用于檢測曲霉的抗體的制作方法

文檔序號:6125334

專利名稱::用于檢測曲霉的抗體的制作方法
技術領域
:本發明涉及生物化學領域,具體涉及一種新的用于檢測曲霉的抗體。技術背景曲霉是自然界中最常見的腐生菌,有100多種,其中至少10種曲霉是條件致病菌,常污染糧食食品、環境并能感染免疫抑制人群,嚴重威脅人類健康。由曲霉引發的侵襲性曲霉病(InvasiveAspergillosis,IA)由于缺乏早期有效的診治手段,死亡率很高,達95%。IA主要由煙曲霉、黃曲霉引起,少部分由土曲霉、黑曲霉、構巢曲霉引起,其中,煙曲霉是主要的致病菌,約占曲霉類真菌所致人類感染的80%卯%。在食品檢測方面,國內外現行的檢測食品中曲霉污染的方法是檢測曲霉毒素,主要包括薄層層析法、高效液相色譜法、免疫學分析法等。其中薄層層析法不需要特殊的儀器設備,一般實驗室都可以進行,但是對實驗人員和環境的污染危害較大,不適合現場快速檢測,而且操作繁瑣、易受其它組分干擾,因其靈敏度差,無法滿足當今日益嚴格的真菌毒素限量標準。這種方法在發展中國家和我國應用仍較多,而在發達國家逐漸被高效液相色譜法以及免疫學分析法代替。高效液相色譜法,其靈敏度高,準確度好,但儀器昂貴,要求樣品純化程度高,樣品前處理過程繁瑣,耗時長,要求有專業人員操作,因需要價格昂貴的儀器,檢測成本高,在我國難以推廣應用,從而影響了我國糧油食品中真菌毒素的有效監測。而且上述方法每次僅能檢測一種曲霉毒素,不適合對糧食食品中有害曲霉污染的大規模篩査,從而進一步切斷污染環節。因此,目前缺乏快速、特異、廣譜檢測糧油食品中各種有害曲霉的方法。在臨床診斷方面檢測曲霉的方法主要是應用ELISA夾心法對循環抗原半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)的檢測,GM是研究學者在感染動物模型和侵襲性煙曲霉病者血清中發現的煙曲霉抗原,也是一種己被鑒定的煙曲霉來源的多糖抗原,這是一種能夠早期檢測IA抗原血癥的有效標志。法國巴斯德Sanofi診斷中心用大鼠抗GM的單抗EB-A2作為捕捉抗體和檢測抗體,建立雙抗體夾心ELISA—步法,即Platelia^y/^g!7/w,檢測血液和尿標本,是目前唯一的一種用于早期診斷IA的商品化試劑盒。雖然這種試劑盒對抗原檢測非常敏感,但大量研究發現在檢測可疑曲霉病人的血清以及尿標本時,以及使用過青霉素類抗生素,如哌拉西林-三唑巴坦的病人血清有很高的假陽性率,高達74%。另外,假陽性的問題同樣也存在于兒科人群中,高達83%,這可能是由于EB-A2識別曲霉GM的卩(1,5)-呋喃半乳糖苷側鏈殘基的同時,但也識別位于其他真菌(如青霉屬)細胞壁多糖、新生兒腸道中的雙岐桿菌屬脂胞壁酸質及其他微生物和食品的交叉表位有關。因此,這種試劑盒的推廣應用受到限制。本發明的目的在于提供新的抗體。本發明的再一目的在于提供所述抗體的應用。.本發明新的單克隆抗體是一種用于檢測曲霉的捕獲抗體,該抗體是由雜交瘤細胞系CCTCCNO.C200731產生的單克隆抗體。一種用于檢測曲霉的檢測抗體,該抗體是由雜交瘤細胞系CCTCCNO.C200730產生的單克隆抗體。所述的檢測抗體可以標記酶、生物素或發光物質等能產生可檢測信號差異的化學試劑。本發明所述的捕獲抗體和檢測抗體都是用煙曲霉菌絲體抗原免疫小鼠獲得,并用細胞融合技術獲得兩株分別產生這兩種抗體的雜交瘤細胞系9D47A1和雜交瘤細胞系7E11A1,這兩株雜交瘤細胞均為IgGl陽性。雜交瘤細胞系9D47A1和雜交瘤細胞系7E11A1于2007年10月18日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC),保藏號分別為C200731和C200730。