雜色曲霉毒素的酶聯免疫吸附試劑盒制備及檢測方法

文檔序號:6162397
雜色曲霉毒素的酶聯免疫吸附試劑盒制備及檢測方法
【專利摘要】本發明為雜色曲霉毒素的酶聯免疫吸附檢測專用試劑盒。其檢測快速、靈敏、準確、可定量,操作簡便,且對樣品純度要求不高,特異性強,特別適用于大批量樣品的檢測,為此,本發明還提供了專用試劑盒的制備及檢測方法。其中包括洗滌液,顯色液,終止液。其特征在于:包有雜色曲霉毒素固相抗原的包被板、雜色曲霉毒素(ST)標準品,雜色曲霉毒素單克隆抗體、雜色曲霉毒素酶標抗體。
【專利說明】雜色曲霉毒素的酶聯免疫吸附試劑盒制備及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】,具體為對雜色曲霉毒素酶聯免疫吸附檢測專用試劑盒的制備及專業檢測。
【背景技術】
[0002]雜色曲霉素(ST)主要是雜色曲霉和構巢曲霉的最終代謝產物,同時又是黃曲霉和寄生曲霉生成黃血霉毒素過程后期的中間產物。據報道,感染了雜色曲霉的玉米在27°C的環境下,21天可產生雜色曲霉毒素12 g/kg以上。雜色曲霉毒素在1954年由雜色曲霉培養物中首先分離出的,但并未引起人們的足夠重視,至發現黃曲霉毒素的強致癌性后,才開始注意。用14-標記方法已證實雜色曲霉毒素能轉變成黃曲霉毒素馬,而且有人認為雜色曲霉毒素可能是非洲某些地區肝癌的病因。
[0003]能產生ST的菌種主要是雜色曲霉、構巢曲霉和離蠕孢霉。此外,謝瓦曲霉、赤曲霉、焦曲霉、阿姆斯特丹曲霉、黃褐曲霉、四脊曲霉、變色曲霉、爪曲霉、毛殼霉及黃曲霉和寄生曲霉等也可產生ST。上述這些霉菌廣泛存在于自然界,可污染大麥、小麥、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等糧食、食品和飼草,尤其對小麥、玉米、花生等飼料和飼草污染更為嚴重。產毒量最高的是雜色曲霉,其次是構巢曲霉和離蠕孢霉,前者產生ST的量約為后者的2倍。
[0004]本發明為雜色曲霉毒素的酶聯免疫吸附檢測專用試劑盒。其檢測快速、靈敏、準確、可定量,操作簡便,且對樣品純度要求不高,特異性強,特別適用于大批量樣品的檢測。

【發明內容】

[0005]本發明提供了專用試劑盒的制備及檢測方法。其中包括洗滌液,顯色液,終止液。其特征在于:包有雜色曲霉毒素固相抗原的包被板、雜色曲霉毒素(ST)標準品,雜色曲霉毒素單克隆抗體、雜色曲霉毒素酶標抗體。
[0006]檢測時,取包被板,加入標準品/樣本50 μ L到對應的微孔中,再加入酶標記物50 μ L/孔,然后再加入50 μ L/孔抗體工作液,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應30 min。小心揭開蓋板膜,將孔內液體甩干,加洗滌液250 μ L/孔,每次浸泡15~30s,充分洗滌4飛次,用吸水紙拍干。加入顯色液100 yL/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境反應15 min。每孔各加50 μ L終止液,設定酶標儀在450 nm處,測定OD值(建議用450/630 nm雙波長檢測,在5 min內讀完數據)。從標準曲線中計算樣品中ST的含量。測得的標準液或樣品吸光度的平均值(B)除以第一個標準液(O標準液)的吸光度(B。)值再乘以100%,得到百分吸光度值,
百分吸光度值(%) = B/B0X100%
以標準品濃度的10為底的對數為X軸,百分吸光值為Y軸,繪制標準曲線。將樣本的百分吸光值代入標準曲線,從標準曲線上讀出樣本所對應的值,作為10的冪,乘以稀釋倍數,即為樣品中所含雜色曲霉毒素的量?!緦@綀D】

【附圖說明】
[0007]圖1為雜色曲霉毒素標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0008]實施例1樣本前處理方法
