檢測人血漿中mr-1s含量的試劑盒及其制備方法

文檔序號:6141443
專利名稱:檢測人血漿中mr-1s含量的試劑盒及其制備方法
技術領域
本發明屬于生物醫藥檢驗技術領域,具體涉及一種檢測S亞型人肌纖維生成調節因子1含量的酶聯免疫吸附測定試劑盒及其制備方法。
背景技術
當前,惡性腫瘤發病率和死亡率呈逐年上升趨勢。目前,腫瘤診斷主要依賴影像學檢查,細胞學、生化學和免疫學檢驗。后者為主要檢查血清或血漿中的腫瘤標志物(tumor marker),簡稱TM,由于TM的檢測較為經濟,取材方便、檢查時創傷小,且適合大批量標本檢測,在臨床惡性腫瘤患者的病情監測、預后評估中有較好的應用價值。中國疾控中心的最新統計資料表明,由于人們飲食結構、生活環境及方式的改變, 惡性腫瘤,特別是卵巢癌、大腸癌、肝癌等發病近年呈上升趨勢。任開環等的研究(J Bio Chem, 2008; 283(51) 35598-35605.)以及我們前期的研究均發現,一種新的腫瘤標志
物-S亞型人肌纖維生成調節因子1 (Myofibrillogenesis Regulator-I S, MR-1S,以
下均簡稱“MR-1S”)與惡性腫瘤,如卵巢癌、肝癌的發生、發展與密切相關,更與腫瘤細胞的粘附、轉移息息相關。MR-I是一個新近報道的人類功能基因,該基因在轉錄過程中可形成3 條長度不同的剪接異構體,即MR-1L、MR-1M和MR-1S,分別含10、9和3個外顯子,其中S亞型MR-I (Short-type MR-I)即MR-IS的長度最短而得名;MR-IS mRNA全長75^3ρ,可編碼一個142個氨基酸組成的蛋白質,第75至92位點18個氨基酸形成一疏水跨膜結構區域, 為一種膜蛋白;MR-IS可與轉錄起始因子3 (initiation factor 3)以及具有ADP核糖基化因子(ARF)功能的蛋白(MRIPl)相互作用,其中轉錄因子的高表達可加速細胞進入細胞周期,增加細胞分裂的速度。因而,臨床惡性腫瘤診療中需要這一敏感、有效的標志來輔助診斷、監測病情。該腫瘤標志物目前還沒有市售的抗體及抗原,首先采用分子生物學的方法,獲得 MR-IS的融合蛋白,具有了較好的免疫原性;免疫動物獲得了抗體;為制備檢測MR-IS的試劑盒提供合適的、有保證的原料。常用的測定腫瘤標志物的方法有酶免疫法、放射免疫法、化學發光免疫法等所述的定量測定法等,已在諸多腫瘤標志物中有所應用,如甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA等。但到目前為止,MR-IS作為一種潛在的、有較好的臨床應用前景的腫瘤標志物其測定方法至今未見公開報道。酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay, ELISA)是目前臨床的較認可的一種檢測手段,其快速、操作簡便、試劑穩定、不易污染等特點而得到廣泛應用,適用于腫瘤高危人群的篩查以及腫瘤患者的隨訪測定。

發明內容
本發明的目的在于克服以往腫瘤標志物檢測在臨床應用中的不足,其中特別是在卵巢癌臨床診療中缺乏敏感、有效的腫瘤標志物,提供了一種檢測人MR-IS的試劑盒,更具體涉及一種檢測人MR-IS含量的酶聯免疫測定試劑盒。為實現上述目的,本發明設計一種一種檢測人血漿中MR-IS含量的試劑盒,其特征在于由以下試劑組成
抗人MR-IS抗體預包被板1塊或MR-IS抗原預包被板1塊,抗人MR-IS抗體預包被板中的包被物為濃度為50 500 μ g/ml的抗人MR-IS抗體;MR-IS抗原預包被板中包被物為 1 10 μ g/ml的人MR-IS融合蛋白; 抗人MR-IS抗體酶標記液1瓶;
系列濃度的人MR-IS標準液,即采用如下濃度的人MR-IS融合蛋白作為標準液1500 ng/ml、750 ng/ml、375 ng/ml> 187. 5 ng/ml、93.8 ng/ml、0 ng/ml 各 1 支;
陽性質控液為含人MR-IS融合蛋白的磷酸鹽溶液PBS、陰性質控液為0. 9%的生理鹽水各1支,所述的含人MR-IS融合蛋白的濃度為300 ng/ml ;所述的磷酸鹽溶液PBS的濃度為 0. 01mol/L、pH 值為 7. 4 ;
洗滌液采用2. 42g的三羥基氨基甲烷Tris、i;3ml的0. 1 mol/L的HCl和0. 5 ml的 Tween-20混合而成;
樣品稀釋液為 0.2 g 的 KH2P04、2.9 g 的 Na2HPO4 · 12Η20、8· Og 的 NaCl、0.2g 的 KC1、 0. 5 ml的Tween-20和IOg的牛血清白蛋白BSA混合后加蒸餾水至1000 ml所構成; 封閉液采用上述配方的PH 9. 6的碳酸鹽緩沖液100 ml,再加入Ig BSA混合而成; 底物液為由A液和B液組成,所述的A液由5. 1 ml的0. lmol/L的Na2HPO4和4 mg鄰甲苯胺混合而成,所述的B液由4. 9 ml的0. 05 mol/L的檸檬酸和0. 05 ml的30%的H2R 混合而成;
終止液采用2mol/L的H2SO4,即177. 6 ml蒸餾水中加入22. 4 ml的98%的濃H2SO4而成。所述的抗人MR-IS抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。所述的預包被板采用聚苯乙烯板或聚氯乙烯板或聚氯乙烯酰胺板材質的96微孔板。 所述的抗人MR-IS抗體酶標記液中所采用的酶為辣根過氧化物酶HRP或堿性磷酸酶 ALP。 所述的試劑通過下列步驟制備而成試劑盒
a、人MR-IS融合蛋白的制備抽提卵巢癌患者的血液基因組DNA,以分子克隆的方法, 即從血液基因組DNA中用PCR擴增目的基因人MR-1S,雙酶切后與同樣雙酶切的原核表達載體 pET21a ( + )或 PGEX-4T-1,構建 pET2Ia-MR-IS 或 PGEX-4T-I-MR-IS 重組質粒,轉化大腸桿菌BL21,異丙基硫代半乳糖苷IPTG誘導MR-IS-His融合蛋白或MR-IS-GST融合蛋白表達,親和純化后^festern blot鑒定,MR-IS-His融合蛋白或MR-1S-GST融合蛋白濃縮后,用 0. 01mol/L、pH7. 2的PBS透析活化,冷凍干燥成凍干粉,得到人MR-IS融合蛋白,_20°C保存;
