異性適體序列為:5′-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3′;金黃色葡萄球菌序列適體是:5'-SH-TCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATC CCACAGCTACGTC- 3'。第一適體序列為序列5′端修飾巰基,第二適體為序列5′端修飾氨基。

具體實施例二

上述由ECL和DPV雙通道輸出信號檢測VP的電化學傳感器用于VP檢測的方法,如圖1所示,包括以下步驟:

(1)ECL法檢測VP:將制備好的雙通道輸出檢測VP的適體傳感器作為工作電極,Ag/AgCl電極作為參比電極,鉑絲電極作為對電極,組成三電極體系放在電化學發光測試中進行測試,根據VP不同濃度下對應的電化學發光強度值得到電化學發光法的工作曲線,從而對待測溶液中VP濃度進行定量檢測;當加入的VP濃度越高,其捕獲的信號單元越多,被負載的Ru-MOF含量越多,而Ru-MOF本身具有電化學發光,因此電化學發光強度也越大;由圖2可知,檢測不同濃度(1~108CFU/mL)的VP存在時適體傳感器的電化學發光強度值,隨著VP濃度增大,電化學發光強度值依次增大。

由圖3可知,不同濃度VP的電化學發光強度(y)—VP濃度(x)對數線性關系,線性方程為y = 817.30+1226.01 *lgx,相關系數R = 0.995,線性關系良好,可以用于未知樣品中VP檢測。

(2)DPV法檢測VP:DPV的測試液為pH=4.5的HAc-NaAc緩沖溶液,電壓范圍0.3V~0.8V,掃速為0.1 V/s,根據VP不同濃度下的電流值得到差分脈沖伏安法的工作曲線,從而對待測溶液中VP濃度進行定量檢測。檢測原理同ECL法:當加入的VP濃度越高,其捕獲的信號單元越多,被負載的[email protected]2+含量越多,而Ru-MOF具有大的比表面積,吸附的Pb2+含量也會越多,電化學還原電流強度越大,

由圖4可知,檢測不同濃度VP的電流強度-VP濃度關系,隨著VP濃度增大,電流強度依次增大。

由圖5可知,對不同濃度VP的電流強度 (y)—VP濃度(x)對數線性關系,線性方程為y =-1.19-2.52 *lgx,相關系數R = -0.993,線性關系良好,可以用于未知樣品中VP檢測。

實際上,在傳統的夾心式免疫傳感器中,限制靈敏度提高的主要原因是第二抗體上標記的信號標簽的數量少和信號標簽的有效率比較低。一般檢測抗體上的信號標簽與電極表面之間的距離在約0至幾微米之間,與免疫復合物和標記位點的大小有關。這意味著大多數標記的信號標簽都位于外亥姆霍茲層(OHP)之外。OHP被認為是溶劑化物可以與電極發生電子交換最近位置。在電極動力學中,OHP是電化學活性物質必須達到的位置,只有當電化學活性材料接近OHP時,才發生電化學反應。因此為了提高靈敏度,必須增加盡可能多的信號標簽處于OHP以內,增加信號標簽的有效率。

由于多孔金屬有機骨架材料(MOF)具有結構新穎,比表面積大,導電率高以及優異的吸附特性和各種接枝基團(如NH2或COOH),可促進金屬離子和生物配體的共固定化,在生物醫藥領域已經受到人們的廣泛關注。而Ru-MOF作為一種具有ECL性能的二維納米材料,其孔隙表面的豐富羧基官能團可在孔隙內吸收大量的金屬離子(如Pb2+、Cd2+、Cu2+等),此外,氨基封端的DNA也可以通過偶聯劑例如EDC/NHS在Ru-MOF上標記。利用這些優異的性能,在這項工作中,我們嘗試引入適體和金屬離子Pb2+固定的納米Ru-MOF作為生物信號標簽以實現兩種方法檢測同一目標物。此外,我們還提出了基于多功能二維納米材料的法拉第籠式的新概念,二維納米材料像一張巨大的網直接搭接到電極表面,使所有的信號標簽都處于電極內,成為電極的一部分,通過擴展所提出的生物傳感器的外部亥姆霍茲層(OHP),可以克服低電極反應效率,更好地增加了靈敏度,增加結果的準確性,而且兩種方法達到相互校驗的作用。

具體實施例三

為驗證本發明雙通道適體傳感器在實際應用中的價值,在海水中加入VP標準溶液作為實際樣品,采用加標回收的方法對海水中不同濃度的VP進行了檢測,結果如表1所示;

表1 海水和海產品中VP的檢測(,n = 5)

由表1可知,ECL法檢測VP的回收率在92.8%~109.6%之間,相對標準偏差為 4.8%~8.3%,DPV法檢測VP的回收率在93.5%~110.2%之間,相對標準偏差為 4.9%~8.6%,證明兩者單獨檢測的準確性較好。

圖6為表1中8種海水樣品,用ECL法檢測VP濃度對數(y)- DPV法檢測VP濃度對數(x)線形圖;線性方程為:y = 0.984x + 0.151,相關系數R = 0.998,表明兩種方法測試結果基本一致。利用t檢驗進行ECL和DPV兩種方法的顯著性差異的比較,所得P值0.12大于0.05,證明兩種方法之間不存在顯著性差異,也就是可以實現相互佐證檢驗VP的目的,有效地避免假陽性的出現。

具體實施例四

圖7為VP傳感器分別對空白、105 CFU/mL哈維氏弧菌、105 CFU/mL陰溝腸桿菌、105CFU/mL希瓦氏菌、105CFU/mL創傷弧菌和102 CFU/mL副溶血弧菌進行電化學發光檢測的強度值;由圖可知,當副溶血弧菌存在時,檢測的電化學發光強度遠遠大于干擾食源性致病菌電化學發光強度,表明該傳感器對副溶血弧菌具有特異性檢測。

圖8為VP傳感器分別對空白、105 CFU/mL哈維氏弧菌、105 CFU/mL陰溝腸桿菌、105CFU/mL希瓦氏菌、105CFU/mL創傷弧菌和102 CFU/mL副溶血弧菌進行DPV檢測的電流強度值;由圖可知,當副溶血弧菌存在時,檢測的電流強度值遠遠大于干擾食源性致病菌電流強度值,表明該傳感器對副溶血弧菌具有特異性檢測。

以上結果說明,本發明研究出一種高靈敏度、高選擇性的雙通道檢測VP的方法,該方法具有簡單、快速、易于操作等優點,且雙通道信號之間互相比對,結果準確可靠,具有良好的應用前景。

當然,上述說明并非對本發明的限制,本發明也并不限于上述舉例。本技術領域的普通技術人員在本發明的實質范圍內,做出的變化、改型、添加或替換,也應屬于本發明的保護范圍。

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