準確稱取5.00 g樣品,加45 mL乙腈,5 mL含有4%KC1的40%硫酸溶液后,在振蕩機上振蕩30 min傾出清液,再用10 mL乙腈分兩次洗殘渣,收集乙腈液并與上述提取液合并,合并的提取液用石油醚脫脂三(石油醚用量為20,15,10 mL),脫脂后的提取液加水25mL,用氯仿萃取三次(氯仿用量為20,15,10mL),收集的氯仿層在低溫(_6°C)下冷凍,然后過濾去冰,去脂,用旋轉蒸發器蒸干(溫度40°C以下),殘渣用樣品稀釋液溶解后供色譜測定用。
[0009]實施例2雜色曲霉毒素的酶聯免疫吸附試劑盒制備
1、雜色曲霉毒素固相抗原的包被板制作,包括包被原的制作封閉、液的配置、以及孵育。把包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作。包被液:1.6 g碳酸鈉加上2.9 g碳酸氫鈉,加雙蒸水至1000 mL,調節pH至9.6。封閉液:1 gBSA,IOOmLPBS。包板時每孔100ML包板液,37°C下孵育2 h,后取出洗板兩次,加封閉液,每孔180 μ?,37°C下孵育1.5 h,取出甩干,加干燥劑2~8°C保存;
2、包被原的偶聯:
碳二亞胺(EDC)法偶聯雜色曲霉毒素半抗原與蛋白載體:取5 mg雜色曲霉毒素半抗原和2.5 mg cBSA溶解在250 μ? TE buffer (pH 8.0)中,充分震蕩使其溶解,再取EDC.HCl79 mg充分溶解于250 μ?ΤΕ buffer (pH 8.0)中。將雜色曲霉毒素半抗原和cBSA的混合溶液邊震蕩邊逐滴加入EDC溶液,在37°C搖床中反應2 h以上。先用S^hadex柱分離偶聯產物和未結合的雜色曲霉毒素半抗原小分子,再透析純化,將0.5 mL溶液在I3BS中透析3 d,每天換液兩次,每次換液200 mL。透析產物雜色曲霉毒素半抗原偶聯蛋白小劑量分裝,于-20°C保存,備用;
3、雜色曲霉毒素單克隆抗體制備方法:
I材料和方法
(1)試劑 人工抗原:雜色曲霉毒素-牛血清白蛋白復合物,弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑,L-谷氨酰胺,牛血清白蛋白第五部分,聚乙二醇_1000,2,6,10,14-四甲基十五烷(Pristane ),鄰苯二胺,二甲基亞砜,Tris, Hepes pH緩沖劑,免疫球蛋白,辣根過氧化氫酶標物,小鼠IgG和羊抗小鼠IgG等,其它常規化學試劑均為優級純、分析純試劑;
(2)免疫動物
8周齡BALB/c雄性小鼠用人工抗原雜色曲霉毒素-BSA行二次免疫;每只小鼠基礎免疫劑量為100 Pg,腹腔注射:24d后加強免疫,尾靜脈注射,4 d后取脾融合;
(3)細胞融合
免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞Sp-2/O以10:1混合。用50%分子量為1000聚乙二醇作融合劑,融合細胞用含20%小牛血清的HAT選擇性培養基懸浮后,接種于似小鼠腹腔巨噬細胞作飼養層的96孔培養板中,于50% C02, 37°C條件下培養,7 d后,每培養孔更換2/3HT培養液。9 d后,開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養孔,取上清液進行篩選,對檢測結果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆化;
(4)腹水抗體純化
用硫酸銨鹽析法純化腹水抗體;
(5)雜交瘤篩選及抗體檢測
雜交瘤篩選用固相抗原間接競爭性ELISA法進行:包被抗原雜色曲霉毒素-BSA的濃度為15 Pg/mL,每孔加量120 PL ;每孔所含抗體抗原反應物由80 PL培養上清液+2 μ?經紫外分光光度計標定濃度的雜色曲霉毒素(10 Pg/mL)組成;檢測對照孔中的抗原部分則用20 PL毒素稀釋液(20%Me0H-PBS)代替;酶底物用鄰苯二胺(OPD);其它按標準方法進行;
