用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極及其制備方法

文檔序號:5942193
專利名稱:用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極及其制備方法
技術領域
本發明屬于生物傳感器領域,涉及一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極,以及該生物傳感器電極的制備方法。
背景技術
黃曲霉毒素(AFT)、雜色曲霉素(ST)是目前已知的強致癌物之一,它們常污染動物飼料和人類的食品。用污染的飼料喂養禽畜會導致肉、乳及其制品的污染。人們如果食用被污染的食品,會導致急性中毒,引起肝臟壞死出血,慢性中毒可引起肝癌、肺癌。同時,用被污染的飼料飼養禽畜會使禽畜生產率降低,增重減慢,造成重大經濟損失。各國對食品及飼料中的黃曲霉毒素均有嚴格的限量規定。雜色曲霉素是結構與黃曲霉毒素十分相似的霉菌毒素,其毒性、致癌性與黃曲霉毒素相似,因此對于食品及飼料中的雜色曲霉素各國也有嚴格的規定。
目前,對食品及飼料中黃曲霉毒素的檢測方法大致有TLC(薄層色譜法)、HPLC(高效液相色譜)、ELISA(酶聯免疫吸附分析)等幾種(黃曲霉毒素B1檢測方法的分析,食品與發酵工業2003年10期)。TLC法較為簡單,不需要價格高昂的儀器設備,但樣品的前處理繁瑣,提取效果不理想,操作費時。HPLC法需要高昂的設備費用,專業的操作人員。ELISA法也需要專業的技術人員,需要專門的設備,還需要購買昂貴的試劑盒,僅適合于批量的檢驗,操作費時,需約4小時。而對于食品及飼料中黃曲霉毒素、雜色曲霉素的檢測方法,則未見詳細報道。
多壁碳納米管自從1991年問世以來,由于其獨特的物化特性以及所具有的納米顆粒的大比表面積賦予了其在酶生物傳感器研制方面無可比擬的優點。其納米顆粒的大比表面積可以大大提高固化酶的數量,增加酶與底物反應的面積,從而大大提高酶生物傳感器的響應性,并且其具有獨特的金屬或導體的性質,能在電極表面迅速傳遞電子,從而促進電極表面的電流響應,提高傳感器的靈敏度。另外一個引人注目的優點是碳納米管在酸氧化環境下經活化后,能在碳納米管表面引入活性的功能基團-COOH,-OH,-CHO等基團,利用其這一特性可通過蛋白交聯劑EDC、NHS將帶有-NH2,-COOH的蛋白酶通過縮和反應共價結合在碳納米管載體上,以固相酶的形式保持酶活力,從某種程度上大大節約酶用量和損失。

發明內容
本發明的目的在于提供一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極。
本發明所述的用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極,包括基底層與在基底層上形成的反應層,所述的反應層包含電子介體和黃曲霉毒素解毒酶,電子介體固定在基底層上成膜,該膜作為酶載體聯結黃曲霉毒素解毒酶,形成黃曲霉毒素解毒酶修飾電極。
所述的電子介體可選用有機分子電子介體和高分子電子介體。有機分子電子介體主要有二茂鐵及其衍生物、有機染料、醌及其衍生物、四硫富瓦烯;高分子介體主要包括變價過渡金屬離子型和有機氧化還原型等氧化還原聚合物。高分子介體化合物通常是由低分子介體化合物與高分子鏈所帶的活性基團進行反應固載生成的。
本發明優選的電子介體由在酸氧化環境下活化的多壁碳納米管構成,其通過蛋白交聯劑聯結黃曲霉毒素解毒酶?;罨蟮亩啾谔技{米管起了一個增敏的作用,即增強電極的靈敏性,同時,活化后的多壁碳納米管具有較大量的羧基,這十分有利于對蛋白質的固定。
所述的多壁碳納米管優選是以硝化氧化方式活化處理所得的羧基化多壁碳納米管,也可以是其他強酸或強氧化劑活化處理所得的羧基化多壁碳納米管。