為了方便表述,上述由雜交瘤細胞系CCTCCNO.C200731產生單克隆抗體命名為單抗9D47A1,由雜交瘤細胞系CCTCCNO.C200730產生單克隆抗體命名為單抗7E11A1。本發明所述單抗9D47A1和單抗7E11A1能特異性結合曲霉細胞壁分子量為25100kDa且與ConA結合的糖蛋白,和臨床及環境中各種曲霉反應為陽性,如煙曲霉、黃曲霉、土曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、雜色曲霉、棒曲霉、亮白曲霉、聚多曲霉、黃柄曲霉、焦曲霉、赭曲霉、米曲霉等曲霉;但與其他常見真菌的反應均為陰性,如馬爾尼菲氏青霉菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌等。本發明所述的兩個單抗配對用于檢測曲霉,主要是結合雙抗體夾心方法的檢測,如雙抗體夾心ELISA方法、膠體金免疫層析或免疫化學發光方法的檢測,其中單抗9D47A1作為捕獲抗體,單抗7E11A1單獨或者結合各種能發出可檢測信號的物質作為檢測抗體?;谏鲜鲈?,本發明所述的單抗用于制備成可產業化的檢測曲霉的試劑,這些試劑可以是試劑盒的形式,也可以是試紙的形式。所述的試劑盒可以是雙抗體夾心ELISA試劑盒、免疫化學放光試劑盒等,所述的試紙可以是膠體金快速免疫層析檢測試紙等。本發明所述的檢測曲霉的雙抗體夾心ELISA試劑盒,該試劑盒由以下試劑組成包被捕獲抗體的微孔反應板、樣品處理液、酶結合物、陽性對照、陰性對照、濃縮洗液、顯色液、終止液,其特征在于捕獲抗體為單抗9D47A1,酶結合物是將單抗7E11A1用酶標記制備得到,所述的酶是氧化酶或堿性磷酸酶,如辣根過氧化酶標記。本發明所述的檢測曲霉的膠體金快速免疫層析檢測試紙,該試紙由樣品墊,聚酯纖維素墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次部分重疊組成,其特征為聚酯纖維素膜上噴涂有一層膠體金-單抗9D47A1復合物;硝酸纖維素膜上分布有檢測帶和質控帶,其中檢測帶是在硝酸纖維素膜上噴涂單抗7E11A1形成,質控帶是在硝酸纖維素膜上噴涂羊抗小鼠IgGl抗體形成;其中所述的膠體金-單抗9D47A1復合物由純化的9D47A1包被在由氯金酸制成的膠體金顆粒上制得,其顆粒大小為1820nm,呈深紅色。本發明所述的免疫化學發光試劑盒,該試劑盒的組成與雙抗體夾心ELISA試劑盒相似,只是其中的單抗7E11A1標記的是熒光素等化學發光物質。本發明所說的檢測曲霉的試紙/試劑盒操作簡單,快速,特異性高,與其它真菌無交叉反應,既可用于糧食或食品的質量控制中曲霉的檢測,又可用于環境中如空氣、木頭、衣物等曲霉污染的檢測,還可以為IA病人的早期診斷提供依據。本發明試紙/試劑盒與現有檢測曲霉的技術相比有以下優點1、用于食品質量控制,與現有檢測曲霉毒素技術相比,可利用本發明酶聯免疫技術試劑盒或者膠體金試紙條技術,對可疑受到曲霉的污染樣本進行大規模的初步篩査,可簡易、快速、準確地檢測出樣本中曲霉抗原;2、用于環境曲霉污染監控,可利用本發明酶聯免疫技術試劑盒或者膠體金試紙條技術,對可疑受到曲霉的污染木頭、衣物等進行大規模的初步篩查,可簡易、快速、準確地檢測出樣本中曲霉抗原;3、與目前用于診斷IA的早期診斷試劑盒相比,具有相似的靈敏度,但特異性更高,與青霉菌、念珠菌等其他真菌無假陽性反應,成本低,適合國內基層單位使用。圖1是本發明單抗9D47A1和單抗7E11A1對經ConA結合柱純化的曲霉細胞壁糖蛋白進行免疫印跡的結果,其結合條帶的分子量為25-100kDa;其中條帶1是Marker,條帶2是單抗7E11A1,條帶5是單抗9D47A1,條帶3,4為無關單抗。