(6)抗體的特性
①抗體滴度:
用固相抗原間接非競爭性ELISA測定,測試條件為:包被抗原為雜色曲霉毒素-BSA,濃度15 Pg/mL,每孔加量150 μ?:抗體從100倍開始對倍稀釋,每孔加量130μ? ;抗體稀釋液為0.1%的BSA-PBS ;陰性對照孔用SP-2/0骨髓瘤細胞培養上清液;封閉液為1%BSA_PBS,每孔加量250 μ? ;酶底物用OPD。其它按標準方法進行;
②檢測標準毒素靈敏度:
先用棋盤滴定法篩選出包 被抗原濃度和抗體工作稀釋度的優化組合,以此為測試條件,用固相抗原間接競爭性ELISA法做出雜色曲霉毒素的標準抑制曲線,并對結果進行數理統計分析。其中ELISA測試條件為:包被包被原雜色曲霉毒素-BSA偶聯蛋白的濃度為5Kg/mL,每孔加量150 μ? ;抗體工作液稀釋比為1:25600 ;抗體稀釋液為0.1% BSA-PBS ;抗體抗原反應液為每孔65 PL抗體+65 PL相應濃度雜色曲霉毒素;封閉液為1%BSA-PBS,每孔加量250 μ? ;酶底物為OPD ;陰性對照用Sp-2/O骨髓瘤細胞培養上清液。其它按標準方法進行;
③抗體的特異性:
用固相抗原間接競爭性ELISA法測定,參試毒素為雜色曲霉毒素,構巢曲霉,黃曲霉,寄生曲霉,黃曲霉毒素馬,其它測試條件同②;
④抗體亞類分析:
用免疫雙擴散法進行;
⑤抗體的親和力:
Friguet法。對應小鼠IgG標準曲線滴定出抗體IgG含量,再對應抗體滴度曲線求出平衡態下,抗體使抗原達到半飽和時的游離抗體克分子濃度[Ab],代入下式求出抗體的親和常數 K (L/moL),
Ka = I / [Ab]
(7)樣品中雜色曲霉毒素提取與純化;
II結果與討論
細胞融合一與雜交瘤細胞的篩選細胞融合后,約57.6%的孔中長出雜交瘤克隆,其中抗體檢測陽性率約為88%。從中選擇對抗原有強抑制作用的孔,經多次亞克隆、建立了 5個穩定分泌抗雜色曲霉毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞株各細胞株經兩次亞克隆以后,陽性率已達到100 %。2H8第3次克隆化時有反復(疑為假明性),所以進行了 4次亞克隆。將上述抗體純化,即可。
[0010]4、雜色曲霉毒素的標準品由高標稀釋而成,稀釋液為PBS。0.1M PBS:1000 mL蒸餾水中加 NaCl 9 g, Na2HPO4.Iffi2O6 g, NaH2PO4.2H20 0.4 g, pH:7.2。
[0011]5、雜色曲霉毒素的酶標抗體的酶由辣根過氧化酶標記。該酶標抗體用交聯法制作,聯劑是25%的戊二醛水溶液。原理是利用戊二醛分子上對稱的兩個醛基,分別與酶和蛋白質分子中游離的氨基、酚基等以共價鍵結合而進行標記。標記時應盡量采用新鮮純品,當戌二醛的0D235nm/0D28(lnm < 3時,即為好的交聯劑。該發明采用一步法制作,即把辣根過氧化酶、戊二醛和雜色曲霉抗體一起加入進行交聯。然后透析出過量的戊二醛而制備出具有聞分子量的酶結合物。由于抗體分子量大(16萬),酶分子量小(4萬),抗體分子的氨基數比酶蛋白分子氨基數多得多,結果生成的抗體-戊二醛或抗體-戊二醛-抗體多而造成酶標物的活性小。一步法操作:
①抗IgG-雜色曲霉毒素的制備:將10 mg雜色曲霉毒素溶于含有5 mg抗IgG的ImLPBS (0.01 moL/L pH7.0)中,在冰浴中緩緩攪拌,盡量避免氣泡產生,完全溶解后,緩緩滴加1%戊二醛溶液4 ml,使戊二醛的最終濃度為0.2%,移至室溫中靜置2tT3h后,以0.01moL/L pH7.0 PBS液4°C充分透析或以S印hadexG25柱除去過量的戊二醛,4°C保存備用(也可保存于50%甘油中置低溫冰箱);②抗IgG-HRP的制備:將12 mgHRP溶于含5 mg抗IgG的I mLPBS (0.lmol/L ρΗ6.8)中,緩慢攪拌下加入1%戊二醛溶液4 mL,置室溫2h?3h,充分透析或以SephadexG25除戊二醛,小量分裝后保存于低溫冰箱,避免反復凍融,或冷凍干燥保存。
