一種檢測雜色曲霉素的酶電極及其制備與用途的制作方法

文檔序號:6003896
專利名稱:一種檢測雜色曲霉素的酶電極及其制備與用途的制作方法
技術領域
本發明屬于生物傳感器領域,涉及一種酶電極以及由該酶電極組裝的生物傳感器,以及該酶電極與生物傳感器的用途。
背景技術
普魯士藍(Prussian blue, PB)是一種有效的氧化還原媒介體,PB膜修飾電極具有優良的電化學可逆性、極高的穩定性及電催化性能,它對H2A具有高靈敏的電催化作用, 被稱為“人工過氧化物酶”。PB修飾電極能有效降低檢測H2A的過電位,避免溶液中共存物質對測定產生的干擾。電流型氧化酶生物傳感器通常是通過檢測酶反應的產物H2O2來達到檢測底物的目的,因此,使得基于PB修飾膜組裝的氧化酶生物傳感器在臨床、環境和食品分析中發展迅速。但PB修飾電極在中性偏堿性溶液中極不穩定、易溶解脫落,限制了它在生物傳感器中的廣泛應用。因此制備一種具有耐堿性環境的PB修飾電極具有重要意義。雜色曲霉素(Sterigmatocystin,ST)是一種致癌致畸的真菌毒素,是黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)的合成前體,二者結構相似,都是由雙呋喃環與氧雜蒽醌連接組成。ST是國際癌癥研究機構劃分的2B類致癌物質,與肺癌、肝癌、胃癌密切相關。目前, 測定ST的方法主要有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、液質聯用法(LC-MS)、 氣質聯用法(GC-MS)和偶聯質譜法(Tandem MS)等(Versilovskis, A.,De Saeger, S. Sterigmatocystin Occurrence in foodstuffs and analytical methods—An overview. Molecular Nutrition & Food Research, 2010,54,136-147.)。這些方法各有其特點, 但有的需要使用昂貴的儀器,有的操作繁瑣,有的樣品前處理麻煩,從而難于實現實際樣品中ST含量的快速檢測。黃曲霉毒素氧化酶(Aflatoxin-Oxidase,AF0)對ST具有催化作用,以AFO為分子識別元件的酶生物傳感器對ST的檢測具有操作簡單,檢測迅速,不用繁瑣的樣品前處理等優點。在報道的組裝黃曲霉毒素解毒酶修飾電極對ST的檢測中(Yao,DS., Cao, H. , Wen, SM. , et al. A novel biosensor for sterigmatocystin constructed by multi-walled carbon nanotubes (MffNT) modified with aflatoxin-detoxifizyme (ADTZ). Bioelectrochemistry, 2006,68,U6-133·),其檢測限為 41. 6 ng/mL,檢測電位為400mV。但該類酶生物傳感器的檢測靈敏度有待提高,穩定性和重現性有待改善,以及可進一步優化檢測電位以提高酶電極的選擇性和抗干擾能力。

發明內容
本發明的目的在于針對普魯士藍修飾電極在中性偏堿性溶液中的不穩定性,提供一種新型的檢測雜色曲霉素的酶電極及其制備方法,提高其對堿性環境耐受性。本發明的另一目的是以耐堿性雜合普魯士藍修飾電極為基底電極固定黃曲霉毒素氧化酶,實現對雜色曲霉素的高靈敏、高選擇性的快速檢測。本發明所述的一種檢測雜色曲霉素的酶電極,包括金電極;以及組裝在金電極上的普魯士藍雜合層;所述的普魯士藍是由鐵氰化鉀和氯化鐵溶液電沉積而成;所述的普魯士藍雜合層是由以下方法組裝在金電極上的提供由L-半胱氨酸單體通過自組裝的方式在金電極表面形成的L-半胱氨酸自組裝膜;提供含有鐵氰化鉀、氯化鐵以及殼聚糖的混合溶液;以及將上述混合溶液中產生的普魯士藍電沉積在金電極的L-半胱氨酸自組裝膜上, 形成普魯士藍雜合電極。本發明所述的自組裝功能膜可以選用硫醇分子、L-半胱氨酸,或其他的一些含有巰基的分子在金電極表面三維組裝過程所形成的一類熱力學穩定、能量最低的有序膜。本發明優選的是L-半胱氨酸自組裝功能膜,它具有促進電子轉移作用以及對某些分子或離子具有高選擇性的識別功能,使其具有一定抗干擾能力。本發明所述的一種檢測雜色曲霉素的酶電極的制備方法,包括以下步驟