圖2是本發明膠體金快速免疫層析試紙的結構示意圖,其中1是樣品墊,2是聚酯纖維素墊、3是硝酸纖維素膜、4是吸水墊、5是檢測帶、6是質控帶。圖3是本發明檢測曲霉的膠體金快速免疫層析試紙對19種真菌的檢測結果,其中1是土曲霉,2是黃柄曲霉,3是黃曲霉,4是構巢曲霉,5是黑曲霉(ATCC10864),6是黑曲霉,7是焦曲霉,8是雜色曲霉,9是棒曲霉,IO是亮白曲霉,Il是聚多曲霉,12是赭曲霉,13是米曲霉,14是煙曲霉,15是白色念珠菌,16是熱帶念珠菌,17是光滑念珠菌,18是近平滑念珠菌,19是克柔念珠菌,20是馬爾尼菲氏青霉菌。具體實施方式例1本發明單克隆抗體的制備和鑒定1、單抗9D47A1和單抗7E11A1的制備1)煙曲霉菌絲體抗原制備煙曲霉菌株在沙氏平板上37'C生長數天至形成單菌落。將典型的單菌落收獲,加至含有50mlRPMI-1640的500ml錐形瓶中,37。C搖菌3-7天,過濾分離菌絲體及過濾液。將收集的菌絲體重懸于PBS中,超聲裂解,離心后收集上清,并儲存于-80'C備用。2)免疫小鼠取4-6周齡雌性BALB/c小鼠,第一次采用弗氏完全佐劑與等體積煙曲霉菌絲體抗原混勻乳化,皮下注射100ug/只小鼠,以后每10天以弗氏不完全佐劑與50ug抗原等體積乳化,腹腔和皮下多點注射,小鼠免疫4次后,于融合前3天靜脈加強100ug/只抗原。3)免疫血清效價測定采用間接ELISA法測定免疫血清效價。配制10ug/ml煙曲霉菌絲體抗原的50mMpH9.6碳酸鹽緩沖液,包被聚苯乙烯微96孔板,100ul/孔,4。C過夜。次日,含0.25%酪蛋白(Sigma)的封閉液300nl/孔4'C過夜,甩干包被板條,真空干燥1224h,用鋁膜袋真空包裝4。C保存,用于鼠免疫血清效價測定。于第三次免疫后IO天眼眶采血,鼠免疫血清用含l%BSA10mMPBS以103106倍稀釋,加入96孔板,100nl/孔37。C30min,10mMPBS含0.1°/。Tween-20洗滌液洗板四次后,加入1:1000倍稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(Sigma,INC.),100u1/孑L37。C30min,同上洗板后,加入含有0.05%(W/V)TMB和0.06%(W/V)雙氧pH5.0擰檬酸緩沖液,100u1/孔,室溫避光10min,加100pd/孔1MH2S02終止反應,測450nm吸收值,以免疫前小鼠血清作為陰性對照,以測定值與對照值得比^2.1為陽性來判斷免疫血清的效價。4)雜交瘤制備選擇血清抗體效價達1"05的小鼠,于融合前3天尾靜脈注射100ng煙曲霉菌絲體抗原。無菌取小鼠脾臟,制成脾細胞懸液與對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞株NS-1按10:1的比例混合,用45%聚乙二醇(PEG,MW4000,Sigma)作用下進行融合。按下述步驟將聚乙二醇溶液加入細胞。在37。C水浴中,在l-2min內緩慢加入1.0mlPEG,邊加邊輕輕搖勻,分別于lmin、2min、3min、4min、5min內加lml、2ml、3ml、4ml、5ml無血清RPMI-1640培養基終止融合,最后加入10ml含15%FBS的二合一培養基,室溫1000rpm離心5min,棄上清,用36ml含15%胎牛血清的培養基輕輕懸起細胞。將此細胞懸液加入6塊96孔培養板上,在二氧化碳培養箱中溫度為37。C、5。/。C02的培養箱中。