基于特異識別AFB1納米抗體的親和吸附材料的制作方法

文檔序號:11241088

本發明涉及一種基于單域重鏈抗體(又稱納米抗體技術)的免疫親和吸附材料,特別是針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料。

技術背景

黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉菌、寄生曲霉菌等真菌產生的劇毒次級代謝產物。它們的化學結構類似,為二呋喃香豆素衍生物,主要包括黃曲霉毒素B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG1)和M1(AFM1)等。在天然污染的食品和飼料中,AFB1的污染最為常見,其毒性和致癌性也最強,被世界衛生組織的癌癥研究機構劃定為Ⅰ類致癌物。世界各國及地區指定了嚴格的黃曲霉毒素限量標準,例如歐盟嬰幼兒食品中AFB1允許量≤0.10μg/kg。

現有的黃曲霉毒素檢測方法主要有儀器分析法、免疫分析法以及薄層層析法。其中儀器分析法具有靈敏度高、準確性和重復性好等優點,但是對于分析樣品前處理要求較高,需要盡量去除樣品中的雜質以減少對后續檢測的干擾。傳統的前處理方法有液相萃取、固相萃取等,處理過程繁瑣且特異性不高。親和層析技術基于配基與待測物質之間特異性的識別,可通過一步操作實現對復雜混合樣品中待測物的分離純化。目前使用的黃曲霉毒素親和純化介質一般采用多克隆抗體或單克隆抗體作為配基,存在不耐有機試劑、活性迅速降低的問題。因此,需要開發活性高、穩定性好的新型配基替換傳統抗體。單域重鏈抗體是由羊駝重鏈抗體的可變區組成,又稱為納米抗體,具有耐酸堿、耐高溫以及易于生產等特性,相較于傳統抗體具有明顯的優勢。



技術實現要素:

本發明的目的是提供一種針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料及其應用。

為實現上述目的,本發明采用如下技術方案:

針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料(基于特異識別AFB1納米抗體的親和吸附材料)包括載體和配基,所述配基為單域重鏈抗體,具有SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:3、SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:9、SEQ ID NO.:11、SEQ ID NO.:13所示的氨基酸序列。該配基可特異性識別黃曲霉毒素。

所述配基還可以為在前述序列的單域重鏈抗體基礎上通過隨機或定點突變技術進行改造所獲得的能與黃曲霉毒素特異性結合的抗體。

所述載體為磁珠、瓊脂糖凝膠微球、硅膠微球或多孔材料。

上述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的制備方法,其特征為:

所述載體為磁珠時,制備方法為:取1mg羧基磁珠于離心管中,加入500~1000μl活化緩沖液(10mM,NaH2PO4,pH6.0),渦旋混合均勻,磁力架回收磁珠,再用活化緩沖液洗滌2遍。分別加入1~5mg碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),渦旋混合后,靜置30min。用偶聯緩沖液(10mM,Na2HPO4,pH 7.4)洗滌磁珠3遍,加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體,室溫反應2~6h,得到共價偶聯了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫磁珠;

所述載體為瓊脂糖凝膠微球時,制備方法為:將CNBr活化的干膠用0.1M HCl洗滌10~15次,每次平衡5~10min。用偶聯緩沖液(10mM,Na2HPO4,pH 7.4)洗滌5~15次,加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體,室溫反應2~10h,得到共價偶聯了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料;

所述載體為硅膠微球時,制備方法為:將硅膠微球用純水和磷酸緩沖液(PBS,10mM,pH 6.0)交替洗滌5~10次,用PBS緩沖液懸浮硅膠微球,加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體,混勻,加入終濃度1~10mg/ml的碳二亞胺(EDC),迅速混勻,4℃攪拌反應12~24h,得到共價偶聯了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。

將上述免疫親和吸附材料(載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球)裝填至層析柱,即得到黃曲霉毒素免疫親和層析柱,方法為:根據層析柱容量,取適量上述免疫親和吸附材料于層析柱,加入5~10倍柱床體積的PBS(10mM,pH 7.4)洗滌后,4℃,保存于20%乙醇溶液。