所述的蛋白交聯劑為EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺)、NHS(N-羥基丁二酰亞胺酯),也可以為其它的聯結蛋白質的方式。
當選用其他不同的電子介體時,可選用適合該電子介體的不同的聯結方法。例如,選用二茂鐵衍生物作為電子介體時,先利用雙異硫氰酸酯與酶分子進行交替共聚制成酶膜,然后再將帶有羧基的二茂鐵衍生物通過與酶分子上的氨基反應鍵合到酶分子上去。
本發明的另一目的在于提供一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極的制備方法。
本發明所述的一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極的制備方法,包括以下步驟A、將多壁碳納米管進行羧基化的活化處理,加表面活性劑促溶并配成羧基化多壁碳納米管溶液;B、制備黃曲霉毒素解毒酶;C、以羧基化多壁碳納米管溶液對基底層進行修飾成膜,在黃曲霉毒素解毒酶的酶液中加入適量的底物即雜色曲霉素粉末和/或黃曲霉毒素粉末,底物的加入量足以保護黃曲霉毒素解毒酶的活性中心,混勻,滴加于電極表面,羧基化多壁碳納米管聯結黃曲霉毒素解毒酶,得到黃曲霉毒素解毒酶修飾的生物傳感器電極。
所述的步驟C中,滴加于電極表面的黃曲霉毒素解毒酶酶液中還加入適量的穩定劑,如PEG、甘油、吐溫等。穩定劑的加入量與酶液的體積比為1∶10。
優選的制備方法包括以下步驟A、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管用王水回流8~12小時,離心,棄上清,干燥后為羧基化多壁碳納米管;稱取羧基化多壁碳納米管溶于二甲基甲酰胺中,超聲波攪拌均勻后,配成0.01~1.0mg/ml的羧基化多壁碳納米管溶液;B、黃曲霉毒素解毒酶的制備采用Armillariella sp.菌體破碎提取法制得黃曲霉毒素解毒酶,或者采用基因工程方法獲得黃曲霉毒素解毒酶;配制成蛋白濃度為0.2mg/ml的酶液,備用;C、多壁碳納米管修飾酶電極的制備以金電極為基底層,打磨至光亮,并依次在丙酮,強堿溶液,強酸溶液以及蒸餾水中超聲波清洗,將步驟A所得的羧基化多壁碳納米管溶液滴加在電極表面,烘干成膜;再依次分別浸入100g/L的EDC溶液和100g/L的NHS溶液中30分鐘;取步驟B所得的酶液100μl加入0.01~0.5μg的底物即雜色曲霉素粉末和/或黃曲霉毒素粉末,混勻,滴加于電極表面,15~25℃放置30分鐘后,在用于配制EDC溶液和NHS溶液的PBS溶液中清洗數次;將電極置于黃曲霉毒素解毒酶酶液中0~4℃下12~24小時,用PBS緩沖液沖洗電極數次,洗去電極表面未固定上的酶,即得到黃曲霉毒素解毒酶修飾的生物傳感器電極。
所述的步驟C中,每100μl酶液中還加入10μl的穩定劑PEG-200,混勻,然后滴加于電極表面。
更為優選的制備方法包括以下步驟A、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管用王水回流8~10小時,10000g離心15分鐘,棄上清,用雙蒸水清洗沉淀,10000g離心15分鐘,洗滌沉淀,重復此步驟兩次;將沉淀置于烘箱中烘干,為羧基化多壁碳納米管;稱取上述1mg羧基化多壁碳納米管溶于10ml的二甲基甲酰胺中,超聲波攪拌均勻后,配成0.1mg/ml的溶液;B、黃曲霉毒素解毒酶的制備采用Armillariellla sp.菌體破碎提取法制得黃曲霉毒素解毒酶,或者采用基因工程方法獲得黃曲霉毒素解毒酶;配制成蛋白濃度為0.2mg/ml的酶液,備用;C、多壁碳納米管修飾酶電極的制備將金電極以牙膏、硅藻土在絨布上打磨至光亮,并依次在丙酮、0.5mol的NaOH溶液、1∶1濃硝酸以及雙蒸水中超聲波清洗,每次3~5分鐘,將10μl羧基化多壁碳納米管溶液滴加在電極表面,置于60℃烘箱中烘干成膜。