一天以后,于每孔加入100!U含次黃嘌呤、氨基喋呤一胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT,Sigma)篩選培養基。以后每3天用此篩選培養基給培養物換液一次,直到克隆細胞形成。4)篩選分泌曲霉抗原單克隆抗體的雜交瘤細胞間接ELISA法篩選細胞培養上清,選擇強陽性克隆雜交瘤細胞進行亞克隆化,并用有限稀釋法連續克隆化2-3次,得到2株穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株。將克隆化后陽性率達100%的細胞擴增培養后液氮凍存。小鼠體內接種陽性雜交瘤細胞,制備腹水,并采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水中的抗體。2、本發明單克隆抗體的特異性鑒定(1)實驗材料煙曲霉株(購自北京大學醫學真菌研究中心)(2)抗原制備煙曲霉菌株在沙氏平板上37t:生長數天至形成單菌落。將典型的單菌落收獲,加至含有50mlRPMI-1640的500ml錐形瓶中,37。C搖菌3-7天,過濾分離菌絲體及過濾液。將收集的菌絲體重懸于PBS中,超聲裂解,離心后收集上清,并儲存于-8(TC備用。(3)抗體亞類鑒定Ig亞類鑒定采用間接ELISA,包被煙曲霉菌絲體抗原,封閉后與雜交瘤細胞培養上清孵育,再分別與為l:1000倍稀釋HRP標記的兔抗小鼠不同亞類特異性免疫球蛋白,這些抗體包括兔抗小鼠IgGl(Sigma,Inc),兔抗小鼠IgG2a(Sigma,Inc),兔抗小鼠IgG2b(Sigma,Inc),兔抗小鼠IgG3(Sigma,Inc),兔抗小鼠IgM(Sigma,Inc)。檢測結果兩株雜交瘤細胞株均為IgGl陽性(4)間接ELISA法進行單克隆抗體特異性分析用煙曲霉菌絲體抗原包被微孔板,按照常規的間接ELISA法進行檢測。在包被的微孔板中加入本專利發明的雜交瘤細胞培養上清液,37'C再孵育lh,加入l:1000稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(Sigma,Inc),100u1/孑L37°C30min,力卩TMB顯色液室溫避光10min,加1MH2S02終止反應,測450nm吸收值C445Q)。表l結果顯示本專利發明的單克隆抗體與曲霉抗原產生很強的特異性的免疫反應。表1:曲霉單克隆抗體與曲霉抗原反應間接ELISA結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(5)間接免疫熒光法鑒定本發明單克隆抗體的特異性1)實驗材料煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉和土曲霉,白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、馬爾尼菲氏青霉菌。2)實驗方法曲霉菌株在沙氏平板上37'C生長數天至形成單菌落,收集典型的單菌落,用預冷的lxPBS收集、洗細胞二遍并調整濃度為1x106個細胞/ml,然后將細胞滴于無菌干燥的玻片上,干燥后,制備成涂片,充分干燥,用預冷固定液(丙酮甲醇體積比為3:7)固定20min,吹干,將單克隆抗體調整濃度為10ug/ml,加至不同曲霉菌株的熒光涂片孔中,同時設陰性和陽性對照血清,置37。C水浴60min后,取出將抗原片放于染色缸中用O.OlmMpH7.2PBS清洗3次,吹干,加入熒光標記羊抗小鼠IgG抗體,37'C水浴30min后,同上方法洗滌5次,吹干后,0.25%伊文氏藍對照染色,熒光顯微鏡下觀察熒光圖像,以熒光的強度和染色形態進行結果判定,檢測抗體強度以(+++++)計為陽性,抗體強度(±)和(一)計為陰性。