傅立葉變換紅外光譜技術對12種真菌的分類鑒定的制作方法

文檔序號:6200491
專利名稱:傅立葉變換紅外光譜技術對12種真菌的分類鑒定的制作方法
技術領域
本發明屬于對12種常見真菌的快速分類鑒定方法,具體地說是用傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-1R)技術對禾谷鍵抱霉(Fusariumgraminearum, F.graminearum)、棲土曲霉(Aspergillus terricola, A.terricola)、黃暗青霉(Penicillium citreonigrum, P.citreonigrum)、黃曲霉(Aspergillusflavuus, A.flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus, A.parasiticus)、桔灰青霉(Penicillium aurantiogriseum, P.aurantiogriseum)、擬康氏木霉(Trichodermapseudokoningii, T.pseudokoningii)、土生鏈抱霉(A lternari a humicola, A.humicola)、鮮綠青霉(Penicillium viridicatum,P.viridicatum)、煙曲霉(Aspergillus funigatus,A.funigatus)> 雜色曲霉(Aspergillus versicolor, A.uersicolor)、爺病鍵刀菌(Fusarium solani, F.solani)進行快速分類鑒定。
背景技術
真菌特別是植物病原真菌,種類繁多且分布廣泛,是引起小麥、水稻、大豆、蔬菜、花卉等大田作物和園藝作物病害的重要病原物,病害的發生經常造成作物大面積減產和糧食品質下降,有些屬能引起人類和一些動物皮膚病等。另外,一些真菌常產生劇毒的代謝產物,摻入植物性食品中,對人類健康危害較大,如黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等,其會破壞人或動物的肝臟組織及免疫系統,具有較強的致癌性。如產黃曲霉毒素的黃曲霉菌、寄生曲霉,產赭曲霉毒素的曲霉菌屬和青霉菌屬等。因此快速準確地對這些真菌進行鑒定是防治植物病害和食品真菌毒素污染的重要技術手段。FT-1R技術以未損傷細胞的FT-1R光譜的特殊指紋區為基礎,光譜反映的是整個細胞所有組成成分的化學鍵的振動情況,因此可以區分生化信息上的差別。FT-1R提供整個微生物菌體生化組成成分的光譜定量信息,反應微生物的信息相比更全面。其優點在于分辨率高、鑒定時間短、成本低。但光譜技術在微生物分類鑒定中的應用尚不夠系統和成熟,尚不夠規范,有待對其進行統一并形成標準方法。目前國內外還沒有對上述12種真菌的規范、統一的FT-1R分類 鑒定方法公開,也沒有關于13種真菌FT-1T光譜信息共享數據庫的公開,該發明可彌補上述缺陷,建立12種真菌的規范、統一的FT-1R分類鑒定方法。

發明內容
本發明屬于對12種真菌的分類鑒定,具體地說是應用FT-1R技術,結合化學計量學運算,實現對 F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.f lavus>A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor>F.solani的分類鑒定。包括建立12種標準菌株光譜信息數據庫,規范并統一細菌培養條件、樣品制備條件、光譜采集參數及數據分析方法等。本發明所采用的技術方案為:應用FT-1R技術,建立F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus>A.uersicolor、F.solani 等12種標準菌株的光譜信息數據庫,同時規范并統一細菌培養條件、樣品制備條件、光譜采集參數及數據分析方法。采用相同細菌培養、樣品制備及光譜采集方法,獲得可疑待測菌的光譜數據,與12種標準菌株的光譜信息數據庫合并,并進行分級聚類分析(hierarchicalcluster analysis, HCA),相同菌的圖譜應歸為一類,根據獲得可疑待測菌的歸類圖譜情況,實現對待測菌的分類鑒定。本發明涉及的12種真菌的FT-1R分類鑒定方法,依次包括下列步驟(1)-(2):(I)建立12種真菌的紅外光譜信息數據庫①細菌的培養:用無菌接種環挑取標準菌株F.graminearum CGMCC3.4733、A.terricola CGMCC3.3557、P.citreonigrum CGMCC3.5694、A.flavus CGMCC3.6434、A.parasiticus CGMCC3.6156、P.aurantiogriseum CGMCC3.5691、T.pseudokoningiiCGMCC3.3002、A.humicola CGMCC3.3907、P.viridicatum CGMCC3.5690、A.funigatusCGMCC3.6452、A.uersicolor CGMCC3.6410、F.solaniCPCC460008 一環,接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板上,28°C ±1°C靜置培養5d;②硒化鋅(ZnSe)窗片的制作:在無菌操作工作臺中,用滅好菌的小鐵勺將培養好的菌絲刮下,放入盛有ImL無菌生理鹽水的1.5mL離心管中,5000g離心5min,吸棄上清,力口入ImL無菌生理鹽水懸浮洗漆,5000g離心5min,再加入ImL超純水懸浮洗漆,5000g離心5min,超純水重復洗滌兩次。