一種基于電化學探針檢測還原型谷胱甘肽的方法與流程

文檔序號:11131604
一種基于電化學探針檢測還原型谷胱甘肽的方法與制造工藝
本發明屬于電化學傳感器
技術領域
,具體涉及一種還原型谷胱甘肽的檢測方法。
背景技術
:低分子量的巰基化合物(RSH),如半胱氨酸(Cystine,Cys)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)具有還原性,在生物體內抗氧化防御系統以及蛋白質各種功能控制中起著非常重要的作用。半胱氨酸是一種重要的含硫氨基酸,具有很多藥用價值,可以緩解藥物中毒,對放射線損傷也有防治效果;還原型谷胱甘肽本身易受某些物質氧化,所以它在體內能夠保護許多蛋白質和酶等分子中的巰基不被如自由基等有害物質氧化,從而讓蛋白質和酶等分子發揮其生理功能。生物體內巰基化合物的定量檢測十分重要。已報道的分析檢測巰基化合物的方法有光學探針法,高效液相色譜法、電化學法、質譜法、毛細管電泳法等。在諸多檢測方法中,由于電化學法具有簡單的可操作性和靈敏性而更具有優越性。公開號為CN102914570B的發明專利,公開了一種基于納米金和硫堇信號放大技術和電化學檢測還原型谷胱甘肽的方法。公開號為CN103364464B的發明專利,公開一種用于還原型谷胱甘肽檢測的光電化學傳感器的檢測方法,通過構建氧化亞銅/氧化鋅異質結基光陽極,產生的光電流比氧化鋅光陽極的提高77.3%。但檢測靈敏度還需提高。技術實現要素:本發明所要解決的技術問題是提供一種基于電化學探針高靈敏度檢測還原型谷胱甘肽的方法,檢測限為0.05nmol·L-1;利用稀土鈰(IV)作為電化學探針,基于Ce(IV)和GSH進行氧化還原反應,Ce(IV)轉化為Ce(III)時有電化學信號的變化,建立一種電化學傳感器技術檢測還原型谷胱甘肽的方法。本發明所需要的稀土鈰(IV)電化學探針為硫酸鈰CeSO4·4H2O,涉及到的主要反應方程式為Ce(IV)+2GSHCe(III)(GSSG)+2H+。本發明電化學測試實驗在CHI660D電化學工作站完成。工作電極為金電極,對電極為鉑電極,參比電極為銀/氯化銀電極。本發明電化學測試為差示脈沖伏安法(DPV),實驗條件是支持電解質為1.0mol/LNa2SO4,溶液pH值為6(用H2SO4和NaOH調節),測試溫度為25℃。本發明控制Ce(IV)離子的濃度為10.0nmol/L,GSH的濃度分別為0.15,0.4,0.5,0.75,1.5,3.0,5.0nmol/L,使用DPV法分別測定其電流值的變化。電流值與所加GSH濃度成線性關系,通過計算得出GSH的檢測濃度。本發明的電化學探針所用原料易得,反應條件容易控制,對還原型谷胱甘肽的檢測靈敏度高,檢測限為0.05nmol·L-1。選擇性好,GSH與Ce(IV)反應后,電位由U1=0.680V變為U2=0.908V,而半胱氨酸、高半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽與Ce(IV)反應后電位變化不明顯。所述的檢測琉基化合物的熒光探針可應用于化學體系中含琉基化合物的檢測,并可發展應用于生物活細胞和活組織內的還原型谷胱甘肽的分析檢測。本發明檢測還原型谷胱甘肽的具體步驟如下:步驟一,探針儲備溶液的配置準確稱量CeSO4·4H2O,加入蒸餾水超聲溶解,然后轉入容量瓶中定容后,室溫下配制成1.0mmol/LCe(IV)探針儲備溶液。步驟二,測定探針離子對還原型谷胱甘肽的選擇性將探針儲備溶液用蒸餾水稀釋,使最終探針離子的濃度為10.0nmol/L。而待測樣品半胱氨酸(Cystine,Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH,GSSG)的濃度為5.0nmol/L,將探針與待測溶液反應0.5小時后,在電化學工作站(CHI660D)上,采用差示脈沖伏安法(DPV)進行測定電流-電壓曲線。由實驗數據可知,GSH與Ce(IV)反應后,電位變化加大,電流變化較大,而半胱氨酸、高半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽與Ce(IV)反應后電壓和電流沒有明顯變化,說明Ce(IV)對GSH選擇性好。步驟三,測定探針離子對還原型谷胱甘肽的電流-濃度曲線將探針儲備溶液用蒸餾水稀釋。使最終探針離子的濃度為10.0nmol/L,谷胱甘肽(GSH)的濃度為0.15,0.4,0.5,0.75,1.5,3.0,5.0nmol/L,將探針與待測溶液反應0.5小時后,在電化學工作站(CHI660D)上應用DPV法進行測定,進而得到電流值對濃度變化的曲線,電流值與所加GSH濃度呈線性關系,線性方程為I(電流值)=28.5246+3.2432cGSH,其中線性相關系數R是0.9994,標準偏差是0.2177,檢測限為0.05nmol·L-1。步驟四,已知濃度樣品和實際生物樣品中還原型谷胱甘肽的檢測通過DPV法進行測定已知濃度的還原型谷胱甘肽樣品和市售豬肝中的還原型谷胱甘肽(GSH),根據電流值和線性方程可計算出還原型谷胱甘肽的濃度,實現還原型谷胱甘肽的分析檢測。