b、抗人MR-IS抗體的制備及純化用上述純化得到的人MR-IS融合蛋白免疫動物,制備特異的高效價的抗人MR-IS的抗體,并使用辛酸法和/或飽和硫酸銨純化;
c、將抗人MR-IS抗體或作為抗原的人MR-IS融合蛋白與包被液混勻后,包被96微孔板,所述的包被液采用由Na2CO3 0. 16g,NaHCO3 0. 29 g加蒸餾水至100 ml制得的pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液;
d、上述包被好的96微孔板,過夜,吹干,再用封閉液封閉,吹干,加一包干燥劑,用鋁箔袋封好,得抗人MR-IS抗體預包被板或MR-IS抗原預包被板;
e、抗人MR-IS抗體酶標記液的制備采用過碘酸鈉標記法試劑以過碘酸標記法制備, 即通過調整所獲得的抗人MR-IS抗體的pH值,再將酶標記于該抗體,然后儲存于10 ml塑料瓶;
f、組合成檢測人MR-IS的酶聯免疫吸附測定試劑盒將上述d步驟中封好的鋁箔袋、上述制備而得的抗人MR-IS抗體酶標記液1瓶;系列濃度的人MR-IS標準液6支;陰性、陽性質控液各1支;樣品稀釋液1瓶;洗滌液1瓶;底物液A液、底物液B液和終止液各1瓶,置于一個紙制的外包裝盒內。步驟b中所述的人MR-IS融合蛋白免疫動物制備特異的高效價的抗人MR-IS的抗體為當制備單抗時為采用將獲得的人MR-IS融合蛋白依次采用雜交瘤方法進行細胞融合、間接ELISA法篩選陽性孔、克隆培養獲得抗人MR-IS單抗;當制備多抗時為采用將獲得的人MR-IS融合蛋白與弗氏佐劑混勻,免疫實驗動物,獲得含多克隆抗體的抗血清。步驟e中采用過碘酸鈉標記法試劑制備抗人MR-IS抗體酶標記液的具體步驟為 (1)將7. 5mg HRP加0. 5ml蒸餾水溶解后;(2)加0. 5ml、0· 06 mol/L的NaIO4,混合后,置于4°C環境,3分鐘;(3)加0. 5ml,0. 16 mol/L乙二醇溶液,室溫30分鐘;⑷加7mg/ml的兔抗人MR-IS抗體IgG 1. Oml或7mg/ml的抗人MR-IS單抗1. Oml ; (5)混合后裝透析袋, 用IOOOmUO. 05 mol/L、pH 9. 5碘酸緩沖液透析過夜;(6)第二天,吸出透析物,加5mg/ml 的NaBH4溶液0. 2ml置冰箱2小時;(7)吸出上述綜合物混合液,加入等體積飽和硫酸銨,冰箱4°C,30分鐘后,離心4000轉/分15分鐘棄上清,沉淀溶于lml、pH7. 4、0. 02 mol/L PBS 溶液中,裝入透析袋,再用1000ml、0. lmol/L、pH7. 4的PBS溶液透析過夜,然后此透析過夜步驟再重復一次;(8)第二天,再離心去除不溶物,即得抗人MR-IS抗體酶標記液,簡稱“酶標抗體IgG”,分裝于10 ml塑料瓶中,4°C保存。所述的過碘酸標記法試劑包括如下試劑
0. 06mol/L 的 NaIO4 0. 13 克 NaIO4 加水至 IOml ; 0. 16mol/L的乙二醇溶液乙二醇0. Iml加水至IOml ; 5mg/ml 的 NaBH4 =NaBH4 5mg 力口水至 Iml ;
0. 05mol/L、pH 9. 5碘酸鹽緩沖液無水碳酸鈉10. 6克加水至500ml成C液;無水碳酸氫鈉16. 8克加水至1000ml成D液,C液16ml和D液:34ml混合后加水至200 ml制備而成;
0. 02mol/L pH7. 4 PBS 溶液用 0. lmol/L 的 pH7. 4 PBS 溶液稀釋而成。本發明與現有技術相比,所建立的試劑盒的檢測結果顯示,對MR-IS濃度可實現定量檢測,檢測結果可反映人MR-IS的變化范圍和發展趨勢,滿足臨床診斷和治療監測需求,且可在120分鐘內完成測試,試劑、方法穩定、操作簡便,靈敏度高、特異性較強,有較好的臨床應用前景。
具體實施例方式本發明提供了一種檢測人血漿中S亞型肌纖維生成調節因子1含量,即MR-IS含量的酶聯免疫吸附測定試劑盒,該試劑盒根據里面包被板的包被物的不同來采用雙抗體夾心法檢測人血漿中的MR-IS含量或采用競爭法來檢測,該試劑盒由以下試劑組成
1、抗人MR-IS抗體預包被板1塊或MR-IS抗原預包被板1塊,抗人MR-IS抗體預包被板中的包被物為濃度為50 500 μ g/ml的抗人MR-IS抗體;MR-IS抗原預包被板中包被物為1 10 μ g/ml的人MR-IS融合蛋白。當采用抗人MR-IS抗體預包被板檢測時采用雙抗體夾心法檢測;當采用MR-IS抗原預包被板檢測時,則采用競爭法檢測;
2、抗人MR-IS抗體酶標記液1瓶;
3、采用如下濃度的人MR-IS融合蛋白作為系列濃度的人MR-IS標準液分別為1500 ng/ml、750 ng/ml、375 ng/ml> 187. 5 ng/ml、93.8 ng/ml、0 ng/ml 各 1 支;
4、陽性質控液為含MR-IS的磷酸鹽溶液PBS、陰性質控液為0.9%的生理鹽水各1支, 其中含人MR-IS融合蛋白的濃度為300 ng/ml ;所述的磷酸鹽溶液PBS的濃度為0. Olmol/ L、pH 值為 7.4 ;
5、洗滌液采用2.42 g的三羥基氨基甲烷Tris、13 ml的0. 1 mol/L的HCl和0. 5 ml 的Tween-20混合而成。使用時加蒸餾水至1000 ml進行稀釋使用;
6、樣品稀釋液為0.2 g 的 KH2P04、2.9 g ^Na2HPO4 ·12Η20,8. Og 的NaCl、0. 2g 的KC1、 0. 5 ml的Tween-20和IOg的牛血清白蛋白BSA,加蒸餾水至1000 ml所制成;
7、封閉液采用上述配方的pH9. 6的碳酸鹽緩沖液100 ml,再加入Ig BSA混合而成;
8、底物液由A液和B液組成,所述的A液由5.1 ml的0. lmol/L的Na2HPO4和4 mg鄰甲苯胺混合而成,所述的B液由4. 9 ml的0. 05 mol/L的檸檬酸和0. 05 ml的30%的H2R 混合而成;
9、終止液采用2mol/L的H2SO4,即177.6 ml蒸餾水中加入22. 4 ml的98%的濃H2SO4 而成。本發明通過以下技術方案實現