共價偶聯了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫磁珠無需裝柱,直接吸附后磁鐵分離。

本發明還涉及裝載有所述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的親和層析柱。

上述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的應用,用所述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料對樣品提取液進行凈化,富集黃曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1或AFG2)。黃曲霉毒素免疫親和吸附材料在去除黃曲霉毒素、凈化黃曲霉毒素污染物料中的應用。這種處理不以疾病診斷治療為目的。當免疫吸附材料的載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球時,方法為:首先用純水清洗免疫吸附材料,加入樣品提取液,然后用純水淋洗,再用甲醇洗脫特異性吸附的黃曲霉毒素,收集的洗脫液,即為凈化和富集后的樣品提取液,可用于后續分析檢測。當載體為磁珠時,方法為:將免疫磁珠加入純水中,磁力架回收磁珠,重復清洗3~5次,然后將免疫磁珠加入樣品提取液中,混勻,磁力架回收磁珠,純水清洗1~3次后,甲醇洗脫特異性吸附的黃曲霉毒素,收集的洗脫液,即為凈化和富集后的樣品提取液,可用于后續分析檢測。

本發明針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料配基為單域重鏈抗體,具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列,該配基可特異性識別黃曲霉毒素。該單域重鏈抗體容易獲得,可以通過生物學方法大量培養生產配基為單域重鏈抗體,避免了人工抗體等繁瑣生產方法,大大降低了生產成本。生產過程無需接觸黃曲霉毒素,避免了對生產人員身體傷害。具有耐酸堿、耐高溫以及易于生產等特性,這些特性對于黃曲霉毒素的低成本、可重復使用的免疫學檢測方法有重要的實用價值。

具體實施方式

下面通過黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的制備及應用,對本發明做進一步說明,這些具體實施例不應以任何方式被解釋為限制本發明的應用范圍。

實施例1:

抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體(即針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體)免疫文庫的構建

將黃曲霉毒素B1與匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)共價偶聯,得到黃曲霉毒素人工抗原AFB1-KLH,取300μg AFB1-KLH與弗氏完全佐劑乳化后,對羊駝(Lama pacos)進行皮下多點注射免疫。加強免疫采用150μg AFB1-KLH與弗氏不完全佐劑乳化,間隔2周進行,每次免疫7天后靜脈取血,采用間接ELISA法測定血清效價,選擇血清效價最高的樣品分離淋巴細胞,提取RNA。

RNA的提取參照TAKARA公司RNAiso試劑說明書進行。以RNA為模板,oligo dT為引物,參照TAKARA公司反轉錄酶說明書合成cDNA第一鏈。

采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶,經巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區編碼基因(采用的引物見表1)。第一輪PCR分別以引物AlpVh-LD和CH2-R擴增cDNA,反應條件為,98℃,10s,55℃,20s,72℃,1min,20個循環,98℃,10s,68℃,1min,72℃延伸10min。

將第一輪PCR產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳,回收600bp~750bp的DNA片段,作為第二輪PCR的模板,分別用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHR1-NotI,AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI,進行擴增,反應條件為,98℃,10s,50℃,20s,72℃,40s,5個循環,98℃,10s,68℃,40s,30個循環,72℃延伸10min。經DNA片段回收試劑盒回收、定量,于-20℃保存備用。將噬菌粒pHEN1和PCR擴增產物分別用Sfi I、Not I雙酶切,經瓊脂糖凝膠回收、定量后,以1∶3摩爾比,在16℃,過夜連接。

表1文庫構建及鑒定所用的引物

注:下劃線表示限制性內切酶識別序列

連接產物經乙醇沉淀后,溶于10μL無菌水,分十次進行電穿孔轉化大腸桿菌TG1。取10μL電擊、培養后的菌液倍比稀釋,涂布氨芐青霉素2×YT培養板,37℃,倒置培養12~16h,采用引物M13-R和pHEN-R進行菌落PCR,計算庫容;其余部分全部涂布于24cm×24cm氨芐青霉素2×YT培養板,37℃,倒置培養12~16h。用10mL,2×YT培養基將培養板上的菌苔刮洗后,加入終濃度15~30%甘油,分裝,-80℃保存備用。