本發明的優點和有益效果1、利用稀土鈰(IV)作為電化學探針,基于Ce(IV)和GSH進行氧化還原反應,Ce(IV)轉化為Ce(III)時有電化學信號的變化,建立一種電化學傳感器技術檢測還原型谷胱甘肽的方法。該方法電壓響應值較大,具有良好的選擇性,與其它含有巰基和二硫鍵分子無作用,具有較高的琉基檢測靈敏度。2、探針分子容易購買,穩定性好,能夠長期保存使用,可應用于生物體系的檢測。附圖說明圖1是采用DPV法測得的10.0nmol/LCe(IV)探針溶液,分別與不同濃度的還原性谷胱甘肽(0.15~5.0nmol/L)反應前后電流-電壓曲線,插圖是在0.908V處,電流值與還原性谷胱甘肽的濃度的線性圖。圖2是采用DPV法測得的10.0nmol/LCe(IV)探針溶液,分別與5.0nmol/L半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽(GSH,GSSG)反應前后電流-電壓曲線。具體實施方式下面結合附圖和表格,對本發明做進一步說明,但本發明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法,如無特殊說明,均為常規方法所述試劑和材料,如無特殊說明,均可從商業途徑獲得。本發明在CHI660D電化學工作站完成,工作電極為金電極,對電極為鉑電極,參比電極為銀/氯化銀電極。電化學測試為示差脈沖伏安法(DPV),實驗條件是支持電解質為1.0mol/LNa2SO4,用H2SO4和NaOH調節溶液pH值為6.0,測試溫度為25℃。一種基于電化學探針高靈敏度檢測還原型谷胱甘肽的方法,具體包括以下步驟:步驟一,探針儲備溶液的配置準確稱量0.0202g的CeSO4·4H2O置于50mL的燒杯中加入30mL蒸餾水超聲溶解,然后轉入50mL容量瓶中定容后,室溫下配制成1.0mmol/LCe(IV)探針儲備溶液。步驟二,測定探針離子對還原型谷胱甘肽的選擇性將探針儲備溶液用蒸餾水稀釋。使最終探針離子的濃度為10.0nmol/L。而待測樣品半胱氨酸(Cystine,Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH,GSSG)的濃度為5.0nmol/L,將探針與待測溶液反應0.5小時后,在電化學工作站(CHI660D)上采用差示脈沖伏安法(DPV)進行測定電流-電壓曲線,見圖2;最大電流值和對應的電壓值如表1所示。由表1知,GSH與Ce(IV)反應后,電位由U1=0.680V變為U2=0.908V,ΔU=0.228V,電流由25.15μA變為44.55μA,ΔI=19.40μA而半胱氨酸、高半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽與Ce(IV)反應后電壓和電流沒有明顯變化,說明Ce(IV)對GSH選擇性好。表1Ce(IV)與巰基化合物反應前后電壓電流及其變化值Ce(IV)Ce(IV)andCysCe(IV)andHcyCe(IV)andGSHCe(IV)andGSSGU(V)0.6800.6960.6720.9080.656ΔU(V)-0.016-0.080.228-0.024I(μA)25.1531.8923.3444.5511.90ΔI(μA)-6.74-1.8119.40-13.25步驟三,測定探針離子對還原型谷胱甘肽的電流-濃度曲線將探針儲備溶液用蒸餾水稀釋。使最終Ce(IV)探針離子的濃度為10.0nmol/L,谷胱甘肽(GSH)的濃度為0.15、0.4、0.5、0.75、1.5、3.0、5.0nmol/L,將探針與待測溶液反應0.5小時后,在電化學工作站(CHI660D)上應用DPV法進行測定,進而得到電流值對濃度變化的曲線,見圖1;最大電流值如表2所示。電流值與所加GSH濃度的線性方程為I(電流值)=28.5246+3.2432cGSH,其中線性相關系數R是0.9994,標準偏差是0.2177,檢測限為0.05nmol/L。表210.0nmol/L的Ce(IV)與不同濃度的GSH反應后電流值GSH濃度(nmol/L)0.150.40.50.751.535電流(μA)28.9629.5730.0531.1733.5138.5144.55步驟四,已知濃度和實際生物樣品中還原型谷胱甘肽的檢測通過DPV法進行測定1.0nmol/L的還原型谷胱甘肽(GSH)6次,其結果如表3所示,計算平均值為1.05nmol/L,偏差為5.0%,相對標準偏差為1.65%。通過DPV法進行測定市售豬肝中還原型谷胱甘肽(GSH)6次,其計算結果依次為4.61,4.63,4.74,4.66,4.69,4.75μmol/g,平均值為4.68μmol/g,相對標準偏差為3.17%。表310.0nmol/L的Ce(IV)與1.0nmol/L的GSH反應后電流值及計算結果電流(μA)31.8231.8531.6831.7531.8831.72GSH濃度(nmol/L)1.061.071.021.041.081.03當前第1頁1 2 3 
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