然后,再依次分別浸入100g/L的EDC溶液和100g/l的NHS溶液中30分鐘,EDC溶液和NHS溶液均以0.01M,pH7.4PBS配制;取步驟B所得的酶液100μl加入0.01~0.5μg的底物即雜色曲霉素粉末和/或黃曲霉毒素粉末,在振蕩器上混勻后,取20μl滴加于電極表面,15~25℃放置30分鐘后,在0.01M,pH7.4PBS溶液中清洗數次;為減低黃曲霉毒素解毒酶的酶分子活性中心在交聯過程中載體上失活,采用底物保護酶活性中心的方法,先用底物即雜色曲霉素和/或黃曲霉毒素封閉黃曲霉毒素解毒酶的酶活性中心和維持構象的必需基團,然后用交聯劑EDC、NHS將黃曲霉毒素解毒酶固定在羧基化多壁碳納米管載體上,最后去掉保護劑即雜色曲霉素和/或黃曲霉毒素;將電極置于黃曲霉毒素解毒酶酶液中0~4℃下過夜,用PBS緩沖液沖洗電極數次,洗去電極表面未固定上的酶,即得到黃曲霉毒素解毒酶修飾的生物傳感器電極。
所述的步驟C中,每100μl酶液中還加入10μl的穩定劑PEG-200,混勻,然后滴加于電極表面。
基于碳納米管的在酶生物傳感器上的潛在應用,本發明以硝化氧化方式活化處理多壁碳納米管,以MWNT-COOH作為酶載體構建了ADTZ固相酶生物傳感器電極。
用原子力顯微鏡(AFM)觀察固化酶修飾電極的膜表面,發現有很多酶分子附在羧基化開管處理的MWNT納米顆粒上。AFM結果顯示共價交聯固化酶方式形成的膜面上ADTZ酶生物大分子均一的分布在MWNT上。這主要是由于MWNT具有納米顆粒的均一自組裝性,MWNT先在電極基質上均勻分散,自組裝成均一的酶固化基底層;并且因為硝化處理的MWNT表面帶有-COOH基團,提供有酶共價結合位點,在EDC,NHS交聯劑的作用下,ADTZ酶生物大分子被定向引入到MWNT的-COOH位點上,從而防止了直接吸附固化ADTZ的無向性引起的ADTZ酶分散的無序性或聚集成團性,這樣通過MWNT的納米自組裝均一性賦予了上面一層酶膜的ADTZ分布的有序性和均一性。
本發明用蛋白交聯劑EDC、NHS將ADTZ酶分子通過直接共價結合的方式連接在MWNT納米顆粒上。為減低ADTZ酶分子活性中心在交聯過程中載體上失活,采用底物保護酶活性中心的方法,先用底物ST封閉ADTZ酶活性中心和維持構象的必需基團,然后用交聯劑EDC、NHS將ADTZ固定在MWNT載體上,最后去掉保護劑ST,得到具有離剛性載體MWNT,又有較高活性的ADTZ固定化酶,制備得到交聯固化ADTZ酶修飾電極,如圖1所示。
本發明所述的生物傳感器電極,主要是利用所含的黃曲霉毒素解毒酶(aflatoxin-detoxifizyme,ADTZ)來檢測黃曲霉毒素(AFT)及雜色曲霉素(ST),其原理如下
Aflatoxin B1Aflatoxin B1-8,9-dihydrodiol黃曲霉毒素B1(反應產物)黃曲霉毒素-8,9-二羥二醇 Sterigmatocystin Sterigmatocystin-8,9-dihydrodiol雜色曲霉素 (反應產物)雜色曲霉素-8,9-二羥二醇由于ST與AFTB1在結構上相似,在ADTZ催化下發生相似的氧化反應,均可在上述反應過程中產生可以被檢測的電信號。因此,本發明所述的生物傳感器電極,對于黃曲霉毒素(AFT)及雜色曲霉素(ST)的檢測是高特異性的,而且其檢測的靈敏度非常高。
本發明利用發明人報道的ADTZ酶首次制備出生物傳感器電極,與現有技術相比,具有響應快、信號靈敏、特異性高、使用方便、可定量檢測等優點。利用本發明所述的生物傳感器電極,僅需要對樣品進行簡單的預處理,可用于在線檢測,響應時間較快,僅2分鐘,靈敏度高(可檢出雜色曲霉素10個ppb、黃曲霉毒素5個ppb的樣品),比HPLC法高約10倍,單個樣品或批量檢測均可以方便地使用。本發明所述的生物傳感器電極的靈敏度可達到1ppm~10ppb的水平。本發明省時、省力,操作簡單,幾乎無須培訓即可推廣應用。