主要是利用分子克隆的技術手段從卵巢癌患者的血液基因組DNA中擴增出人MR-IS 的目標基因,與原核載體連接,轉化大腸桿菌,誘導表達人MR-IS融合蛋白。以純化的該人 MR-IS融合蛋白作為抗原,通過免疫動物,得到一對特異性的高效價的抗體。獲得的抗體經分離純化后,若采用抗人MR-IS抗體預包被板,則將酶標記于該對抗體中的一株,將另一株包被到96微孔板中,根據雙抗體夾心法的原理,對人MR-IS進行定量分析測定,得到定量結果,整個測試過程在120分鐘內完成;當采用MR-IS抗原預包被板時,則將人MR-IS融合蛋白作為抗原包被到96微孔板中,并將酶標記于經分離純化后的抗人MR-IS抗體中,采用競爭法檢測,對人MR-IS進行定量分析測定,得到定量結果,整個測試過程在120分鐘內完成。人MR-IS融合蛋白的制備抽提卵巢癌患者的血液基因組DNA,以分子克隆的方法,即從血液基因組DNA中用PCR擴增目的基因人MR-1S,雙酶切后與同樣雙酶切的原核表達載體 pET21a ( + )或 PGEX-4T-1,構建 pET2Ia-MR-IS 或 PGEX-4T-I-MR-IS 重組質粒,轉化大腸桿菌BL21,異丙基硫代半乳糖苷IPTG誘導MR-IS-His融合蛋白或MR-IS-GST融合蛋白表達,親和純化后Wfestern blot鑒定,MR-IS-His融合蛋白或MR-1S-GST融合蛋白濃縮后,用lOmmol/L、pH7. 2的PBS充分透析活化,冷凍干燥成凍干粉,得到人MR-IS融合蛋白,-20°C保存??谷薓R-IS抗體的制備及純化用上述純化得到的人MR-IS融合蛋白免疫實驗動物,制備特異的高效價的抗人MR-IS的抗體,并使用辛酸法和/或飽和硫酸銨純化,所述的抗人MR-IS抗體為單克隆抗體或多克隆抗體,簡稱單抗或多抗,當制備單抗時為采用將獲得的人MR-IS融合蛋白依次采用雜交瘤方法進行細胞融合、間接ELISA法篩選陽性孔、克隆培養獲得抗MR-IS單抗;當制備多抗時為采用將獲得的人MR-IS融合蛋白抗原與弗氏佐劑混勻,免疫實驗動物,獲得含多克隆抗體的抗血清。實施例1
一、先配制如下試劑
1、抗人MR-IS抗體預包被板1塊,抗人MR-IS抗體預包被板中的包被物為濃度為 50-500 μ g/ml 的抗人 MR-IS 抗體;
2、抗人MR-IS抗體酶標記液1瓶;
3、系列濃度的人MR-IS標準液;
4、陽性質控液為含人MR-IS融合蛋白的磷酸鹽溶液PBS、陰性質控液為0.9%的生理鹽水各1支,所述的含人MR-IS融合蛋白的濃度為300 ng/ml ;所述的磷酸鹽溶液PBS的濃度為 0. 01mol/L、pH 值為 7. 4 ;
5、洗滌液三羥基氨基甲烷iTris2. 42 g,0.1 mol/L HCl 13 ml,Tween_20 0.5 ml,加蒸餾水至1000 ml ;
6、樣品稀釋液KH2PO40. 2 g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9 g, NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g, Tween-20 0. 5 ml,牛血清白蛋白BSA 10g,加蒸餾水至1000 ml ;
7、封閉液采用上述配方的pH9. 6的碳酸鹽緩沖液100 ml中加Ig BSA而成;
8、底物液為由A液和B液組成,所述的A液由5.1 ml的0. lmol/L的Na2HPO4和4 mg 鄰甲苯胺混合而成,所述的B液由4. 9 ml的0. 05 mol/L的檸檬酸和0. 05 ml的30%的 H2O2混合而成;
9、終止液2mol/L的H2SO4即177.6 ml蒸餾水中加22. 4ml的濃H2SO4而成。上述試劑中,所涉及的制備如下
(一)、采用如下分子克隆的方法獲得人MR-IS融合蛋白
PCR擴增目的人基因MR-IS 取卵巢癌患者的外周血,抽提基因組DNA ;設計一對特異引物 Pl :5’ -CGGGATCCATGGCGG CGGTGGTAGCTGC-3’ 和 P2 :5’ -CCGCTCGAGTCAGGTCTGCACCCCAG AC-3’,兩對特異引物中分別引入BamH I和Biol I酶切位點,擴增出人MR-IS基因;50μ1 PCR擴增體系由cDNA 1 μ 1, IOXTaq buffer 5 μ 1,2. 5mM dNTP 5 μ 1,上述兩對特異引物各 Ιμ 分別作為上下游引物,Taq酶Iyl再加入去離子水37μ1混合而成,然后以94°C反應5min,再分別采用如下反應條件順序94°C 30s,55°C 30s,72°C 4 依次反應36個循環后,72°C延伸10 min。對擴增產物二%瓊脂糖凝膠電泳后,用膠回收試劑盒進行產物回收。重組質粒取上述3 μ 1 PCR產物與1 μ 1 pUCm_T載體在"Γ4連接酶的作用下,16°C 連接4小時,連接產物轉化入感受態DH5 α細菌中,涂布于有IPTG和X-gal的含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上,其中氨芐青霉素的濃度為100mg/L,37°C,16-24小時,進行藍白斑篩選;挑取白色菌落,接種含氨芐青霉素的LB培養液,37°C培養過夜;用3S Spin質粒小抽試劑提取質粒,并且進行雙酶切鑒定。將雙酶切鑒定正確的重組質粒送上海生工生物公司進行測序,將測序結果進行BLAST同源序列比對。采用pET21a (+)質粒構建原核表達載體, 將測序驗證正確的重組質粒經BamH I和)(h0l I雙酶切后,瓊脂糖凝膠回收目的基因片段,并與用相同雙酶切處理的pET21a (+)質粒在T4連接酶的作用下,16°C連接過夜。轉化大腸桿菌BL21 將該連接產物轉化感受態表達菌BL21中,接種至含濃度為 100mg/L的氨芐青霉素的LB平板,37°C培養過夜;挑選出陽性克隆進行測序鑒定。誘導MR-IS-His融合蛋白表達將上述鑒定正確的陽性克隆菌接種后,擴大培養至對數生長期,利用濃度分別為 0. 1 mmol/L、0. 