3)實驗結果結果如表2所示,本發明單抗特異性結合煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉和土曲霉,且有很強的結合能力,而與其它真菌不結合。表2間接免疫熒光檢測抗曲霉抗原的單克隆抗體對4株不同曲霉的特異性本發明單克隆抗體單抗7E11A1單抗9D47A1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(6)免疫印跡法分析本發明單抗的特異性煙曲霉菌株(購自北京大學醫學真菌研究中心)在沙氏平板上37'C生長數天至形成單菌落,收集典型的單菌落,加至含有50mlRPMI-1640的500ml錐形瓶中,37。C搖菌3-7天,過濾,將濾液經經ConA結合柱純化其中的糖蛋白。經8%SDS-PAGE電泳分離的蛋白條帶轉印至硝酸纖維素膜上,封閉液封閉后,纖維素膜于7E11A1-HRP中37'C孵育lh,用含有0.5%(v/v)Tween-20的洗液清洗數次,DAB(AmrescoInc,Solon,OH)顯色。本發明中的2種單克隆抗體結合糖蛋白分子量條帶位于25-100kDa處(圖1),說明這2組單抗識別抗原為經ConA結合柱純化的分子量為25-100kDa的糖蛋白。(7)、本發明單克隆抗體識別位點的分析1)抗原制備煙曲霉菌株在沙氏平板上37'C生長數天至形成單菌落,收集典型的單菌落,加至含有50mlRPMI-1640的500ml錐形瓶中,37。C搖菌3-7天,過濾分離菌絲體及過濾液。將收集的菌絲體重懸于PBS中,超聲裂解,離心后收集上清,并儲存于-80。C備用。2)方法和結果用50mMpH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋上述抗原至30yg/ml,包被聚苯乙烯微96孔板,O.lml/孔,4'C過夜。次日,含0.25%酪蛋白(Sigma)的封閉液0.3ml/孔,4'C過夜后,先加單抗10ng/ml50ul/孔及后加系列稀釋HRP標記單抗1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:200050nl/孔,37。C,孵育lh;PBST洗滌五次后加TMB(AmrescoInc)100ul/孔,10min后,1M112804終止反應,測定450nm吸收值。以單抗對同一HRP標記的單抗抑制率為100%,以已知無關單抗對標記單抗的抑制為陰性對照,計算各單抗間的抑制率。即抑制率為(l-測定值A450/陰性對照值A450)x100。抑制率>75%為相關,>50%為不完全相關,<50%為不相關,<25%為完全不相關。結果發現,兩株單抗之間的抑制率均為O,說明2株單抗識別2個完全不同的抗原位點。3、雙抗體夾心ELISA法單克隆抗體最佳配對的篩選和ELISA參數的優化將腹水純化的2株單克隆抗體用于進行一組矩陣格式實驗以選出最適合于建立夾心ELISA法中用作捕獲和標記的單克隆抗體對。簡單地說,用辛酸一硫酸銨沉淀法純化的2株雜交瘤細胞(編號為9D47A1、7E11A1)衍生而來的腹水包被96孔板,以前述制備的煙曲霉CA抗原作為抗原篩選抗體對。辣根過氧化物酶標記2株單克隆抗體,采用矩陣格式,也就是上述2株單克隆抗體將每株進行包被作為捕獲或混合包被作為捕獲,分別與每一株酶標記單克隆抗體進行配對,以快速篩選夾心ELISA中捕獲和標記的單克隆抗體對。初步實驗顯示單克隆抗體9D47A1作為捕獲抗體,與酶標記7E11A1單克隆抗體配對時,可產生較強的信號。而在此基礎上,分別組合上述2株單克隆抗體進行捕獲的抗體和標記的抗體的配對,以信號強度和特異性而言,用9D47A1作為捕獲的單克隆抗體,用7E11A1抗體作為標記的單克隆抗體,產生最強的信號。