圖1為ADTZ通過交聯劑EDC、NHS交聯固化在MWNT上示意圖。
圖2為不同濃度ST的循環伏安圖,圖中,1為空白PBS;2~5為不同濃度的ST溶液,Scan rate100mv/s;圖3為不同濃度ST的微分脈沖圖;
圖4為不同濃度ST與峰電流的關系圖。
具體實施例方式
實施例一黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)修飾的生物傳感器電極本發明所述的用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極,包括基底層與在基底層上形成的反應層,所述的反應層包含電子介體和黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ),電子介體固定在基底層上,并作為酶載體聯結黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)。
本實施例中,所采用的電子介體是由在酸氧化環境下活化的多壁碳納米管構成,具體是以硝化氧化方式活化處理所得的羧基化多壁碳納米管,其通過蛋白交聯劑EDC、NHS聯結黃曲霉毒素解毒酶。
實施例二黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)修飾的生物傳感器電極的制備(一)、材料的準備(1)基底層選用金電極,購自天津蘭力科技公司。
(2)多壁碳納米管(MWNT)購自深圳納米港。
(3)蛋白交聯劑1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺酯(NHS)購自Sigma公司。
(二)、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管(MWNT)用王水1∶3(濃硝酸∶濃硫酸)回流8~10小時,10000g離心15分鐘,棄上清,用雙蒸水清洗沉淀,10000g離心15分鐘,洗滌沉淀,重復此步驟兩次。將沉淀置于烘箱中烘干,為羧基化多壁碳納米管。
稱取上述1mg羧基化的MWNT溶于10ml的二甲基甲酰胺(DMF)中,超聲波攪拌均勻后,配成0.1mg/ml的溶液。
(三)、黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)的制備采用Armillariella sp.菌體破碎提取法制得黃曲霉毒素解毒酶,參照發明人所報道的方法(Da Ling Liu,Dong Sheng Yao,et al.,Production,purification,andcharacterization of an intracellar aflatoxin-detoxifizyme from Armillariellatabescens(E-20),Food and chemical toxicology,39(2001)461-466),或由該方法的部分步驟獲得?;蛘卟捎没蚩寺?、基因工程等方法獲得該酶。
配制成蛋白濃度為0.2mg/ml的酶液,備用。
(四)、多壁碳納米管修飾酶電極的制備將金電極以牙膏、硅藻土在絨布上打磨至光亮,并依次在丙酮、0.5mol的NaOH溶液、1∶1濃硝酸以及雙蒸水中超聲波清洗,每次3~5分鐘,將10μlMWNT溶液滴加在電極表面,置于60℃烘箱中烘干成膜。然后,再依次分別浸入100g/L的EDC溶液和100g/l的NHS溶液(均以0.01M,pH7.4 PBS配制)中30分鐘;100μl ADTZ酶液中加入0.01~0.5μg ST粉末,10μl的穩定劑PEG-200,混勻振蕩器上混勻后,取20μl滴加于電極表面,15~25℃放置30分鐘后,在0.01M,pH7.4 PBS溶液中清洗數次。為減低ADTZ酶分子活性中心在交聯過程中載體上失活,采用底物保護酶活性中心的方法,先用底物ST封閉ADTZ酶活性中心和維持構象的必需基團,然后用交聯劑EDC、NHS將ADTZ固定在MWNT載體上,最后去掉保護劑ST。