5mmol/L、l. 0 mmol/LU. 5 mmol/L 的 IPTG, 每個濃度的IPTG分別在溫度^°C、30°C和35°C的條件下誘導0、1、2、3、4和5小時后,6000 r/min離心10 min,收集菌體。用pH 7.4、0. 01mol/L的PBS,懸浮菌體,加入0. 3 mg/ml 溶菌酶。超聲裂解后,加入10 μ g/ml DNase, 12000 Xg離心1 Omin, SDS-PAG電泳分析上清及沉淀中MR-IS-His融合蛋白的表達情況。親和純化后Wfestern blot鑒定將原核表達的MR-lS-His融合蛋白在非變性條件下經NTA柱親和層析純化,用不同濃度的咪唑洗脫目的蛋白,SDS-PAG電泳確定最佳洗脫的咪唑濃度。該最佳濃度下的洗脫產物用0. Olmol/L、pH7. 4的PBS透析。此外,將純化產物和誘導前BL21菌裂解物經SDS-PAG電泳后,電轉移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉過夜; 再分別與鼠抗His抗體、HRP標記的兔抗鼠IgG作用,加化學發光底物,然后X膠片顯影。該MR-IS-His融合蛋白經PEG濃縮后,用0. 01mol/L、pH7. 2的PBS充分透析活化,用BCA (Bicinchoninic Acid)法測定蛋白質的濃度,再經冷凍干燥成凍干粉得最終的人MR-IS融合蛋白——MR-IS-His融合蛋白,分裝,_20°C保存。(二)、抗人MR-IS抗體采用如下方法制備及純化
本例中抗人MR-IS抗體的制備采用多抗制備,即制備抗人MR-IS抗血清,其按常規抗血清制備法。首先,將上述純化的人MR-IS融合蛋白——MR-IS-His融合蛋白自冰箱中取出3 mg,復溫至室溫,溶于0.5ml ,0.01 mol/L的pH 7.4的磷酸緩沖液中,再用生理鹽水稀釋至3ml制成人MR-IS融合蛋白溶液,將其三等份,即每等份為Iml的lmg/ml的人MR-IS 融合蛋白溶液。免疫實驗采用3只新西蘭雄性兔,體重2. 5kg左右,先于每只新西蘭雄性兔的雙后足掌皮下注射弗氏完全佐劑與一等份的人MR-IS融合蛋白溶液的混合物,弗氏完全佐劑人MR-IS融合蛋白溶液(體積比)=1 :1,初次免疫用弗氏完全佐劑與人MR-IS融合蛋白溶液充分混勻至呈“油包水”狀抗原乳化液。再給新西蘭大白兔的頸背部多點及腳墊內注射一等份的人MR-IS融合蛋白溶液,為基礎免疫。每兩周加強一次,共免疫6次。最后一次免疫后8-10天抽血測試效價,效價符合要求后,心臟采血,分離得到抗血清,抗血清再經辛酸一飽和硫酸銨,即50%飽和(NH4)2S04,分步沉淀純化成特異高效價的抗人MR — IS抗體——兔抗人MR-IS抗體IgG??寡宓募兓捎眯了嵋伙柡土蛩徜@法。將上述制得兔抗人MR-IS抗體IgG Iml, 加上 4 ml、0. 06 mol/L、pH 4. 0 的醋酸緩沖液,加 120 μ 1 辛酸,4°C攪拌 30 min, IOOOOrpm 離心30 min,取上清用50倍體積0.02 mol/L、pH 7. 4的PBS作透析液,4°C透析過夜,取出,加等體積的PH 8.0飽和(NH4)2SO4,輕輕攪拌30 min,于4°C 10000 rpm離心20 min,去上清。沉淀溶于Iml的0. 02 mol/L、pH7. 4的PBS溶液中,然后對50倍體積的上述的透析液于4°C透析36小時,換透析液三次,即再重復透析三次。再4°C、8000 rpm離心15 min, 去除不溶物,得最終的抗人MR-IS抗體,也即兔抗人MR-IS抗體IgG。在紫外分光光度計上測定A28tl和A26tl,根據公式(1. 45ΧΑ28(Γ0. 74XA260)X稀釋倍數,計算蛋白濃度即為免疫球蛋白的含量,分裝,-20°C凍存備用。
(三)、抗人MR-IS抗體酶標記液的制備
本例中為酶標兔抗MR-IS抗體IgG交聯物的制備經純化所得的兔抗人MR-IS抗體IgG 與辣根過氧化物酶用改良的過碘酸鈉交聯獲得抗人MR-IS抗體酶標記液,簡稱“酶標抗體 IgG”,具體制備如下
(1)過碘酸鈉標記法試劑的配制
A.0. 06mol/L 的 NaIO4 0. 13 克 NaIO4,加水至 IOml ;
B.0. 16mol/L的乙二醇溶液乙二醇0. Iml加水至IOml ;
C.5mg/ml 的 NaBH4 =NaBH4 5mg 加水至 Iml ;
D.0. 05mol/L的pH 9. 5碘酸鹽緩沖液無水碳酸鈉10. 6克加水至500ml混合而成的 C液;無水碳酸氫鈉16. 8克加水至IOOOml混合而成的D液,取C液16ml+D液3細1,加水至 200ml制備而成;
E.0. 02mol/L 的 pH7. 4 PBS 用 0. lmol/L、ρΗ7· 4 PBS 稀釋而成。(2)過碘酸標記法的操作步驟如下
1、7· 5mg HRP加0. 5ml蒸餾水溶解;2、再加入0. 06 mol/L的NaIO4 0. 5ml,混合后置 4°C,3分鐘;3、加入0. 16mol/L的乙二醇溶液0.5 ml,室溫30分鐘;4、加入7mg/ml的兔抗人MR-IS抗體IgG 1.0ml ;5、混合后裝透析袋,用1000ml、0. 05 mol/L、pH 9.5的碘酸緩沖液透析過夜;6、第二天,吸出透析物,加5mg/ml的NaBH4溶液0. 2ml置冰箱2小時;7、吸出上述綜合物混合液,加入等體積飽和硫酸銨,冰箱4°C,30分鐘后,離心4000轉/分15分鐘棄上清,沉淀溶于lml、pH7.4、0.02 mol/L的PBS中,裝入透析袋,再用1000ml、0. lmol/L、 pH7. 4的PBS透析過夜,然后此透析過夜步驟再重復一次;8、第二天,再離心去除不溶物,即得抗人MR-IS抗體酶標記液,簡稱“酶標抗體IgG”,分裝儲存于IOml塑料瓶中,4°C保存。二、表達和純化的人MR-IS融合蛋白抗原的鑒定