A)L-半胱氨酸自組裝修飾金電極的制備將L-半胱氨酸單體通過自組裝的方式組裝在金電極表面,形成L-半胱氨酸自組裝膜,得到L-半胱氨酸自組裝膜功能化修飾的金電極;
B)雜合普魯士藍電沉積液的制備配制含有鐵氰化鉀、氯化鐵的溶液,與殼聚糖相混合,形成雜合普魯士藍電沉積液;
C)普魯士藍雜合電極的制備將L-半胱氨酸修飾的金電極浸入雜合普魯士藍電沉積液中,采用電化學恒電位電沉積的方法,將沉積液中的普魯士藍電沉積在金電極的L-半胱氨酸自組裝膜上,形成普魯士藍雜合電極。根據本發明所述的酶電極的制備方法的進一步特征,所述步驟A包括以下具體步驟將金電極清洗干凈;配制0.0廣0.05 mol/L的L-半胱氨酸溶液作為L-半胱氨酸自組裝液;將處理好的金電極插入到L-半胱氨酸自組裝液中低溫自組裝12-M小時(時間需要具體范圍),制得L-半胱氨酸修飾的金電極。根據本發明所述的酶電極的制備方法的進一步特征,所述步驟B包括以下具體步驟配制由 2. 5 mmol/L K3Fe(CN)6 + 2. 5 mmol/L FeCl3 + 0. 1 mol/L KCl + 0. 1 mol/L HCl 充分溶解后組成的混合液;加入殼聚糖,使其濃度在0. 019Γ0. 05%之間;將上述溶液混勻后即為雜合普魯士藍電沉積工作液。根據本發明所述的酶電極的制備方法的進一步特征,所述步驟C包括以下具體步驟將步驟A中所制得的L-半胱氨酸修飾的金電極插入到步驟B中所制備的雜合普魯士藍電沉積液中,恒電位下進行電沉積,然后轉入0. 1 mol/L HCl + 0.1 mol/L KCl混合溶液中進行循環伏安掃描,取出電極用二次蒸餾水小心沖洗后烘干,然后置于0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl緩沖液中進行電活化,制得普魯士藍雜合電極。根據本發明所述的普魯士藍雜合電極可以應用于制備生物傳感器。本發明提供了一種檢測雜色曲霉素的生物傳感器,所述生物傳感器包括本發明所述的酶電極。本發明所述的一種檢測雜色曲霉素的生物傳感器的制備方法,是以碳納米管為電子傳遞體,均勻分散在殼聚糖溶液中,形成碳納米管-殼聚糖功能膜,將黃曲霉毒素氧化酶包埋在碳納米管-殼聚糖功能膜中,再滴加于本發明所述的普魯士藍雜合電極表面,低溫組裝過夜,即制得用于檢測雜色曲霉素的生物傳感器。根據本發明所述的檢測雜色曲霉素的生物傳感器的制備方法的進一步特征,所述的碳納米管是采用經強酸或強氧化劑活化處理后洗至中性烘干的多壁碳納米管或者單壁碳納米管。根據本發明所述的檢測雜色曲霉素的生物傳感器的制備方法的進一步特征,所述殼聚糖溶液是通過以下方法制備的用乙酸溶解殼聚糖粉末,制備成濃度為0. 19Γ1. 5%的殼聚糖溶液,調節殼聚糖溶液的PH值為5. 5,置于低溫保存備用;所述碳納米管溶于殼聚糖溶液,混勻,制得0. Γ1. 5 mg/mL的碳納米管-殼聚糖溶液。本發明所述的電子傳遞體可選用有機分子或高分子電子傳遞體。有機分子電子傳遞體主要有二茂鐵及其衍生物、有機染料、醌及其衍生物、離子液體等;高分子電子傳遞體主要有碳納米管、金屬納米顆粒、變價過渡金屬離子型和有機氧化還原型等氧化還原聚合物等。本發明優選的電子傳遞體是活化后的碳納米管,可以采用強酸或強氧化劑進行活化處理。本發明中將碳納米管分散在殼聚糖溶液中,也可以選用溶膠凝膠(sol-gel)及其復合物、明礬以及一些其他具有成膜能力的化合物代替殼聚糖。