[0012]6、洗滌液的制備:
十二水磷酸氫鈉68.8 g加磷酸二氫鈉6.9 g,氯化鈉45 g, Tween-20 0.5 mL,加雙蒸水至1L,調節pH至7.4。
[0013]7、顯色液的制備:
顯色液A:無水乙酸鈉8.2 g,β-糊精2.5 g,過氧化氫脲428.6 g,加雙蒸水至I L,調節pH至5.0,4°C保存,使用時達室溫。顯色液B:100 mgTMB溶于10 mLDMSO中,棕色瓶保存。使用時將14.6 mL顯色液A與0.45 mL顯色液B混合15分鐘。
[0014]8、終止液制備:
2M硫酸:0.11 L 18M的濃硫酸加水稀釋到I L。
[0015]實施例3測定步驟:
1、將所需試劑和微孔板從冷藏環境中取出,在室溫下平衡30min,每種液體使用前均須搖勻。注意標準液均需做2個平行試驗;
2、加標準品:加標準品/樣本50μ L到對應的微孔中,再加入酶標記物50 μ L/孔,然后再加入50μ L/孔抗體工作液,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應30 min ;
3、洗板:小心揭開蓋板膜,將孔內液體甩干,加洗滌液2501117孔,每次浸泡15?30 s,充分洗滌4飛次,用吸水紙拍干;
4、顯色:加入顯色液IOOyL/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境反應 15 min ;
5、測定:每孔各加50μ L終止液,設定酶標儀在450 nm處,測定OD值(建議用450/630nm雙波長檢測,在5 min內讀完數據); 6、結果分析:
所測得的標準液或樣品吸光度的平均值(B)除以第一個標準液(O標準液)的吸光度(B。)值再乘以100%,得到百分吸光度值,
百分吸光度值(%) = B/B0X100%
以標準品濃度的10為底的對數為X軸,百分吸光值為Y軸,繪制標準曲線。將樣本的百分吸光值代入標準曲線,從標準曲線上讀出樣本所對應的值,作為10的冪,乘以稀釋倍數,即為樣品中所含雜色曲霉毒素的量。
【權利要求】
1.雜色曲霉毒素試劑盒的制備,包括洗滌液,顯色液,終止液;其特征在于:包有雜曲霉毒素固相抗原的包被板、雜色曲霉毒素(ST)標準品,雜色曲霉毒素單克隆抗體、雜色曲霉毒素酶標抗體。
2.雜色曲霉毒素固相抗原的包被板制作,包括包被原的制作、封閉液的配置、以及孵育;包被原的偶聯:根據雜色曲霉的結構特征偶聯載體蛋白BSA方法如下: 碳二亞胺(EDC)法偶聯雜色曲霉毒素半抗原與蛋白載體; 取5 mg雜色曲霉毒素半抗原和2.5 mg cBSA溶解在250 μ?ΤΕ buffer (pH 8.0)中,充分震蕩使其溶解,再取EDOHCl 79 mg充分溶解于250 μ? TE buffer (pH 8.0)中;將雜色曲霉毒素半抗原和cBSA的混合溶液邊震蕩邊逐滴加入EDC溶液,在37°C搖床中反應2 h以上;先用S^hadex柱分離偶聯產物和未結合的雜色曲霉毒素半抗原小分子;再透析純化,將0.5 mL溶液在PBS中透析3 d,每天換液兩次,每次換液200 mL ;制得的雜色曲霉毒素偶聯物透析產物小劑量分裝,于-20°C保存,備用;包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作;包被液:1.6 g碳酸鈉加上2.9 g碳酸氫鈉,加雙蒸水至1000 mL,調節pH至9.6 ;封閉液:1 g BSA,100 mL PBS ;包板時每孔100 PL包板液,37°C下孵育2 h,后取出洗板兩次,加封閉液,每孔180 μ?,37°0下孵育1.5 h,取出甩干,加干燥劑疒8°C保存。