例2本發明檢測曲霉的雙抗體夾心ELISA試劑盒1、檢測曲霉的雙抗體夾心ELISA試劑盒由以下試劑組成包被單抗9D47A1的微孔反應板樣品處理液4。/。乙二胺四乙酸(PH7.0),即稱取乙二胺四乙酸40g,溶于lL蒸餾水中,NaOH調PH值至7.0,保存于4'C;酶結合物辣根過氧化物酶標記的單抗7E11A1;濃縮洗液含有2%Tween-20的20xPBS,即1L溶液中含有4.56gNaH2PO4,58.02gNa2HP04.12H20,175.3gNaCl,15磅20min高壓滅菌后,加入20mlTween-20攪勻,使用時20倍稀釋;陽性對照煙曲霉培養過濾液1:1000稀釋,陰性對照含0.1%Tween-20的10mMPH7.4PBS,艮卩1L溶液中含有4.56gNaH2PO4,58.02gNa2HP04.12H20,175.3gNaCl,15磅20min高壓滅菌,20倍稀釋后加入0.1%Tween-20;顯色液由顯色液A和B組成,使用時取二者等量混勻使用。其中顯色液A、B的組成成分如下顯色液A:將0.89g檸檬酸和0.16gEDTA二鈉溶于1000ml水中,115°C30min后,降至卯°C后加TMB0.25g,搖勻于4'C閉光保存;顯色液B:將9.33g檸檬酸和14.6gEDTA二鈉溶于1000ml水中,115°C30min后,降至卯。C后加0.75°/。過氧化氫尿素12.8ml,搖勻于4。C閉光保存;終止液1MH2S04;其中,包被單抗9D47A1的微孔反應板的制備方法是將本發明單抗9D47A1用50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋至10wg/ml,用0.1ml/孔包被聚苯乙烯96微孔板,于4。C過夜。拍干后,每孔加入0.3ml的0.25%酪蛋白(Sigma)的封閉液,于4'C過夜以封閉非特異性結合位點。甩干板條,真空干燥1224h,用鋁膜袋真空包裝4'C保存備用;酶結合物的制備方法是辣根過氧化物酶標記抗體制備采用改良過碘酸鈉法,將5mg辣根過氧化物酶攪拌溶解于lml蒸餾水中,加入0.2ml新配0.1M過碘酸鈉30min,置lmMpH4.4醋酸鈉緩沖液中,4t:透析過夜,次日加入2(Hi10.2MpH9.5碳酸鹽緩沖液后加預先在0.01M碳酸鹽緩沖液中pH9.5透析平衡的10mg抗體,在室溫避光輕輕攪拌23h,加入O.lml新配4m^nl硼氫化鈉,4'C避光過夜,冰浴上避光攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨(硫酸銨用前先用氨水調pH至7.0-7.2),置4°C6h。10000g,4'C離心30min,棄上清,沉淀溶于適量lOmM磷酸鹽緩沖液,用同樣的液體,4"C透析過夜,換液三次。收集結合物加入2。/。BSAPBS50%甘油保護劑,最后用磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍,即可。2、使用方法樣品處理液處理各種待測的樣品后,加100lU于9D47A1包被的聚苯乙烯96孔微量測試板中,每份樣品設復孔,同時設陰對照和陽性對照,37'C溫育lh,濃縮洗漆液20倍稀釋后洗滌板條,洗板四次后,加入酶結合物,100ul/孔,37°C30min,同上洗板八次后,加顯色液(顯色液A和B等量混合,現用現配),100nl/孔,室溫避光10min后,加入終止液,100ul/孔,終止反應。3、結果判定以空白孔調零,于450nm波長測定A值。