根據本發明所述方法制備的生物傳感器可應用于檢測真菌毒素等用途。本發明所述的酶生物傳感器是以黃曲霉毒素氧化酶為分子識別元件來檢測雜色曲霉素的,其原理是黃曲霉毒素氧化酶催化ST反應產生了 H2O2,普魯士藍修飾電極對酶促反應產生的H2A具有很好的電催化還原作用,碳納米管對這一反應具有促進作用,通過檢測H2O2,就可以達到檢測底物雜色曲霉素的作用。由于該電極具有較高的選擇性和靈敏性, 能滿足實際樣品中雜色曲霉素的定量檢測。與現有技術相比,本發明所述的酶電極與生物傳感器具有如下有益效果
(1)本發明制備的普魯士藍雜合電極具有很好的堿性環境耐受性,克服了傳統普魯士藍修飾電極在中性和弱堿性不穩定,易脫落的缺點。該雜合普魯士藍修飾電極為組裝一系列酶生物傳感器提供了一個很好的反應平臺。(2)本發明制備的酶生物傳感器對ST具有更靈敏的響應,響應時間快,為8s。在 0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0.1 mol/L KCl 的電解緩沖液中,對ST 的檢測限為 2 ng/mL ; 線性范圍寬,為10 ng/mL 950 ng/mL。(3)本發明制備的酶生物傳感器具有很好的重現性和穩定性;檢測電位低,可在 OV檢測,極大地提高了檢測的選擇性;同時由于普魯上藍雜合膜的引入,極大地提高了酶電極的抗干擾能力;實際樣品只需經過簡單的預處理即可用組裝的生物傳感器檢測,其回收率在91. 49Γ107. 3%之間,相對標準偏差在2. 1-5. 4%之間,能滿足實際樣品檢測需要。(4)本發明所述的電極制備過程簡單,性能優良;組裝的用于檢測ST的酶生物傳感器使用簡單,省時、省力,檢測迅速方便,是一種理想的檢測真菌毒素的替代方法。


圖1為普魯士藍修飾電極在pH8. 0的PBS中的循環伏安曲線圖;其中,圖中曲線a 為PB-CS/Cys/Au修飾電極;曲線b為PB/Au修飾電極。掃描速度50mV/s。圖 2 為 CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au 修飾電極在含不同濃度 ST 的 pH6. 5 的 PBS 中的循環伏安曲線圖;其中,圖中曲線從a到c的變化對應ST的濃度分別是0 ng/mL,20 ng/mL, 40 ng/mL。掃描速度50mV/s。圖3為CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修飾電極檢測ST的電流-時間曲線。檢測電位0V ;檢測體積10mL ;攪拌速度50r/min。
具體實施例方式實施例一用于檢測ST的酶生物傳感器的制備
(一)、儀器與試劑
CHI660C型電化學工作站(上海辰華儀器公司),實驗采用三電極系統金電極(內直徑為2 mm)或修飾電極為工作電極;Ag/AgCl (飽和KCl)電極為參比電極;鉬絲電極為輔助電極。殼聚糖(CS,85-90%的脫乙酰度,平均分子量為1 χ IO6 g/mol,浙江澳興生物科技有限公司);單壁碳納米管(SWCNTs,直徑<2 nm,長度5_15>m,純度>95%,深圳納米港公司),L-半胱氨酸(L-Cys,>99%,北京奇華盛生物技術發展中心),鐵氰化鉀(廣州化學試劑廠),三氯化鐵(廣州化學試劑廠),磷酸氫二鉀(廣州化學試劑廠),磷酸二氫鉀(廣州化學試劑廠)。所有化學試劑均為分析純,使用前未經過進一步處理,實驗用水為二次蒸餾水。L-半胱氨酸(L-Cys)自組裝液的配制自組裝液為0. 02 mol/L的L_Cys,用0. 1 mol/L的HCl配制。雜合普魯士藍電沉積工作液的配制由2. 5 mmol/L K3Fe(CN)6 + 2.5 mmol/L FeCl3 + 0.1 mol/L KCl + 0.1 mol/L HCl混合液充分溶解后組成,然后加入殼聚糖,使其濃度為0. 019Γ0. 05%之間,超聲充分混勻,即為雜合普魯士藍電沉積工作液,每次使用前新鮮配制。支持電解質為PBS 緩沖液(0. 05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl)