純化后凍干的MR-IS-His融合蛋白干粉用10 100 μ 1,0. 01mol/L、pH7. 2的PBS充分溶解,經SDS-PAG電泳后,考馬斯亮藍染色顯示為單一條帶,證明抗原已純化。同樣蛋白經SDS-PAG電泳后,電轉移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉過夜;再分別與鼠抗His抗體、 HRP標記的兔抗鼠IgG作用,加化學發光底物,然后X膠片顯影。結果顯示可與抗His抗體結合,出現一條明顯的發光條帶,條帶所在的位置為23,000左右,與預期要求的完全符合。 所得MR-IS-His融合蛋白用BCA法測定其蛋白含量以作抗原。三、人MR-IS抗體的鑒定
經辛酸一飽和硫酸銨純化的兔抗人MR-IS抗體IgG,經免疫固定電泳后,鑒定結果 MR-IS為單一沉淀線,而其他蛋白如牛血清白蛋白BSA、血紅蛋白Hb未出現沉淀線。四、標準曲線的制備
取人MR-IS融合蛋白倍比稀釋成系列濃度MR-IS標準液,分別為1500 ng/ml、750 ng/ ml,375 ng/ml、187. 5 ng/ml、93.8 ng/ml、0 ng/ml,作雙抗體夾心法的 ELISA 測定,繪制出標準曲線,標準曲線呈“S”型,線性范圍為93. 8-1500 ng/ml,靈敏度良好,最低檢測限為 93.8 ng/ml。在ELISA夾心法的酶標板上的標準曲線濃度梯度良好,可以滿足臨床測定的需要。五、試劑盒的組裝
100 μ 1的100 μ g/ ml的抗人MR-IS抗體與包被液混勻后包被96微孔板,然后過夜,吹干,加封閉液200 μ 1,封閉2小時吹干后,得抗人MR-IS抗體預包被板,加一包干燥劑, 真空密封包裝于鋁箔袋中;將抗人MR-IS抗體酶標記液儲存于10 ml塑料瓶中;系列濃度的MR-IS標準液6支和陰性、陽性質控液各1支,每支2ml ;50 ml的樣品稀釋液1瓶;40 ml 的洗滌液1瓶;底物液A液、B液和終止液各1瓶,置于一個紙制的外包裝盒內制成試劑盒。 所述的包被液采用由Na2CO3 0. 16g,NaHCO3 0. 29 g加蒸餾水至100 ml制得的pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液。六、采用上述制備的試劑盒,采用雙抗體夾心法檢測人血漿中MR-IS含量的操作步驟
a、取出抗人MR-IS抗體預包被板,采用洗滌液洗滌;
b、再在抗人MR-IS抗體預包被板加入樣品,即在抗人MR-IS抗體預包被板的不同微孔中分別加入待測血漿、系列濃度的人MR-IS標準液、陽性、陰性質控液各0. Iml,以37°C反應 2小時后,采用洗滌液洗滌;
C、加入0.1 ml經酶標稀釋液稀釋過的酶標抗體IgG,37°C、1小時后,采用洗滌液洗滌;所述的經酶標稀釋液稀釋過的酶標抗體IgG為上述所制得的酶標抗體IgG采用酶標稀釋液稀釋,其稀釋比例為酶標抗體IgG 酶標稀釋液稀釋的體積比為1:2000 ;
d、再加入0.Iml底物液,該底物液中A液與B液為1 :1等量配比,37°C,30分鐘;
e、加入0.05 ml 2mol/L的H2SO4,終止反應;
f、490nm測OD值,采用Tecan酶免儀測試,如果測得OD > 2. 5,則需要將b步驟中的樣品采用樣品稀釋液以體積比1 10進行稀釋后,重新進行ITf步驟;
g、計算MR-IS濃度值。實施例2
一、先配制如下試劑
UMR-IS抗原預包被板1塊,MR-IS抗原預包被板中包被物是作為抗原的廣5 μ g/ml 的人MR-IS融合蛋白;
2、抗人MR-IS抗體酶標記液1瓶;
3、系列濃度的人MR-IS標準液;
4、陽性質控液含人MR-IS融合蛋白的磷酸鹽溶液PBS;陰性質控液0.9%的生理鹽水,所述的含人MR-IS融合蛋白的濃度為300 ng/ml ;所述的磷酸鹽溶液PBS的濃度為 0. 01mol/L、pH 值為 7. 4 ;
5、洗滌液三羥基氨基甲烷iTris2. 42 g,0. 1 mol/L HCl 13 ml,Tween_20 0.5 ml,加蒸餾水至1000 ml ;
6、樣品稀釋液KH2PO40. 2 g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9 g, NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g, Tween-20 0. 5 ml,牛血清白蛋白BSAlOg,加蒸餾水至1000 ml ;
7、封閉液pH9. 6的碳酸鹽緩沖液100 ml中加Ig BSA而成;
8、底物液為由A液和B液組成,所述的A液由5.1 ml的0. lmol/L的Na2HPO4和4 mg 鄰甲苯胺混合而成,所述的B液由4. 9 ml的0. 05 mol/L的檸檬酸和0. 05 ml的30%的 H2O2混合而成;
9、終止液2mol/L的H2SO4即177.6 ml蒸餾水中加22. 4ml的濃H2SO4而成。上述試劑中,涉及的制備方法如下(一)、采用如下分子克隆的方法獲得人MR-IS融合蛋白
PCR擴增目的人基因MR-IS 取卵巢癌細胞株SK0V3,培養細胞至對數期,抽提其中的基因組 DNA ;設計一對特異引物 Pl :5,-CGGGATCCATGGCGG CGGTGGTAGCTGC-3,和 P2 :5,-C CGCTCGAGTCAGGTCTGCACCCCAGAC-3,,兩對引物分別引入BamH I和Xhol I酶切位點,擴增出 MR-IS 基因。50 μ 1 PCR 擴增體系為由 cDNA 1 μ 1,IOXTaq buffer 5μ 1,2. 5 mmol/L dNTP 5 μ 1,上述兩對特異引物各1μ 1分別作為上下游引物,Taq酶1 μ 1再加入去離子水37 μ 1混合而成,然后以94°C反應5 min ;然后再分別采用94°C 30 s、55°C 30 s、72°C 45 s的條件依次順序反應36個循環后,72°C延伸10 min。對擴增產物,洲瓊脂糖凝膠電泳后,用膠回收試劑盒進行產物回收。重組質粒取上述3 μ 1 PCR產物與1 μ 1 pUCm_T載體在"Γ4連接酶的作用下,16°C 連接4小時。連接產物轉化入感受態DH5 α細菌中,涂布于有IPTG和X-gal的含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上,其中含氨芐青霉素的濃度為100mg/L,37°C,16-M小時,進行藍白斑篩選。