根據計算的庫容量結果,接種10倍庫容量的活細胞于20mL的2×YT(含2%葡萄糖,100μg/mL氨芐青霉素),30℃,220r/min培養至OD600達0.5,按感染復數20∶1加入輔助噬菌體,37℃,220r/min,60min。將培養物離心,用50mL的2×YT(含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素)重懸沉淀,30℃,220r/min過夜培養后,3000g離心取上清,加入5×PEG/NaCl溶液,冰上放置1h或4℃過夜,12000rpm離心30min,重懸沉淀于含10%甘油的磷酸緩沖液(PBS,0.01M,pH 7.4),即得到抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體免疫文庫,取10μL測定滴度,其余分裝于-80℃保存備用。

實施例2:

抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的淘選與鑒定

采用固相親和淘選的方法從實施例1所得抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體免疫文庫文庫中淘選針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體。將AFB1與卵清白蛋白(albumin,OVA)共價偶聯,得到人工抗原AFB1-OVA。每孔加入100μL用PBS稀釋的人工抗原AFB1-OVA,4℃,包被過夜,每輪淘選的包被濃度分別為100,75,50μg/mL;吸出包被液,PBS洗板3次,每孔加入300μL 3%BSA-PBS,37℃,封閉2h;PBS洗板6次,加入100μL噬菌體抗體文庫(約含2×1011CFU),37℃,孵育1.5h;吸出未結合的噬菌體,用PBST(含0.5%Tween-20)洗板5次(逐輪增加5次),再用PBS洗板10次(洗板次數逐輪增加5次);以100μL洗脫液(甘氨酸-鹽酸,pH2.2)洗脫吸附在酶標孔中的噬菌體,用50μL Tris-HCl(1mol/L,pH 8.0)中和洗脫物,取10μL用于滴度測定,其余洗脫物擴增后用于下一輪淘選。第二輪和第三輪淘選采用競爭洗脫,分別用50和25ng/mL的AFB1溶液在37℃,孵育1h。

經三輪淘選后,采用輔助噬菌體KM13對隨機挑取的單克隆進行救援,分別得到展示抗體可變區的噬菌體顆粒,再用間接phage-ELISA和間接競爭phage-ELISA測定噬菌體顆粒的結合活性和特異性,實驗設定陰性對照及背景對照,具體加樣步驟見表2。

表2間接phage-ELISA加樣表

將ELISA陽性克隆送生物技術服務公司進行序列測定,得到插入片段的DNA序列,其編碼針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體,具體如下:

G8(SEQ ID NO.:2):

CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCAGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCGGCACAATCTATGGCATGGGCTGGTTCCGCGAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCGACTCTTTGGTGGACTGTTGGTGCCCCATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGACAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCACGTATTACTGTGCATTAGATAACCGCCGCAGTTATGTTGATTACCACTCCGTAAGTGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

G4(SEQ ID NO.:4):

CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTACGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCGGCACAATCTATGGCATGGGCTGGTTCCGCGAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCGACTATTTGGTGGACTGTTGGTGCCCCATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGACAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGCATTAGATAACCGCCGCAGTTATGTTGATTACTACTCCGTAAGTGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

D7:(SEQ ID NO.:6):

CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCCGGTGGAGGCTTGGTGCAGGTTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCGGCACAATCTATGGCATGGGCTGGTTCCGCGAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAACTATTTGGTGGACTGTTGGTGCTCCATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGCCAAGAACACGGTATATCTGCAAATGAATAGCCTGAAAGTTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGCATTAGATAACCGCCGCAGTTATGTTAATTACTACTCCTCAAGTGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

C6:(SEQ ID NO.:8):

CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCGGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGACGCACCGGCACAATCTATGGCATGGGCTGGTTCCGCGAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTTGCGACTATTTGGTGGACTGTTGGTGCCCCATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGACAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGCATTAGATAATCGCCGCAGTTATGTTGATTACCACTCCGTAAGTGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

H4:(SEQ ID NO.:10):

CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCGGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGACGCACCGGCACAATCTATGGCATGGGCTGGTTCCGCGAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTTGCGACTATTTGGTGGACTGTTGGTGCCCCATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGACAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGCATTAGATAATCGCCGCAGTTATGTTGATTACCACTCCGTAAGTGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