(二)、L-Cys自組裝修飾金電極的制備
將待修飾的金電極(Au)在5#金相砂紙(上海辰華儀器公司)上打磨,然后分別用粒徑為1. ΟΜπκΟ. 3Mm和0. 05Mffl的氧化鋁粉末打磨至鏡面,用二次蒸餾水超聲清洗2次,每次 5min。將處理好的電極浸入新鮮配制的Piranha溶液(濃硫酸和雙氧水體積比為7:3)中浸泡IOmin進行活化處理;再分別用二次蒸餾水和無水乙醇超聲清洗2次(每次5min)。處理后的電極在0. 5 mol/L的硫酸中進行循環伏安掃描(電位窗口為-0. 2^1. 5V,掃描速度為0. lV/s)直至出現穩定的金的特征峰。將活化后的Au電極浸入L-Cys自組裝液中,于 40C自組裝他,取出后用水充分淋洗,除去非特異性吸附的L-Cys分子,便制得L-Cys自組裝修飾的金電極,記為Cys/Au。(三)耐堿性普魯士藍雜合電極的制備
將步驟二中所制備的Cys/Au自組裝電極插入新鮮配制的雜合普魯士藍(PB)電沉積工作液中,在恒電位400mV下電沉積40s,用二次蒸餾水小心沖洗后轉入0. 1 mol/L HCl + 0. 1 mol/L KCl混合溶液中,以50mV/s掃描速度在-0. 05、. 35V之間掃描至穩定,取出電極用二次蒸餾水小心沖洗后于100°C烘烤lh,冷卻至室溫后置于0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl緩沖液中(pH=6. 5)于-0. 05V電活化IOmin后,在支持電解質PBS緩沖液于-0. 05、. 35V之間循環伏安掃描(掃速50mV/s)穩定后,便可制得雜合普魯士藍膜修飾電極,記為 ra-CS/Cys/Au。(四)碳納米管-殼聚糖混合液的制備
用1% (體積比)的乙酸溶解殼聚糖粉末,制備成0.5%的殼聚糖(CS)溶液,充分溶解后濾去不溶雜質,用濃NaOH調節殼聚糖溶液的pH值為5. 5,置于4°C保存備用。單壁碳納米管(SWCNTs)在使用前先進行純化處理,用強酸或強氧化劑使其活化,洗至中性烘干后分散于0. 5%的殼聚糖溶液中,超聲分散均勻后,制備成0. 5 mg/mL的單壁碳納米管-殼聚糖溶液(CS-SWCOTs)。(五)黃曲霉毒素氧化酶(AFO)的制備
黃曲霉毒素氧化酶(AFO)的制備可參照文獻1 (Junhua Chen, DalingLiu, etc. Development of an amperometrie enzyme electrode biosensor for sterigmatocystin detection, Enzyme and Microbial Technology 47 (2010) 119 - 126)以及文獻 2 (Shi chuan Li, Jun hua Chen, etc. Amperometric biosensor for aflatoxin Bl based on aflatoxin-oxidase immobilized on multiwalled carbon nanotubesFood Control 22 (2011) 43-49)的報道。配制成蛋白濃度為5 mg/mL的AFO酶液,備用。(六)酶生物傳感器的制備
取步驟五所制備的AFO酶液5L與步驟四所制備的CS-SWCNTs溶液5L均勻混合,超聲 15min,便制備成了 CS-AF0-SWCNTs混合液。取L CS-AFO-SffCNTs 5混合液滴加于步驟三所制備的PB-CS/Cys/Au修飾電極上,在4°C冰箱中干燥組裝過夜,即制得用于檢測ST的酶生物傳感器,記為 CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au。實施例二 雜合普魯士藍修飾電極堿性環境穩定性研究