3.根據權利要求書第一條所述,雜色曲霉毒素單克隆抗體制備方法 I材料和方法 (1)試劑 人工抗原:雜色曲霉毒素-牛血清白蛋白復合物,弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑,L-谷氨酰胺,牛血清白蛋白第五部分,聚乙二醇-1000,2,6,10,14-四甲基十五烷(Pristane ),鄰苯二胺,二甲基亞砜,Tris, Hepes pH緩沖劑,免疫球蛋白,辣根過氧化氫酶,鼠抗IgG等,其它常規化學試劑均為優級純、分析純試劑; (2)免疫動物 8周齡BALB/c雄性小鼠用人工抗原雜色曲霉毒素-BSA進行二次免疫;每只小鼠基礎免疫劑量為100 Pg腹腔注射;24 d后加強免疫,劑量為每只小鼠100 Pg,尾靜脈注射,4 d后取脾融合; (3)細胞融合 免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞Sp-2/O以10:1混合; 用50%分子量為1000的聚乙二醇作融合劑,融合細胞用含20%小牛血清的HAT選擇性培養基懸浮后,接種于類似 小鼠腹腔巨噬細胞作飼養層的96孔培養板中,于50% C02,37°C條件下培養7 d后,每培養孔更換2/3HT培養液;9 d后,開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養孔,取上清液進行篩選,對檢測結果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆化; (4)腹水抗體純化 用硫酸銨鹽析法純化腹水抗體; (5)雜交瘤篩選及抗體檢測 雜交瘤篩選用固相抗原間接競爭性ELISA法進行:包被抗原雜色曲霉毒素-BSA的濃度為15 Pg/mL,每孔加量120 PL ;每孔所含抗體抗原反應物由80 PL培養上清液+2 μ?經紫外分光光度計標定濃度的雜色曲霉毒素(10 Pg/mL)組成;檢測對照中的抗原部分則用20KL毒素稀釋液(20%Me0H-PBS)代替;酶底物用鄰苯二胺(OPD);其它按標準方法進行;(6)抗體的特性 ①抗體滴度: 用固相抗原間接非競爭性ELISA測定,測試條件為:包被抗原為雜色曲霉毒素-BSA,濃度15 Pg/mL,每孔加量150 PL ;抗體從100倍開始對倍稀釋,每孔加量130 PL ;抗體稀釋液為0.1%的BSA-PBS ;陰性對照孔用SP-2/0骨髓瘤細胞培養上清液;封閉液為1% BSA-PBS,每孔加量250 μ? ;酶底物用OPD,其它按標準方法進行; ②檢測標準毒素靈敏度: 先用棋盤滴定法篩選出包被抗原濃度和抗體工作稀釋度的優化組合,以此為測試條件,用固相抗原間接競爭性ELISA法做出雜色曲霉毒素的標準抑制曲線,并對結果進行數理統計分析;其中ELISA測試條件為:包被抗原雜色曲霉毒素-BSA的濃度為5 Pg/mL,每孔加量150 μ? ;抗體工作稀釋度1:25600 ;抗體稀釋液為0.1% BSA-PBS ;抗體抗原反應液為每孔65 PL抗體+65 PL相應濃度雜色曲霉毒素;封閉液為1% BSA-PBS,每孔加量250 μ? ;酶底物為OPD ;陰性對照用Sp-2/O骨髓瘤細胞培養上清液,其它按標準方法進行; ③抗體的特異性: 用固相抗原間接競爭性ELISA法測定,參試毒素為雜色曲霉毒素,構巢曲霉,黃曲霉,寄生曲霉,黃曲霉毒素馬;其它測試條件同②; ④抗體亞類分析: 用免疫雙擴散法進行; ⑤抗體的親和力: Friguet法,對應小鼠IgG標準曲線滴定出抗體IgG含量,再對應抗體滴度曲線求出平衡態下,抗體使抗原達到半飽和時的游離抗體克分子濃度[Ab],代入下式求出抗體的親和常數 K (L/moL),