最后用50 μ L超純水懸浮混勻。用微量移液器分別吸取各不同稀釋度的菌懸液10 μ L于ZnSe窗片中心位置,水平置于45°C干燥箱中烘干至無水分的干燥菌斑;③讀取真菌4000 600CHT1波數范圍的紅外光譜:光譜參數為:模式為透過率模式(采用氣氛補償功能去除環境大氣中的水蒸氣和CO2的吸收光譜干擾)。實驗參數為 波段范圍4000 e OOcnT1,光譜分辨率4CHT1,64次光譜累計求平均。每種菌至少做6次試驗,每次做3個重復并取平均,獲得6個有效光譜數據;④光譜預處理:對12種真菌4000 600CHT1波數范圍的紅外光譜依次進行如下處理:透過率-吸光度轉化、基線校正、矢量歸一化、光譜-excel數據轉換,即建立了 12種真菌的紅外光譜信息數據庫;⑤聚類方法的建立:對12種真菌的900-18000^1和2800-3700^^1波數范圍光譜數據進行分級聚類分析(HCA),獲得實現12種真菌分類鑒定的方法參數:HCA:皮爾森積矩相關系數(Ward’ s method, Pearsonr)。(2)對目標菌的分類鑒定采用上述真菌培養、硒化鋅(ZnSe)窗片制作、光譜采集及光譜預處理方法,獲得可疑待測目標菌的紅外光譜數據。將其與12種標準菌株的光譜信息數據庫合并,按照上述方法對合并后的數據重新進行分級聚類分析(HCA),相同菌的圖譜應歸為一類,根據待測菌在數據庫中的歸類圖譜情況,實現對待測菌的分類鑒定。F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor> F.solani 分別聚類到數據庫中對應的 F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、Auersicolor> F.solani 聚類群中。


圖1:應用HCA對12種真菌標準菌株的分類圖;圖2:實施例中應用HCA對供試樣品中12種真菌的分類鑒定圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步說明。實施例供試樣品制備:將無菌辣椒粉分為12份,每份500g ;菌懸液制備 :用滅好菌的小鐵勺將培養好的菌絲刮下,放入盛有ImL無菌生理鹽水的1.5mL離心管中,反復吹吸數次;添加:向辣椒粉中其中分別添加F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor、F.solani 標準菌株溶液各 IOmL,攬拌混勻,冷凍備用。按下述方法檢測供試樣品:包括純凈水,0.9%生理鹽水,無水乙醇,馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)等;按照以下程序進行檢測:(I)真菌培養稱取12份辣椒粉供試樣品各25g至盛有225mL滅菌蒸餾水的均質袋中,用拍擊式均質器拍打2min,分別吸取ImL樣品勻液于I個無菌平皿內,將15 20mL冷卻至46°C的馬鈴薯葡萄糖瓊脂傾注平皿,并轉動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后,將平板倒置,28 0C ±1°C 培養 5d。(2)硒化鋅(ZnSe)窗片的制作在無菌操作工作臺中,用滅好菌的小鐵勺將培養好的菌絲刮下,放入盛有ImL無菌生理鹽水的1.5mL離心管中,5000g離心5min,吸棄上清,加入ImL無菌生理鹽水懸浮洗漆,5000g離心5min,再加入ImL超純水懸浮洗漆,5000g離心5min,超純水重復洗漆兩次。最后用50 μ L超純水懸浮混勻。用微量移液器分別吸取各不同稀釋度的菌懸液10 μ L于ZnSe窗片中心位置,水平置于45°C干燥箱中烘干至無水分的干燥菌斑:(3)讀取細菌4000 600CHT1波數范圍的紅外光譜將載有樣品的ZnSe窗片置于傅立葉變換紅外光譜儀上進行光譜采集,光譜參數為:模式為透過率模式(采用氣氛補償功能去除環境大氣中的水蒸氣和CO2的吸收光譜干擾)。實驗參數為:波段范圍4000 eOOcnT1,光譜分辨率4(311^,64次光譜累計求平均。每種菌做3個重復并取平均;(4)光譜預處理對待測菌4000 eOOcnT1波數范圍的紅外光譜依次進行如下處理:透過率-吸光度轉化、基線校正、矢量歸一化、導數譜-excel數據轉換;(5)數據分析
將待測菌光譜數據與12種標準菌株的光譜信息數據庫合并,對gOO-lSOOcm—1和2800-3700(^1波數范圍光譜數據進行HCA(皮爾森積矩相關系數(Ward’ s method,Pearsonr)):F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、Auersicolorλ F.solani 分別聚類到數據庫中對應的 F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor、F.solani 聚類群中。分類鑒定情 況見圖2。
權利要求