采用CHI660C電化學工作站(上海辰華儀器公司),利用三電極系統(參比電極Ag/ AgCl (飽和KCl)電極;對電極鉬絲電極;工作電極普魯士藍修飾電極),選擇循環伏安掃描模式,設置電化學參數如下 工作電位-0. 05V +0. 35V 掃描速率50mV/s 靜息時間2s
設置好參數后,在PH8.0的支持電解質PBS緩沖液(0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl)中,循環伏安法檢測雜合普魯士藍修飾電極(PB-CS/Cys/Au)的電流響應信號。 為了進行對比,同時組裝了純普魯士藍修飾電極(PB/Au),組裝過程與雜合普魯士藍類似, 只是沒有自組裝L-Cys以及加殼聚糖。如圖1所示,PB-CS/Cys/Au修飾電極在pH8. 0的PBS 中有一對較好的普魯士藍的氧化還原峰(曲線a),與PB/Au修飾電極相比(曲線b),其峰電流明顯變大,峰形變好,電位差變小,這說明雜合普魯士藍修飾電極的可逆性增加,在堿性環境中的穩定性和耐受性增加。因此組裝的PB-CS/Cys/Au修飾電極為構建酶生物傳感器提供了一個很好的響應平臺。實施例三CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修飾電極對ST的電化學響應 (一)循環伏安法檢測ST
采用CHI660C電化學工作站(上海辰華儀器公司),利用三電極系統(參比電極Ag/ AgCl (飽和KCl)電極,對電極鉬絲電極,工作電極CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修飾電極),選擇循環伏安掃描模式,設置電化學參數如下 工作電位-0. 05V +0. 35V 掃描速率50mV/s 靜息時間2s
8設置好參數后,在PH6. 5的支持電解質PBS緩沖液(0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl)中滴加不同濃度的ST,混勻后采用循環伏安法檢測。如圖2所示,在沒有ST的 PBS中,CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修飾電極展現出普魯士藍的一對氧化還原峰(曲線 a);隨著ST濃度的增大(曲線b=20ng/mL ST ;曲線c=40ng/mL ST),修飾電極氧化峰電流變小,還原峰電流增大,表明普魯士藍雜合修飾電極對AFO催化ST產生的H2A具有很好的電化學還原作用。該酶生物傳感器的檢測機理是通過檢測酶促反應產生的H2A達到檢測ST 的目的。(二)檢測ST的電流-時間曲線
采用CHI660C電化學工作站(上海辰華儀器公司),選擇電流-時間檢測模式,采用三電極系統(參比電極Ag/AgCl(飽和KCl)電極;對電極鉬絲電極;工作電極CS-AF0-SWCNTs/ PB-CS/Cys/Au修飾電極),設置電化學參數如下 檢測電位0V 靜息時間2s 攪拌速度50r/min
待背景電流穩定后,往IOmL支持電解質PBS緩沖液(0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl)中滴加ST,如圖3所示,隨著ST濃度的變化,響應電流呈梯度變化。該酶生物傳感器對ST響應靈敏且迅速,響應時間為8s,檢測限為2 ng/mL (信噪比為3)。酶修飾電極對ST檢測的線性回歸方程為/ (mA) = 0.0791C (ng/ml) -0.8126 (R2=O. 9985),線性范圍為:10ng/mL 950ng/mL。實施例四酶電極的重現性和穩定性