CUTOFF值=0.15+陰性對照平均值如待測標本A450值2CUTOFF值,則判為陽性,反之,如待測標本A450值〈CUTOFF值,則判為陰性。當陽性對照A450值低于1.0或陰性對照A450值高于0.3,檢測結果無效。4、檢測曲霉的雙抗體夾心ELISA試劑盒對各種曲霉及其他常見真菌的特異性和靈敏度分析將臨床分離曲霉及其它常見真菌(馬爾尼菲氏青霉菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌)在沙氏平板上37'C生長數天至形成單菌落,環境分離株曲霉于28"C培養7天后,收集單菌落并轉接至RPMI-1640中生長至濃度為2x106個細胞/ml時,收集培養液上清。樣品稀釋液稀釋樣本后,按照本實施例第2點的方法檢測上述各種真菌培養液上清。結果如表3所示,本發明試劑盒對19株環境和臨床分離曲霉株都有特異性反應,而與常見的其他真菌,如馬爾尼菲氏青霉菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌無交叉反應。本發明試劑盒的檢測下限為1:1000~h10000的稀釋倍數,因不同種類的霉菌而有所不同。表3本發明試劑盒對各種曲霉及其他常見真菌的特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>5、本發明試劑盒的可重復性分析按照第4點的實驗方法進行重復實驗,10次重復實驗的變異系數分別為1.85%(1:500),4.12%(1:1000),和2.27%(1:5000)。以20天為一個周期,每天檢測一次樣本,變異系數分別為7.96%(1:500),10.46%(1:1000),和8.03%(1:5000)。例3檢測曲霉的膠體金快速免疫層析試紙1、本發明所述的檢測曲霉的膠體金快速免疫層析試紙構成如圖2所示,該試紙由樣品墊1,聚酯纖維素墊2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4依次部分重疊組成,其中聚酯纖維素膜2上噴涂有一層膠體金-單抗9D47A1復合物,其顆粒大小為1820nm,呈深紅色;硝酸纖維素膜3上分布有檢測帶5和質控帶6,其中檢測帶5是在硝酸纖維素膜3上噴涂單抗7E11A1形成、質控帶6是在硝酸纖維素膜3上噴涂羊抗小鼠IgGl抗體形成。本發明試紙的制備方法是將濃度為l-1.5mg/ml的煙曲霉單克隆抗體7E11A1和羊抗小鼠IgGl以0.8-1.5pl/cm的噴布量噴附在硝酸纖維素膜上,分別作為檢測線和質控線,室溫干燥后用1%牛血清白蛋白封閉,烘干后貼附于涂有雙面膠的底板上,右側與吸水墊重疊l-2mm;聚酯纖維素膜上噴附540nm下吸光度為0.5-0.8的濃度的膠體金-單抗9D47A1復合物,并粘貼在底板上,與硝酸纖維素墊的左端重疊l-2mm;底板左端貼附樣品墊,其右側與聚酯纖維素墊重疊l-2mm;將貼有硝酸纖維墊、吸水墊、樣品墊、聚酯纖維素塾的底板切成4-6mm的長條。上述膠體金-單抗9D47A1的制備方法是:采用常規的膠體金-單克隆抗體復合物的制備方法取0.1克氯金酸鈉并溶于1000ml的去離子水中,加熱煮至60°C,放入50ml新配的1%檸檬酸鈉溶液,其中含檸檬酸0.2%,含單寧酸0.2%,然后加熱到95。C5min,呈現深紅色,所形成的膠體金顆粒直徑為18-20nm,將純化的單克隆抗體經36000轉/min離心30min,取其上清經0.2um濾膜過濾,將其濃度調至0.6mg/ml.待混合液涼至15-30'C時,每100ml上述溶液中加lmll"M)濃度的聚乙烯醇PEG以阻止非特異性凝集,以12000轉/min離心30min,去除上清液,再以12000轉/min離心lh,去除未吸附的蛋白質,將包被的膠體金稀釋到在540nm波長下吸光度為0.5-0.8的濃度,用0.2nm濾膜過濾除菌,即純化的膠體金-單抗9D47A1復合物。