H8:(SEQ ID NO.:12):

CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCGGGGGGAGGAGCGGTGCAGGCTGGGGGCTCTTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCGGCACAATCTATGGCATGGGCTGGTTCCGCGAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTTGCGACTATTTGGTGGACTTTTGATGCCCCATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGACAAGAACACGGTGTATCTACAAATGAACAACCTGAGCCCTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGCATTAGATAATCGCCGCAGTTATGTTGATTACCGCTCCGTAAGTGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

E12:(SEQ ID NO.:14):

CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTCACACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCACAACGTATGGCATGGGCTGGTTCCGCGAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAACTATGTGGTGGACTGTTGGTGCCCCATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCACTAGAGACAGCGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGTTAGATACCCGCCGCAGTTATGTTGATTACCGCTCCTCAAGTGAGTATGATTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

依據DNA測序結果及密碼子表可獲得相應的針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體的氨基酸序列:

G8(SEQ ID NO.:1):

QLQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTGTIYGMGWFREAPGKEREFVATLWWTVGAPYYADSVKGRFTISRDNDKNTVYLQMNSLKPEDTATYYCALDNRRSYVDYHSVSEYDYWGQGTQVTVSS

G4(SEQ ID NO.:3):

QVQLVESGGGLVQAGGSTRLSCAASGRTGTIYGMGWFREAPGKEREFVATIWWTVGAPYYADSVKGRFTISRDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCALDNRRSYVDYYSVSEYDYWGQGTQVTVSS

D7:(SEQ ID NO.:5):

QLQLVESGGGLVQVGGSLRLSCAASGRTGTIYGMGWFREAPGKEREFVATIWWTVGAPYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKVEDTAIYYCALDNRRSYVNYYSSSEYDYWGQGTQVTVSS

C6:(SEQ ID NO.:7):

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGRTGTIYGMGWFREAPGKEREFVATIWWTVGAPYYADSVKGRFTISRDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCALDNRRSYVDYHSVSEYDYWGQGTQVTVSS

H4:(SEQ ID NO.:9):

QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGRTGTIYGMGWFREAPGKEREFVATIWWTVGAPYYADSVKGRFTISRDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCALDNRRSYVDYHSVSEYDYWGQGTQVTVSS

H8:(SEQ ID NO.:11):

QVQLVESGGGAVQAGGSLRLSCAASGRTGTIYGMGWFREAPGKEREFVATIWWTFDAPYYADSVKGRFTISRDNDKNTVYLQMNNLSPEDTAIYYCALDNRRSYVDYRSVSEYDYWGQGTQVTVSS

E12:(SEQ ID NO.:13):

QLQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASGRTFTTYGMGWFREAPGKEREFVATMWWTVGAPYYADSVKGRFTITRDSAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCALDTRRSYVDYRSSSEYDYWGQGTQVTVSS

采用間接競爭phage-ELISA法對陽性克隆與幾種不同黃曲霉毒素亞型的交叉反應率進行測定,將AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1五種標準品稀釋至12個不同的工作濃度,在同樣的條件下進行間接競爭phage-ELISA測定,分別繪制競爭ELISA曲線,計算抑制率為50%時的標準品濃度(IC50),按照公式:交叉反應率(%)=(AFB1IC50/類似物IC50)×100%,所述類似物為AFB2、AFG1、AFG2或AFM1,得到本發明陽性克隆(針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體)對于AFB1的50%抑制濃度。結果表明,本發明陽性克隆(針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體)對于AFB1具有較好的特異性,對AFG1和AFG2也有一定的結合能力。

實施例3:

抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的規模制備

編碼抗AFB1單域重鏈抗體的DNA片段的獲?。?.采用限制性內切酶SfiI/NotI,雙酶切噬菌粒pHEN-抗AFB1單域重鏈抗體基因,瓊脂糖凝膠電泳回收抗AFB1單域重鏈抗體基因;2.直接將抗AFB1單域重鏈抗體編碼序列送生物技術服務公司進行化學合成;3.設計特異性引物,通過PCR技術從羊駝(Lama pacos)來源的cDNA庫中擴增。