將一支CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修飾電極置于pH8. 0的PBS中連續循環伏安掃描100圈,其峰電流仍保持在90%以上,說明本發明所制備的酶生物傳感具有很好的穩定性。該酶電極對20ng/mL ST重復測定9次,其電流響應值的平均相對標準偏差(RSD)為 3. 6%,表明該電極具有較好的檢測重復性。另外,同時制備9根酶修飾電極,相同條件下對 20ng/mL ST的響應電流的RSD為4. 6%。表明該修飾電極具有較好的制作重現性。電極不用時置于4°C避光干燥保存,隔天測量,16天后仍保持初始電流響應值的90%以上。說明該酶電極具有較好的存儲穩定性。實施例五酶電極的抗干擾性
采用計時電流法對CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修飾電極的抗干擾能力進行研究, 測試條件參數設置如實施例3(二)所示,在IOmL含20ng/mL ST的pH6. 5的PBS緩沖液中, 分別滴加下列不同濃度的可能干擾物,分析其抗干擾能力。分別滴加的干擾物的種類
1000倍于ST濃度的葡萄糖,檸檬酸,PO43-, NO3", L-色氨酸,蔗糖,甘氨酸,D-山梨醇; 500倍于ST濃度的抗壞血酸,尿素,甲醇,草酸,CIO4"; 100倍于ST濃度的油酸,酒石酸鈉,苯酚,乙酸銨,EDTA ; 10倍于ST濃度的對苯二酚,CuCl2, 3,5- 二硝基水楊酸。測試效果當控制相對誤差不超過檢測20ng/mL ST的電流響應值的5% 的情況下,1000倍的葡萄糖,檸檬酸,PO43-, NO3-, L-色氨酸,蔗糖,甘氨酸,D-山梨醇;500倍的抗壞血酸,尿素,甲醇,草酸,C104_ ;100倍的油酸,酒石酸鈉,苯酚,乙酸銨,EDTA ;10倍的對苯二酚,CuCl2, 3,5- 二硝基水楊酸等對測定不產生干擾。實施例六實際樣品檢測
將本發明所述的酶生物傳感器用于實際樣品測定以及檢測其回收率,所述的實際樣品可以是玉米、花生、大米、小麥等一系列農副產品和糧食作物,也可以是飼料、飲料、醬油、橄欖油、花生油等一系列可能含ST的產品。本實施例中選用玉米樣品進行檢測。玉米樣品的處理取Ig優質玉米粉,加入不同濃度的ST,于5 ml 80%的甲醇溶液中振蕩萃取 45 min,離心(5000 r/min, 10 min),上清用 0. lmol/L ρΗ7· 0 的 PBS 按 1 :5(V/ V)稀釋后檢測。其他樣品按照類似的方法,經過簡單的預處理后即可檢測。計時電流法檢測檢測參數設置如實施例3 (二)所示,對分別含10 ng/nL,50 ng/ nL, 100 ng/nL, 150ng/nL, 200ng/nL ST的玉米樣品進行計時電流法檢測,每個濃度的玉米樣品均測量4次。測試結果如表1所示,所測得樣品的相對標準偏差在2. 19Γ5. 4%之間,加標回收率在91.49Γ107. 3%之間,用于實際樣品的測定結果令人滿意。表1 玉米樣品中ST含量的測定
權利要求
1.一種檢測雜色曲霉素的酶電極,其特征在于包括金電極;以及組裝在金電極上的普魯士藍雜合層;所述的普魯士藍是由鐵氰化鉀和氯化鐵溶液電沉積而成;所述的普魯士藍雜合層是由以下方法組裝在金電極上的提供由L-半胱氨酸單體通過自組裝的方式在金電極表面形成的L-半胱氨酸自組裝膜;提供含有鐵氰化鉀、氯化鐵以及殼聚糖的混合溶液;以及將上述混合溶液中產生的普魯士藍電沉積在金電極的L-半胱氨酸自組裝膜上,形成普魯士藍雜合電極。
2.如權利要求1所述的檢測雜色曲霉素的酶電極的制備方法,其特征在于,包括以下步驟A)L-半胱氨酸自組裝修飾金電極的制備將L-半胱氨酸單體通過自組裝的方式組裝在金電極表面,形成L-半胱氨酸自組裝膜,得到L-半胱氨酸自組裝膜功能化修飾的金電極;B)雜合普魯士藍電沉積液的制備配制含有鐵氰化鉀、氯化鐵的溶液,與殼聚糖相混合,形成雜合普魯士藍電沉積液;C)普魯士藍雜合電極的制備將L-半胱氨酸修飾的金電極浸入雜合普魯士藍電沉積液中,采用電化學恒電位電沉積的方法,將沉積液中的普魯士藍電沉積在金電極的L-半胱氨酸自組裝膜上,形成普魯士藍雜合電極。