4'C保存備用。2、本發明試紙對19種曲霉培養液進行檢測。取l:100稀釋的曲霉培養液0.5ml(曲霉來源和培養和例2相同),離心片刻,垂直插入試紙條,插入深度不超過樣品墊,在樣本中停留約l-2min,使樣本充分上行后,水平放置5-15min判讀結果。結果判斷陰性試紙條檢測帶5不顯色,僅質控帶6顯色,出現l條紅線;陽性若試紙條檢測帶和質控帶均顯色,出現2條紅線;無效若試紙條檢測帶和質控帶均不顯色,無紅線出現,則測試無效,表示試紙條已經失效。結果如圖3所示,本發明膠體金快速免疫層析試紙能檢測到各種曲霉,但其他真菌均呈陰性反應。權利要求1、一種用于檢測曲霉的捕獲抗體,該抗體是雜交瘤細胞系CCTCCNO.C200731產生的單克隆抗體。2、一種用于檢測曲霉的檢測抗體,該抗體是雜交瘤細胞系CCTCCNO.C200730產生的單克隆抗體。3、一種產生權利要求1所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞系,該雜交瘤細胞系為CCTCCNO.C200731。4、一種產生權利要求2所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞系,該雜交瘤細胞系為CCTCCNO.C200730。5、由雜交瘤細胞系CCTCCNO.C200731產生的單克隆抗體和由雜交瘤細胞系CCTCCNO.C200730產生的單克隆抗體在制備檢測曲霉的試劑中的應用。6、根據權利要求5所述的應用,其特征在于所述的試劑是雙抗夾心ELISA試劑盒,該試劑盒由包被捕獲抗體的微孔反應板、樣品處理液、酶結合物、陽性對照、陰性對照、濃縮洗液、顯色液和終止液組成,其特征在于所述的捕獲抗體是權利要求1所述的抗體,酶結合物是將權利要求2所述的抗體用酶標記制得的,其中所述的酶是氧化酶或堿性磷酸酶。7、根據權利要求6所述的應用,其特征在于所述的酶是辣根過氧化物酶。8、根據權利要求5所述的應用,其特征在于所述的試劑是膠體金快速免疫層析檢測試紙,該試紙由樣品墊(1),聚酯纖維素墊(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水墊(4)依次部分重疊組成,其特征為聚酯纖維素膜(2)上噴涂有一層膠體金-單抗9D47A1復合物;硝酸纖維素膜(3)上分布有檢測帶(5)和質控帶(6),其中檢測帶(5)是在硝酸纖維素膜(3)上噴涂權利要求2所述的抗體形成,質控帶(6)是在硝酸纖維素膜(3)上噴涂羊抗小鼠IgGl抗體形成;其中所述的膠體金-單抗9D47Al復合物由權利要求1所述的抗體包被在膠體金顆粒上制得。全文摘要本發明提供了用于檢測曲霉的捕獲抗體和檢測抗體,這兩種抗體分別是由雜交瘤細胞CCTCCNO.C200731和CCTCCNO.C200730產生的單克隆抗體,能特異性結合曲霉屬真菌細胞壁分子量為25~100kDa的糖蛋白,與常見的其他真菌,如馬爾尼菲氏青霉菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌等的反應均為陰性。本發明所述的抗體可制備成常用的檢測曲霉的免疫試劑。文檔編號G01N33/53GK101149377SQ200710031109公開日2008年3月26日申請日期2007年10月29日優先權日2007年10月29日發明者潘玉先,王艷芳,車小燕,衛郝申請人:南方醫科大學珠江醫院
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