將得到的抗AFB1單域重鏈抗體基因片段克隆至表達載體pET25,經PCR和酶切鑒定,構建完成抗AFB1單域重鏈抗體的大腸桿菌表達質粒。

將表達質粒轉化至大腸桿菌BL21,挑取單菌落進行誘導表達。將單菌落接入4mL LBA(Luria-Bertani broth with 100μg/mL ampicillin)液體培養基中,37℃、250r/min振蕩培養12h;以1%培養基體積的接種量將其轉接到50mL LBA液體培養基中,37℃、250r/min振蕩培養至OD600達到0.5(約需2.5~3h),加入終濃度0.1mM的IPTG,30℃、200r/min誘導培養。

誘導培養物8000r/min離心,在細胞沉淀中加入20mL磷酸緩沖液(pH 7.4)混勻,8000r/min離心,去上清,保留細胞沉淀;在細胞沉淀中加入10mL相同緩沖液,混勻,冰上超聲波細胞破碎處理,超聲破碎條件為200W,破碎2s,間歇3s,共240個循環,在4℃下對細胞破碎物12000r/min離心20min,取上清進行親和層析純化和SDS-PAGE電泳分析,或在上清中加入終濃度30%的甘油,混勻,保存于-20℃冰柜待用。

通過優化誘導表達條件(如宿主菌、表達載體、誘導培養時間、溫度以及IPTG濃度等),可以進一步提高目的蛋白(單域重鏈抗體)表達量,為大量制備抗AFB1單域重鏈抗體提供了途徑。

實施例4黃曲霉毒素免疫親和磁珠的小量制備

采用納米磁珠作為載體,偶聯抗黃曲霉單域重鏈抗體后,得到黃曲霉毒素免疫磁珠,具體制備方法如下:

取1mg羧基修飾的磁珠(購自無錫百運納米科技有限公司,羧基磁珠300nm)于離心管中,加入500μl活化緩沖液(10mM,NaH2PO4,pH 6.0),渦旋混合均勻,磁力架回收磁珠,再用活化緩沖液洗滌2遍。分別加入2mg碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),渦旋混合后,靜置30min。用偶聯緩沖液(10mM,Na2HPO4,pH 7.4)洗滌磁珠3遍,加入溶于偶聯緩沖液的抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體1mg,室溫反應3h,用偶聯緩沖液洗滌磁珠3次,加入500μl含1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)或1%(w/v)卵清蛋白(OVA)的偶聯緩沖液封閉未反應的活性基團,室溫反應30min。用偶聯緩沖液洗滌磁珠3次,PBS溶液(10mM,pH7.4,0.02%w/v,Na3N)重懸后保存于4℃。

實施例5黃曲霉毒素免疫親和吸附材料及親和柱的制備

采用瓊脂糖微球作為載體,偶聯抗黃曲霉單域重鏈抗體,具體制備方法如下:

將CNBr活化的干膠用0.1M HCl洗滌10次,每次平衡5min。用偶聯緩沖液(10mM,Na2HPO4,pH 7.4)洗滌10次,加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體(2mg/每克瓊脂糖微球),室溫反應4h,使抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體與CNBr活化的瓊脂糖凝膠微球共價偶聯。用偶聯緩沖液(10mM,Na2HPO4,pH 7.4)洗滌2次后,加入封閉液室溫反應2h以封閉未反應的活性基團。用5被膠體積的磷酸緩沖液(10mM,pH 7.4)和醋酸緩沖液(0.1M,pH 4.0)交替洗滌3次,得到共價偶聯了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。取0.2ml上述免疫親和吸附材料于容量為1ml的層析柱,5~10倍柱床體積的PBS(10mM,pH 7.4)洗滌后,加入20%乙醇溶液,4℃保存。

實施例6黃曲霉毒素免疫親和吸附材料及親和柱的制備

采用硅膠微球作為載體,偶聯抗黃曲霉單域重鏈抗體,具體制備方法如下:

取2g硅膠微球用純水和磷酸緩沖液(PBS,10mM,pH 6.0)交替洗滌5~10次,用10ml PBS緩沖液懸浮硅膠微球,加入5mg抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體,混勻,加入終濃度5mg/ml的碳二亞胺(EDC),迅速混勻,4℃攪拌反應12~24h,得到共價偶聯了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。取0.2ml上述免疫親和吸附材料于容量為1ml的層析柱,5~10倍柱床體積的PBS(10mM,pH 6)洗滌后,加入含0.02%(w/v)Na3N的PBS(10mM,pH 6),4℃保存。

實施例7黃曲霉毒素免疫親和柱柱容量、加標回收率、重復使用測定

將實施例5或實施例6制備的親和層析柱用5ml PBS(10mM,pH 7.4)洗滌,加入5ml濃度為100ng/ml的AFB1標準品溶液,10ml純水淋洗,用1ml甲醇洗脫,收集洗脫液用高效液相色譜檢測洗脫液中AFB1的含量,計算得出親和層析柱的容量為650~800ng。

取5g粉碎的花生、玉米樣品(不含黃曲霉毒素),分別加入50ng、100ng和200ng的AFB1或AFG1標準品,用60%(v/v)甲醇-水溶液提取樣品,渦旋振蕩15min,快速定性濾紙過濾,取5ml濾液,加PBS(10mM,pH 7.4)稀釋。

將實施例5或實施例6制備的親和層析柱用5ml PBS(10mM,pH 7.4)洗滌,加入10ml樣品提取稀釋液,10ml純水淋洗,用1ml甲醇洗脫,收集洗脫液用高效液相色譜檢測AFB1或AFG1的含量,計算回收率。結果顯示制備的親和柱對AFB1或AFG1的平均回收率分別為85~101%,80~97%。重復使用10次后,親和柱對AFB1或AFG1的平均回收率>80%。

SEQUENCE LISTING

<110> 南昌大學

<120> 基于特異識別AFB1納米抗體的親和吸附材料

<130> 2015

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Asn Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Ile Tyr Ser Leu Val

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Ile Thr Arg Val Gly Asn Thr Asn His Ala Asn Ser Arg Glu

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Gly Val Pro Trp Asn Thr Val Ile Leu

65 70 75 80

Ser Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Arg Arg Thr Leu Ser Arg Val Leu Gly Thr Lys Arg Asp Glu Tyr

100 105 110

Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caggtgcagc tcgtggagta ggggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtacag cctctggaag catctatagc ctcgttgcca tgggctggta ccgccaggct 120

ccagggaagc agcgcgagtg ggtcgcagat attactcgtg ttggtaacac aaaccatgcg 180

aactccaggg aggaccgatt caccatctcg acaggtgtcc cctggaacac ggtgattctg 240

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ctctcacggg tacttggcac gaagagagat gagtataact actggggcca ggggacccag 360

gtcaccgtct cctca 375

<210> 3

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Thr Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Gly Thr Ile Tyr

20 25 30

Gly Met Gly Trp Phe Arg Glu Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Thr Ile Trp Trp Thr Val Gly Ala Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Leu Asp Asn Arg Arg Ser Tyr Val Asp Tyr Tyr Ser Val Ser Glu

100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

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<210> 4

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

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caggtgcagc tcgtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tacgagactc 60

tcctgtgcag cctctggacg caccggcaca atctatggca tgggctggtt ccgcgaggct 120

ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcgact atttggtgga ctgttggtgc cccatactat 180

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ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccattt attactgtgc attagataac 300

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caggtcaccg tctcctca 378

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Val Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Gly Thr Ile Tyr

20 25 30

Gly Met Gly Trp Phe Arg Glu Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

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Ala Thr Ile Trp Trp Thr Val Gly Ala Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Val Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Leu Asp Asn Arg Arg Ser Tyr Val Asn Tyr Tyr Ser Ser Ser Glu

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<213> 人工序列

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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

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cagttgcagc tcgtggagtc ggggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgtacag cctctggacg caccggcaca atctatggca tgggctggtt ccgcgaggct 120

ccagggaagg agcgtgagtt tgttgcgact atttggtgga ctgttggtgc cccatactat 180

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<212> DNA

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<220>

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<222> (44)..(44)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (47)..(47)

<223> n is a, c, g, or t

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<212> DNA

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gccccattca gatcctcttc 20

再多了解一些
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