3.根據權利要求2所述的酶電極的制備方法,其特征在于,所述步驟A包括以下具體步驟將金電極清洗干凈;配制0. 0Γ0. 05 mol/L的L-半胱氨酸溶液作為L-半胱氨酸自組裝液;將處理好的金電極插入到L-半胱氨酸自組裝液中低溫自組裝12-M小時,制得L-半胱氨酸修飾的金電極。
4.根據權利要求2所述的酶電極的制備方法,其特征在于,所述步驟B包括以下具體步驟配制由 2. 5 mmol/L K3Fe(CN)6 + 2. 5 mmol/L FeCl3 + 0. 1 mol/L KCl + 0. 1 mol/L HCl充分溶解后組成的混合液;加入殼聚糖,使其濃度在0. 019Γ0. 05%之間;將上述溶液混勻后即為雜合普魯士藍電沉積工作液。
5.根據權利要求2所述的酶電極的制備方法,其特征在于,所述步驟C包括以下具體步驟將步驟A中所制得的L-半胱氨酸修飾的金電極插入到步驟B中所制備的雜合普魯士藍電沉積液中,恒電位下進行電沉積,然后轉入0. 1 mol/L HCl + 0.1 mol/L KCl混合溶液中進行循環伏安掃描,取出電極用二次蒸餾水小心沖洗后烘干,然后置于0. 05 mol/L KH2PO4-K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl緩沖液中進行電活化,制得普魯士藍雜合電極。
6.一種檢測雜色曲霉素的生物傳感器,其特征在于,所述生物傳感器包括根據權利要求1所述的酶電極。
7.如權利要求6所述的生物傳感器的制備方法,其特征在于以碳納米管為電子傳遞體,均勻分散在殼聚糖溶液中,形成碳納米管-殼聚糖功能膜,將黃曲霉毒素氧化酶包埋在碳納米管-殼聚糖功能膜中,再滴加于權利要求1所述的普魯士藍雜合電極表面,低溫組裝過夜,即制得用于檢測雜色曲霉素的生物傳感器。
8.根據權利要求7所述的生物傳感器的制備方法,其特征在于,所述的碳納米管是采用經強酸或強氧化劑活化處理后洗至中性烘干的多壁碳納米管或者單壁碳納米管。
9.根據權利要求7所述的生物傳感器的制備方法,其特征在于,所述殼聚糖溶液是通過以下方法制備的用乙酸溶解殼聚糖粉末,制備成濃度為0. 19Γ1. 5%的殼聚糖溶液,調節殼聚糖溶液的PH值為5. 5,置于低溫保存備用;所述碳納米管溶于殼聚糖溶液,混勻,制得 0. Γ1. 5 mg/mL的碳納米管-殼聚糖溶液。
10.如權利要求6所述的生物傳感器在檢測雜色曲霉素方面的應用。
全文摘要
本發明涉及一種檢測雜色曲霉素的酶電極及其制備方法,以及以其為基底電極固定黃曲霉毒素氧化酶組裝的用于檢測雜色曲霉素的生物傳感器。在金電極表面先自組裝上L-半胱氨酸功能膜,再插入到雜合普魯士藍電沉積工作液中,采用恒電位法即可制備普魯士藍雜合電極。采用碳納米管作為電子傳遞體,將其均勻分散在殼聚糖溶液中,作為包埋黃曲霉毒素氧化酶的載體,再將殼聚糖-黃曲霉毒素氧化酶-碳納米管混合膜組裝到雜合普魯士藍修飾電極表面,就制成了用于檢測雜色曲霉素的生物傳感器。本發明所述的酶電極與生物傳感器具有較好的穩定性和重現性,對雜色曲霉素響應迅速靈敏,響應時間快,檢測電位低,抗干擾能力強,具有很好的選擇性。
文檔編號G01N27/403GK102175736SQ20111002255
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月20日 優先權日2011年1月20日
發明者劉大嶺, 姚冬生, 謝春芳, 陳俊華 申請人:暨南大學
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