挑取白色菌落,接種含氨芐青霉素的LB培養液,含氨芐青霉素的濃度為100mg/L, 37°C培養過夜。用3S Spin質粒小抽試劑提取質粒,并且進行雙酶切鑒定。將雙酶切鑒定正確的重組質粒送上海生工生物公司進行測序,將測序結果進行BLAST同源序列比對。利用PGEX-4T-1質粒構建原核表達載體,測序驗證正確的重組質粒經BamH I和Biol I雙酶切后,瓊脂糖凝膠回收目的基因片段,并與用相同酶切處理的PGEX-4T-1質粒在T4連接酶的作用下,16°C連接過夜。轉化大腸桿菌BL21:將該連接產物轉化感受態表達菌BL21中,接種至含氨芐青霉素的LB平板,含氨芐青霉素的濃度為100mg/L,37°C培養過夜。挑出陽性克隆進行測序鑒定。誘導MR-IS-GST融合蛋白表達將上述鑒定正確的陽性克隆菌接種后,擴大培養至對數生長期,采用0. Immol/L、0. 5mmol/L、l. Ommol/LU. 5 mmol/L終濃度的IPTG,每個濃度的IPTG分別在28 V、30 V和35°C的溫度條件下,誘導0、1、2、3、4和5小時后,6000 r/min 離心10 min,收集菌體。用pH 7. 4、0. 01mol/L PBS,懸浮菌體,加入0. 3 mg/ml溶菌酶。超聲裂解后,加入10 μ g/m L DNase,12 OOOXg離心10 min, SDS-PAG電泳分析上清及沉淀中融合蛋白的表達情況。親和純化后Wfestern blot鑒定將原核表達的MR-1S-GST融合蛋白在非變性條件下經NTA柱親和層析純化,用不同濃度的咪唑洗脫目的蛋白,SDS-PAG電泳確定最佳洗脫的咪唑濃度。該濃度下的洗脫產物用0. Olmol/L、pH7. 4的PBS透析。此外,將純化產物和誘導前BL21菌裂解物經SDS-PAG電泳后,電轉移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉過夜;再分別與鼠抗GST抗體、HRP標記的兔抗鼠IgG作用,加化學發光底物,然后X膠片顯影。該MR-IS-GST融合蛋白經PEG濃縮后,用0. 01mol/L、pH7. 2的PBS充分透析活化,用BCA (Bicinchoninic Acid)法測定蛋白質的濃度,再經冷凍干燥成凍干粉,得最終的人MR-IS融合蛋白——MR-IS-GST融合蛋白,分裝_20°C保存。(二)、人MR-IS抗體采用如下方法制備及純化
本例中人MR-IS抗體的制備采用單克隆體,即抗人MR-IS單克隆抗體的制備將取上述MR-IS-GST融合蛋白凍干粉自冰箱中取出,復溫至室溫,稱取0. :3mg,溶解于3ml生理鹽水中作為MR-IS抗原,并分成三等份,每一等份為100μ g/ml的MR-IS抗原1ml。將免疫8周齡,體重20克左右的BALB/c小鼠3只。首次每只小鼠取一等份MR-IS抗原加弗氏完全佐劑腹腔注射,MR-IS抗原與弗氏佐劑的體積比為1:1。間隔兩周,第二次同樣MR-IS抗原劑量加弗氏不完全佐劑腹腔注射,其體積比=1 :1。此后間隔三周。第三次MR-IS抗原 100 μ g/只,不加弗氏佐劑直接溶解于Iml生理鹽水N. S中腹腔注射,在第三次免疫一周后, 取小鼠眼眶血以間接ELISA法測定抗體效價。經三次免疫后小鼠休息一個月,取抗體效價高的小鼠,細胞融合前三天,腹腔注射50yg MR-IS抗原、尾靜脈注射50 μ g MR-IS抗原以加強免疫。于加強免疫后三天,通過無菌術取免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞,細胞比例為5:1,在pH7. 8-8. 0的50%PEG4000的作用下,按常規方法進行細胞融合。融合細胞以 RPMI1640液洗滌一次去除PEG4000后,重新懸浮于HAT選擇性培養液中。接種于預置飼養細胞層的96微孔細胞培養板中,每孔接種1 X IO5個細胞。置37°C、5%ω2的細胞培養箱中培養10-13天。期間顯微境觀察雜交瘤細胞生長情況,當細胞克隆長至一個中倍鏡視野大小時,取其培養上清液采用間接ELISA法對雜交瘤細胞進行篩選,篩選出的陽性孔,用有限稀釋法進行克隆化培養,經過3-5次克隆化培養,獲得了穩定分泌抗人MR-IS單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將已建株的單克隆雜交瘤細胞注入預先用硅膠H處理過的BALB/c小鼠腹腔,待腹部膨大時抽取腹水。3000rpm離心30min,取上清液加入1/1000 (w/v)NaN3后,4°C 保存待純化鑒定。單克隆抗體腹水的純化采用辛酸法。Iml腹水加aiil 0. 06mol/L pH4. 0的醋酸緩沖液,用lmol/L HCl調至pH4. 8,加33 μ 辛酸,搖勻。于室溫繼續攪拌30min,再4°C、 IOOOOrpm離心30min,取上清用50倍體積的0. 02mol/L、pH7. 4的PBS作為透析液,4°C透析 24小時,換透析液兩次重復上述步驟。上清用BCA法測定蛋白質的濃度即為免疫球蛋白的含量,分裝,得最終的抗人MR-IS單克隆抗體,簡稱“抗人MR-IS單抗”,-20°C凍存備用。(三)、抗人MR-IS抗體酶標記液的制備
本例中為酶標抗MR-IS單克隆抗體交聯物的制備經純化所得的抗人MR-IS單抗與辣根過氧化物酶用改良的過碘酸鈉交聯獲得抗人MR-IS抗體酶標記液,簡稱“酶標抗體IgG”。( 1)過碘酸鈉標記法試劑的配制
A.0. 06mol/L 的 NaIO4 0. 13 克 NaIO4,加水至 IOml ;
B.0. 16mol/L的乙二醇溶液乙二醇0. Iml加水至IOml ;
C.5mg/ml 的 NaBH4 =NaBH4 5mg 加水至 Iml ;
D.0. 05mol/L、pH 9. 5碘酸鹽緩沖液無水碳酸鈉10. 6克加水至500ml成C液;無水碳酸氫鈉16. 8克加水至IOOOml成D液,取C液16ml+D液3細1,加水至200 ml制備而成;
E.0. 02mol/L ρΗ7· 4 PBS:用 0. lmol/L 的 ρΗ7· 4 PBS 稀釋而成。(2)過碘酸標記法的操作步驟