將電極置于ADTZ酶液中0~4℃下過夜,用PBS緩沖液沖洗電極數次,洗去電極表面未固定上的酶。
本實施例中,選用雜色曲霉素(ST)作為底物,還可選用黃曲霉毒素(AFT)作為底物,原理和操作方法相同。
本實施例為優選方案,在滴加于電極表面的ADTZ酶液中加入了穩定劑PEG-200,此步驟中即使不加入穩定劑也可制備出有相同功能的生物傳感器電極。
所加入的穩定劑,除了本實施例所采用的PEG外,還可選用甘油、吐溫等。
實施例三黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)修飾的的生物傳感器電極用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉毒素的實驗分析將本發明所述的黃曲霉毒素解毒酶修飾的Au電極作為基底層,與通用的對電極和任選的參比電極一起組成一個電極系統。
本實施例中,選用Ag/AgCl電極為參比電極,Pt絲電極為對電極組成三電極系統,磷酸鹽緩沖液為電解液。
以雜色曲霉素(ST)的檢測方法為例進行詳細說明(一)樣品的處理固態樣品100g樣品以粉碎機粉碎,用甲醇∶水=45∶55(v/v)充分溶解震蕩,以1∶1的氯仿提取3次,通過含有無水硫酸鈉的漏斗,65℃下吹氮氣揮干。
液態樣品100ml樣品以0.5∶1的氯仿提取3次,通過含有無水硫酸鈉的漏斗,65℃下吹氮氣揮干。
(二)MWNT修飾ADTZ酶電極對雜色曲霉素的電化學響應在電位范圍-1000mV~1000mV,10ml的0.1mol/L,NaH2PO4-Na2HPO4(PBS),pH6.0含0.1g/L KCL支持電解質的緩沖液中,用BAS-100 Electrochemical analyzer進行循環伏安(CV)研究和示差脈沖伏安(DPV)研究,掃描速率100mV/s。分別檢測MWNT固化ADTZ修飾電極對雜色曲霉素的響應情況。
一、循環伏安法檢測采用BAS-100電化學分析儀三電極系統(參比電極Ag/AgCl電極,對電極Pt絲電極,基底層修飾Au電極),選擇循環伏安掃描模式,設置電化學參數如下工作電位范圍-1000mv~+1200mv掃描速率100mv/s;靈敏度10μA/V;靜息時間2s設置好參數后,分別用不同的修飾基底層對10ml0.2M,pH6.60PBS(含1g/lKCl)的底液以及相同底液體系中加入不同濃度的ST的乙醇溶液或上述樣品進行循環伏安掃描檢測。
測試效果以100mv/s的掃描速率,在0~1200mv工作電位范圍內用循環伏安法對不同濃度的ST溶液進行測定,如圖2所示,峰電流隨ST濃度的增加而增加。
二、微分脈沖伏安法檢測選擇微分脈沖伏安掃描模式,設置電化學參數如下脈沖振幅50mv;采集數據電位區間-1000mv~+1200mv;采樣寬度20ms;掃描速度100mv/s;靜息時間2s測試效果以交聯固化ADTZ酶修飾電極對不同濃度的ST溶液進行微分脈沖伏安掃描,所測結果如圖3所示,表明該電極對ST敏感,不同的濃度下產生不同大小的脈沖信號(信號大小與濃度有正比例關系)。即雜色曲霉素的含量可以通過脈沖信號表示出來。