Ka = I /[Ab] (7)樣品中雜色曲霉毒素提取與純化 II結果與討論 (I)細胞融合與雜交瘤細胞的篩選細胞融合后,約57.6%的孔中長出雜交瘤克隆,其中抗體檢測陽性率約為88% ;從中選擇對抗原有強抑制作用的孔,經多次亞克隆,建立了 5個穩定分泌抗雜色曲霉毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞株,各細胞株經兩次亞克隆以后,陽性率已達到100% ;第3次克隆化時有反復(疑為假明性),所以進行了 4次亞克??;將上述抗體純化,即可。
4.根據權利要求書第一條所述,雜色曲霉毒素的標準品由高標稀釋而成,稀釋液為PBS ;0.1M PBS:1000 mL 蒸餾水中加 NaCl 9 g, Na2HP04.12H20 6 g, NaH2P04.2H20 0.4g,pH:7.2o
5.根據權利要求書第一條所述,雜色曲霉毒素的酶標抗體的酶由辣根過氧化酶標記;該酶標抗體用交聯法制作,交聯劑是25%的戊二醛水溶液,原理是利用戊二醛分子上對稱的兩個醛基,分別與酶和蛋白質分子中游離的氨基、酚基等以共價鍵結合而進行標記;標記時應盡量采用新鮮純品,當戌二醛的0D235nm/0D28(lnm < 3時,即為好的交聯劑;該發明采用一步法制作,即把辣根過氧化 酶、戊二醛和雜色曲霉抗體一起加入進行交聯;然后透析出過量的戊二醛而制備出具有高分子量的酶結合物;由于抗體分子量大(16),酶分子量小(4萬),抗體分子的氨基數比酶蛋白分子氨基數多得多,結果生成的抗體-戊二醛或抗體-戊二醛-抗體多而造成酶標物的活性??;一步法操作:①抗IgG-雜色曲霉毒素的制備:將10mg雜色曲霉毒素溶于含有5 mg抗IgG的I mLPBS (0.01 moL/L pH7.0)中,在冰浴中緩緩攪拌,盡量避免氣泡產生,完全溶解后,緩緩滴加1%戊二醛溶液4 mL,使戊二醛的最終濃度為0.2%,移至室溫中靜置2 h~3 h后,以0.01 moL/L pH 7.0 PBS液4°C充分透析或以S印hadexG25柱除去過量的戊二醛,4°C保存備用(也可保存于50%甘油中置低溫冰箱)抗 IgG-HRP 的制備:將 12 mg HRP 溶于含 5 mg 抗 IgG 的 I mLPBS (0.1 moL/L pH 6.8)中,緩慢攪拌下加入1%戊二醛溶液4 mL,置室溫2tT3h,充分透析或以S^hadexG25除戊二醛,小量分裝后保存于低溫冰箱,避免反復凍融或冷凍干燥保存。
6.根據權利要求書所述,雜色曲霉毒素的檢測步驟如下:取包被板,加入標準品/樣本50 μ L到對應的微孔中,再加入酶標記物50 μ L/孔,然后再加入50 μ L /孔抗體工作液,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應30 min ;小心揭開蓋板膜,將孔內液體甩干,加洗滌液250 μL/孔,每次浸泡15~30 S,充分洗滌4飛次,用吸水紙拍干;加入顯色液100μ L /孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境反應15 min;每孔各加50 μ L終止液,設定酶標儀在450 nm處,測定OD值(建議用450/630 nm雙波長檢測,在5 min內讀完數據);從標準曲線中計算樣品中ST的含量
【文檔編號】G01N33/577GK103792360SQ201210435692
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月5日 優先權日:2012年11月5日
【發明者】杜道林, 祝文珍 申請人:江蘇維賽科技生物發展有限公司
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