l、7.5mg HRP 加 0.5ml 蒸餾水溶解;2、加 0. 5ml、0· 06 mol/L 的 NaIO4,混合后置 4°C, 3分鐘;3、加0. 5ml,0. 16 mol/L乙二醇溶液,室溫30分鐘;4、加7mg/ml的抗人MR-IS單抗 1.0ml ;5、混合后裝透析袋,用1000ml、0. 05 mol/L、pH 9.5碘酸緩沖液透析過夜;6、第二天,吸出透析物,加5mg/ml的NaBH4溶液0. 2ml置冰箱2小時;7、吸出上述綜合物混合液, 加入等體積飽和硫酸銨,冰箱4°C,30分鐘后,離心4000轉/分15分鐘棄上清,沉淀溶于 lml、pH7. 4、0. 02 mol/L PBS 中,裝入透析袋,再用 1000ml、0. lmol/L、pH7. 4 的 PBS 透析過
13夜,然后此透析過夜步驟再重復一次;8、第二天,再離心去除不溶物,即得抗人MR-IS抗體酶標記液,簡稱“酶標抗體IgG”,分裝塑料瓶中,4°C保存。二、表達和純化的MR-IS融合蛋白抗原鑒定
純化后凍干的MR-IS-GST融合蛋白干粉用10 100 μ 1,0. 01mol/L、pH7. 2的PBS充分溶解,經SDS-PAG電泳后,考馬斯亮藍染色顯示為單一條帶,證明抗原已純化。同樣蛋白經SDS-PAG電泳后,電轉移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉過夜;再分別與鼠抗GST抗體、 HRP標記的兔抗鼠IgG作用,加化學發光底物,然后X膠片顯影。結果顯示可與抗GST抗體結合,出現一條明顯的發光條帶,條帶所在的位置為49,000左右,與預期要求的完全符合。 所得融合蛋白用BCA法測定蛋白含量以作抗原。三、抗人MR-IS單抗的鑒定
經辛酸一飽和硫酸銨純化的抗人MR-IS單抗,經免疫固定電泳后,鑒定結果MR-IS為單一沉淀線,而其他蛋白如牛血清白蛋白BSA、血紅蛋白Hb未出現沉淀線。四、標準曲線的制備
取人MR-IS融合蛋白倍比稀釋成系列濃度的MR-IS標準液,分別為1500 ng/ml、750 ng/ml、375 ng/ml、187. 5 ng/ml、93.8 ng/ml、0 ng/ml,作競爭法的 ELISA測定,繪制出標準曲線,標準曲線呈” L ”型,線性范圍為93. 8-750 ng/ml,靈敏度良好。最低檢測限為93. 8 ng/ ml。在ELISA夾心法的酶標板上的標準曲線濃度梯度良好,也可以滿足臨床測定的需要。五、試劑盒的組裝
取100 μ 1的10 μ g/ ml的MR-IS抗原與包被液混勻后包被96微孔板,過夜,吹干, 加封閉液200 μ 1,封閉2小時,吹干后,得MR-IS抗原預包被板,加一包干燥劑,用鋁箔袋封好,其余步驟同實施例1。所述的包被液采用由Na2CO3 0. 16g,NaHCO3 0. 29 g加蒸餾水至100 ml制得的pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液。六、采用上述制備的試劑盒,競爭法檢測MR-IS含量的操作步驟
a、取MR-IS抗原預包被板,采用洗滌液洗滌;
b、再在MR-IS抗原預包被板加入樣品,即在MR-IS抗原預包被板的不同微孔中分別加入待測血漿、系列濃度的人MR-IS標準液、陽性、陰性質控液各0. lml,37°C,2小時后,采用洗滌液洗滌;
C、加入0. 1 ml經酶標稀釋液稀釋過的酶標單抗,37°C 1小時后,采用洗滌液洗滌;所述的經酶標稀釋液稀釋過的酶標單抗為上述所得的酶標抗體IgG采用酶標稀釋液稀釋,其稀釋比例為1:2000 ;
d、再加入0.1 ml底物液,該底物液中A液與B液為1 :1等量配比,37°C,30分鐘;
e、再加入0.05 ml、2mol/L的H2SO4,終止反應;
f、490nm測OD值,采用Tecan酶免儀,如果測得OD > 2. 5,則需要將b步驟中的樣品采用樣品稀釋液以體積比1 10進行稀釋后,重新進行ITf步驟;
g、計算MR-IS濃度值。
權利要求
1.一種檢測人血漿中MR-IS含量的試劑盒,其特征在于由以下試劑組成抗人MR-IS抗體預包被板1塊或MR-IS抗原預包被板1塊,抗人MR-IS抗體預包被板中的包被物為濃度為50 500 μ g/ml的抗人MR-IS抗體;MR-IS抗原預包被板中包被物為 1 10 μ g/ml的人MR-IS融合蛋白;抗人MR-IS抗體酶標記液1瓶;系列濃度的人MR-IS標準液,即采用如下濃度的人MR-IS融合蛋白作為標準液1500 ng/ml、750 ng/ml、375 ng/ml> 187. 5 ng/ml、93.8 ng/ml、0 ng/ml 各 1 支;陽性質控液為含人MR-IS融合蛋白的磷酸鹽溶液PBS、陰性質控液為0. 9%的生理鹽水各1支,所述的含人MR-IS融合蛋白的濃度為300 ng/ml ;所述的磷酸鹽溶液PBS的濃度為 0. 01mol/L、pH 值為 7. 4 ;洗滌液采用2. 42g的三羥基氨基甲烷Tris、i;3ml的0. 1 mol/L的HCl和0. 5 ml的 Tween-20混合而成;樣品稀釋液為 0.2 g 的 KH2P04、2.9 g 的 Na2HPO4 · 12Η20、8· Og 的 NaCl、0.2g 的 KC1、 0. 5 ml的Tween-20和IOg的牛血清白蛋白BSA混合后加蒸餾水至1000 ml所構成;封閉液采用上述配方的PH 9. 6的碳酸鹽緩沖液100 ml,再加入Ig BSA混合而成;底物液為由A液和B液組成,所述的A液由5. 1 ml的0. lmol/L的Na2HPO4和4 mg鄰甲苯胺混合而成,所述的B液由4. 9 ml的0. 05 mol/L的檸檬酸和0. 05 ml的30%的H2R 混合而成;終止液采用2mol/L的H2SO4,即177. 6 ml蒸餾水中加入22. 4 ml的98%的濃H2SO4而成。
2.按權利要求1所述的一種檢測人血漿中MR-IS含量的試劑盒,其特征在于所述的抗人MR-IS抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