如圖4所示,以交聯固化ADTZ酶修飾電極在+400mv位置用微分脈沖伏安法對ST進行定量分析,得到在4.16×10-5~2.66×10-3g/L濃度范圍內,峰電流隨著ST濃度的增加而上升,ST的線性檢測范圍為4.16×10-5~1.33×10-3g/L,線性方程為ip=0.03C+0.497,R2=0.9023。而當ST的濃度1.33×10-3~2.66×10-3g/L時,峰電流已趨于平緩,并且當ST的濃度大于2.66×10-3g/L后,峰電流反而隨ST濃度的增加而下降。這可能于ST在水中溶解度低有關(≤g10-3g/L)。而且通常食品的ST污染亦不到這么高。
圖4表明本發明所指的電極對ST響應靈敏,產生的峰電流大小與ST的含量成正比例關系,即可以通過峰電流表示樣品中雜色曲霉素的含量。
由于雜色曲霉素(ST)與黃曲霉毒素(AFT)B1在結構上相似,在ADTZ催化下發生相似的氧化反應,均可在上述反應過程中產生可以被檢測的電信號。因此,本實施例所述的檢測方法,同樣可用于檢測黃曲霉毒素(AFT),并達到相近的靈敏度。
權利要求
1.用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極,包括基底層與在基底層上形成的反應層,其特征在于所述的反應層包含電子介體和黃曲霉毒素解毒酶,電子介體固定在基底層上成膜,該膜作為酶載體聯結黃曲霉毒素解毒酶,形成黃曲霉毒素解毒酶修飾電極。
2.根據權利要求1所述的生物傳感器電極,其特征在于所述的電子介體由在酸氧化環境下活化的多壁碳納米管構成,其通過蛋白交聯劑聯結黃曲霉毒素解毒酶。
3.根據權利要求2所述的生物傳感器電極,其特征在于所述的多壁碳納米管是以硝化氧化方式活化處理所得的羧基化多壁碳納米管。
4.根據權利要求2所述的生物傳感器電極,其特征在于所述的蛋白交聯劑為EDC、NHS。
5.一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極的制備方法,其特征在于包括以下步驟A、將多壁碳納米管進行羧基化的活化處理,加表面活性劑促溶并配成羧基化多壁碳納米管溶液;B、制備黃曲霉毒素解毒酶;C、以羧基化多壁碳納米管溶液對基底層進行修飾成膜;在黃曲霉毒素解毒酶的酶液中加入適量的底物即雜色曲霉素粉末和/或黃曲霉毒素粉末,底物的加入量足以保護黃曲霉毒素解毒酶的活性中心,混勻,滴加于電極表面,羧基化多壁碳納米管聯結黃曲霉毒素解毒酶,得到黃曲霉毒素解毒酶修飾的生物傳感器電極。
6.根據權利要求5所述的制備方法,其特征在于所述的步驟C中,滴加于電極表面的黃曲霉毒素解毒酶酶液中還加入適量的穩定劑,穩定劑的加入量與酶液的體積比為1∶10。
7.一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極的制備方法,其特征在于包括以下步驟A、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管用王水回流8~12小時,離心,棄上清,干燥后為羧基化多壁碳納米管;稱取羧基化多壁碳納米管溶于二甲基甲酰胺中,超聲波攪拌均勻后,配成0.01~1.0mg/ml的羧基化多壁碳納米管溶液;B、黃曲霉毒素解毒酶的制備采用Armillariella sp.菌體破碎提取法制得黃曲霉毒素解毒酶,或者采用基因工程方法獲得黃曲霉毒素解毒酶;配制成蛋白濃度為0.2mg/ml的酶液,備用;C、多壁碳納米管修飾酶電極的制備以金電極為基底層,打磨至光亮,并依次在丙酮,強堿溶液,強酸溶液以及蒸餾水中超聲波清洗,將步驟A所得的羧基化多壁碳納米管溶液滴加在電極表面,烘干成膜;再依次分別浸入100g/L的EDC溶液和100g/L的NHS溶液中30分鐘;取步驟B所得的酶液100μl加入0.01~0.5μg的底物即雜色曲霉素粉末和/或黃曲霉毒素粉末,混勻,滴加于電極表面,15~25℃放置30分鐘后,在用于配制EDC溶液和NHS溶液的PBS溶液中清洗數次;將電極置于黃曲霉毒素解毒酶酶液中0~4℃下12~24小時,用PBS緩沖液沖洗電極數次,洗去電極表面未固定上的酶,即得到黃曲霉毒素解毒酶修飾的生物傳感器電極。