1.一種對禾谷鍵抱霉、棲土曲霉、黃暗青霉、黃曲霉、寄生曲霉、結灰青霉、擬康氏木霉、土生鏈孢霉、鮮綠青霉、煙曲霉、雜色曲霉、茄病鐮刀菌等12種真菌的的分類鑒定方法,其特征在于數據庫的建立: 對禾谷鍵抱霉(Fusarium graminearum, F.graminearum) CGMCC3.4733、棲土曲霉(Aspergillus terricola, A.terricola)CGMCC3.3557、黃暗青霉(Penicilliumcitreonigrum, P.citreonigrum) CGMCC3.5694、黃曲霉(Aspergillus f lavus, A.flavus)CGMCC3.6434、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus, A.parasiticus)CGMCC3.6156、桔灰青霉(Penicillium aurantiogriseum, P.aurantiogriseum)CGMCC3.5691> 擬康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii, T.pseudokoningii)CGMCC3.3002、士生鏈抱霉(Alternaria humicola,A.humicola)CGMCC3.3907、鮮綠青霉(Penicillium viridicatum,P.viridicatum)CGMCC3.5690> 煙曲霉(Aspergillus funigatus, A.funigatus)CGMCC3.6452、雜色曲霉(Aspergillus versicolor,A.uersicolor)CGMCC3.6410、爺病鍵刀菌(Fusarium solani,F.solani) CPCC460008 等 12 種標準菌株 4000 ΘΟΟαιΓ1 波數范圍的傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FT IR)依次進行如下處理:透過率-吸光度轉化、基線校正、矢量歸一化、光譜-excel數據轉換,即建立了 12種真菌的紅外光譜信息數據庫。
2.根據權利要求1所述的12種真菌的傅立葉變換紅外光譜鑒別方法,其特征是依次包括以下步驟: (1)細菌的培養:用無菌接種環挑取可疑 F.graminearum、Aterricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor、F.solani 一環,接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板上,.28 °C ±1°〇靜置培養5(1。
(2)硒化鋅(ZnSe)窗片的制作: 在無菌操作工作臺中,用滅好菌的小鐵勺將培養好的菌絲刮下,放入盛有ImL無菌生理鹽水的1.5mL離心管中,5000g離心5min,吸棄上清,加入ImL無菌生理鹽水懸浮洗滌,5000g離心5min,再加入ImL超純水懸浮洗漆,5000g離心5min,超純水重復洗漆兩次。最后用50 μ L超純水懸浮混勻。用微量移液器分別吸取各不同稀釋度的菌懸液10 μ L于ZnSe窗片中心位置,水平置于45°C干燥箱中烘干至無水分的干燥菌斑。
(3)讀取真菌4000 600CHT1波數范圍的紅外光譜: 將載有樣品的ZnSe窗片置于傅立葉變換紅外光譜儀上進行光譜采集,光譜參數為:模式為透過率模式(采用氣氛補償功能去除環境大氣中的水蒸氣和CO2的吸收光譜干擾)。實驗參數為:波段范圍4000 eOOcnT1,光譜分辨率4(311^,64次光譜累計求平均。
(4)光譜預處理: 根據權利要求1,對光譜進行處理,得到由光譜轉換的excel數據。
(5)對數據進行分級聚類分析(hierarchicalcluster analysis, HCA): 對上述處理的菌900-18000^1和2800-37000^1波數范圍光譜數據進行HCA ; HCA:皮爾森積矩相關系數(Ward’ s method, Pearsonr); F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor λ F.solani 分別聚類到數據庫中對應的 F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funi gatus、A.uersicolor、F.solani 聚類群中。
全文摘要
本發明屬于對12種常見真菌的快速分類鑒定方法,具體地說是用傅立葉變換紅外光譜(FTIR)技術結合化學計量學運算(分級聚類分析)對禾谷鐮孢霉(F.graminearum)、棲土曲霉(A.terricola)、黃暗青霉(P.citreonigrum)、黃曲霉(A.flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)、桔灰青霉(P.aurantiogriseum)、擬康氏木霉(T.pseudokoningii)、土生鏈孢霉(A.humicola)、鮮綠青霉(P.viridicatum)、煙曲霉(A.funigatus)、雜色曲霉(A.uersicolor)、茄病鐮刀菌(F.solani)等12種常見真菌進行分類鑒定。方法包括12種真菌FTIR光譜信息數據庫的建立、真菌的培養、硒化鋅(ZnSe)窗片的制作、光譜采集及預處理,最后采用分級聚類分析進行結果判定。其優點在于分辨率高、快速、操作簡單、成本低。
文檔編號G01N21/35GK103217399SQ20131006397
公開日2013年7月24日 申請日期2013年2月22日 優先權日2013年2月22日
發明者楊麗君, 李兆杰, 王靜, 徐成鋼 申請人:威海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
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