3.按權利要求1所述的一種檢測人血漿中MR-IS含量的試劑盒,其特征在于所述的預包被板采用聚苯乙烯板或聚氯乙烯板或聚氯乙烯酰胺板材質的96微孔板。
4.按權利要求1所述的一種檢測人血漿中MR-IS含量的試劑盒,其特征在于所述的抗人MR-IS抗體酶標記液中所采用的酶為辣根過氧化物酶HRP或堿性磷酸酶ALP。
5.一種檢測人血漿中MR-IS含量的試劑盒的制備方法,其特征在于將權利要求1所述的試劑通過下列步驟制備而成試劑盒a、人MR-IS融合蛋白的制備抽提卵巢癌患者的血液基因組DNA,以分子克隆的方法, 即從血液基因組DNA中用PCR擴增目的基因人MR-1S,雙酶切后與同樣雙酶切的原核表達載體 pET21a ( + )或 PGEX-4T-1,構建 pET2Ia-MR-IS 或 PGEX-4T-I-MR-IS 重組質粒,轉化大腸桿菌BL21,異丙基硫代半乳糖苷IPTG誘導MR-IS-His融合蛋白或MR-IS-GST融合蛋白表達,親和純化后^festern blot鑒定,MR-IS-His融合蛋白或MR-1S-GST融合蛋白濃縮后,用 0. 01mol/L、pH7. 2的PBS透析活化,冷凍干燥成凍干粉,得到人MR-IS融合蛋白,_20°C保存;b、抗人MR-IS抗體的制備及純化用上述純化得到的人MR-IS融合蛋白免疫動物,制備特異的高效價的抗人MR-IS的抗體,并使用辛酸法和/或飽和硫酸銨純化;c、將抗人MR-IS抗體或作為抗原的人MR-IS融合蛋白與包被液混勻后,包被96微孔板,所述的包被液采用由Na2CO3 0. 16g,NaHCO3 0. 29 g加蒸餾水至100 ml制得的pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液;d、上述包被好的96微孔板,過夜,吹干,再用封閉液封閉,吹干,加一包干燥劑,用鋁箔袋封好,得抗人MR-IS抗體預包被板或MR-IS抗原預包被板;e、抗人MR-IS抗體酶標記液的制備采用過碘酸鈉標記法試劑以過碘酸標記法制備, 即通過調整所獲得的抗人MR-IS抗體的pH值,再將酶標記于該抗體,然后儲存于10 ml塑料瓶;f、組合成檢測人MR-IS的酶聯免疫吸附測定試劑盒將上述d步驟中封好的鋁箔袋、上述制備而得的抗人MR-IS抗體酶標記液1瓶;系列濃度的人MR-IS標準液6支;陰性、陽性質控液各1支;樣品稀釋液1瓶;洗滌液1瓶;底物液A液、底物液B液和終止液各1瓶,置于一個紙制的外包裝盒內。
6.按權利要求5所述的一種檢測人血漿中MR-IS含量的試劑盒的制備方法,其特征在于步驟b中所述的人MR-IS融合蛋白免疫動物制備特異的高效價的抗人MR-IS的抗體為 當制備單抗時為采用將獲得的人MR-IS融合蛋白依次采用雜交瘤方法進行細胞融合、間接ELISA法篩選陽性孔、克隆培養獲得抗人MR-IS單抗;當制備多抗時為采用將獲得的人 MR-IS融合蛋白與弗氏佐劑混勻,免疫實驗動物,獲得含多克隆抗體的抗血清。
7.按權利要求5所述的一種檢測人血漿中MR-IS含量的試劑盒的制備方法,其特征在于步驟e中采用過碘酸鈉標記法試劑制備抗人MR-IS抗體酶標記液的具體步驟為(1) 將7. 5mg HRP加0. 5ml蒸餾水溶解后;(2)加0. 5ml、0. 06 mol/L的NaIO4,混合后,置于 4°C環境,3分鐘;(3)加0. 5ml,0. 16 mol/L乙二醇溶液,室溫30分鐘;(4)加7mg/ml的兔抗人MR-IS抗體IgG 1.0ml或7mg/ml的抗人MR-IS單抗1. Oml ; (5)混合后裝透析袋,用 IOOOmUO. 05 mol/L、pH 9.5碘酸緩沖液透析過夜;(6)第二天,吸出透析物,加5mg/ml的 NaBH4溶液0. 2ml置冰箱2小時;(7)吸出上述綜合物混合液,加入等體積飽和硫酸銨,冰箱 4°C,30分鐘后,離心4000轉/分15分鐘棄上清,沉淀溶于lml、pH7. 4、0. 02 mol/L PBS溶液中,裝入透析袋,再用1000ml、0. lmol/L、pH7. 4的PBS溶液透析過夜,然后此透析過夜步驟再重復一次;(8)第二天,再離心去除不溶物,即得抗人MR-IS抗體酶標記液,簡稱“酶標抗體IgG”,分裝于10 ml塑料瓶中,4°C保存。
8.按權利要求5或7所述的一種檢測人血漿中MR-IS含量的試劑盒的制備方法,其特征在于所述的過碘酸標記法試劑包括如下試劑、0. 06mol/L 的 NaIO4 0. 13 克 NaIO4 加水至 IOml ;、0. 16mol/L的乙二醇溶液乙二醇0. Iml加水至IOml ;5mg/ml 的 NaBH4 =NaBH4 5mg 力口水至 Iml ;、0. 05mol/L、pH 9. 5碘酸鹽緩沖液無水碳酸鈉10. 6克加水至500ml成C液;無水碳酸氫鈉16. 8克加水至IOOOml成D液,C液16ml和D液:34ml混合后加水至200 ml制備而成;、0. 02mol/L pH7. 4 PBS 溶液用 0. lmol/L 的 pH7. 4 PBS 溶液稀釋而成。
全文摘要
本發明屬于生物醫藥檢驗技術領域,具體涉及一種檢測S亞型人肌纖維生成調節因子1含量的酶聯免疫吸附測定試劑盒,由以下試劑組成抗人MR-1S抗體預包被板1塊或MR-1S抗原預包被板1塊;抗人MR-1S抗體酶標記液1瓶;系列濃度的人MR-1S標準液;陽性質控液、陰性質控液、生理鹽水各1支;洗滌液;樣品稀釋液;封閉液;底物液;終止液。本發明與現有技術相比,所建立的試劑盒的檢測結果顯示,對MR-1S濃度可實現定量檢測,檢測結果可反映人MR-1S的變化范圍和發展趨勢,滿足臨床診斷和治療監測需求,且可在120分鐘內完成測試,試劑、方法穩定、操作簡便,靈敏度高、特異性較強,有較好的臨床應用前景。
文檔編號G01N33/574GK102368070SQ20111018362
公開日2012年3月7日 申請日期2011年7月1日 優先權日2011年7月1日
發明者盧仁泉, 郭林 申請人:上海永昶醫學診斷用品有限公司, 復旦大學附屬腫瘤醫院
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