8.根據權利要求7所述的制備方法,其特征在于所述的步驟C中,每100μl酶液中還加入10μl的穩定劑PEG-200,混勻,然后滴加于電極表面。
9.一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極的制備方法,其特征在于包括以下步驟A、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管用王水回流8~10小時,10000g離心15分鐘,棄上清,用雙蒸水清洗沉淀,10000g離心15分鐘,洗滌沉淀,重復此步驟兩次;將沉淀置于烘箱中烘干,為羧基化多壁碳納米管;稱取上述1mg羧基化多壁碳納米管溶于10ml的二甲基甲酰胺中,超聲波攪拌均勻后,配成0.1mg/ml的溶液;B、黃曲霉毒素解毒酶的制備采用Armillariella sp.菌體破碎提取法制得黃曲霉毒素解毒酶,或者采用基因工程方法獲得黃曲霉毒素解毒酶;配制成蛋白濃度為0.2mg/ml的酶液,備用;C、多壁碳納米管修飾酶電極的制備將金電極以牙膏、硅藻土在絨布上打磨至光亮,并依次在丙酮、0.5mol的NaOH溶液、1∶1濃硝酸以及雙蒸水中超聲波清洗,每次3~5分鐘,將10μl羧基化多壁碳納米管溶液滴加在電極表面,置于60℃烘箱中烘干成膜;再依次分別浸入100g/L的EDC溶液和100g/l的NHS溶液中30分鐘,EDC溶液和NHS溶液均以0.01M,pH7.4PBS配制;取步驟B所得的酶液100μl加入0.01~0.5μg的底物即雜色曲霉素粉末和/或黃曲霉毒素粉末,在振蕩器上混勻后,取20μl滴加于電極表面,15~25℃放置30分鐘后,在0.01M,pH7.4PBS溶液中清洗數次;為減低黃曲霉毒素解毒酶的酶分子活性中心在交聯過程中載體上失活,采用底物保護酶活性中心的方法,先用底物即雜色曲霉素和/或黃曲霉毒素封閉黃曲霉毒素解毒酶的酶活性中心和維持構象的必需基團,然后用交聯劑EDC、NHS將黃曲霉毒素解毒酶固定在羧基化多壁碳納米管載體上,最后去掉保護劑即雜色曲霉素和/或黃曲霉毒素;將電極置于黃曲霉毒素解毒酶酶液中0~4℃下過夜,用PBS緩沖液沖洗電極數次,洗去電極表面未固定上的酶,即得到黃曲霉毒素解毒酶修飾的生物傳感器電極。
10.根據權利要求9所述的制備方法,其特征在于所述的步驟C中,每100μl酶液中還加入10μl的穩定劑PEG-200,混勻,然后滴加于電極表面。
全文摘要
本發明涉及一種用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極,以及該生物傳感器電極的制備方法。本發明所述的用于檢測黃曲霉毒素及雜色曲霉素的生物傳感器電極,包括基底層與在基底層上形成的反應層,所述的反應層包含電子介體和黃曲霉毒素解毒酶,電子介體固定在基底層上成膜,該膜作為酶載體聯結黃曲霉毒素解毒酶,形成黃曲霉毒素解毒酶修飾電極。本發明利用發明人報道的黃曲霉毒素解毒酶首次制備出生物傳感器電極,與現有技術相比,具有響應快、信號靈敏、特異性高、使用方便、可定量檢測等優點。本發明所述的生物傳感器電極的靈敏度可達到1ppm~10ppb的水平。本發明省時、省力,操作簡單,幾乎無須培訓即可推廣應用。
文檔編號G01N27/403GK1719243SQ200410028018
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月9日 優先權日2004年7月9日
發明者姚冬生, 劉大嶺, 文圣梅, 謝春芳, 鄭文杰 申請人:暨南大學
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