豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的雙重實時熒光定量pcr檢測試劑盒及引物和探針的制作方法

文檔序號:10680079
豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的雙重實時熒光定量pcr檢測試劑盒及引物和探針的制作方法
【專利摘要】本發明一種用于檢測豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株gB基因和gE基因的雙重實時熒光定量PCR檢測試劑盒及其專用引物、TaqMan探針。本發明建立了針對gB基因和gE基因的雙重實時熒光定量PCR方法,能夠快速鑒別偽狂犬病野毒株(同時含有gB基因和gE基因)與基因缺失株(僅含有gB基因),并可對病毒拷貝數進行精確定量。本發明的試劑盒和檢測方法操作簡便、特異性強、靈敏度高,將在豬偽狂犬病毒的檢測、毒株鑒定及疫苗生產中發揮作用。
【專利說明】
豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的雙重實時黃光定量PCR檢 測試劑盒及引物和探針
技術領域
[0001] 本發明屬于動物病原檢測領域,設及鑒別豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的方 法,特別設及一種用于鑒別豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和巧基因的雙重實時 巧光定量PCR檢測方法及其專用引物、TaqMan探針、檢測試劑盒W及所述引物、探針在檢測 豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株中濁基因和巧基因中的應用。
【背景技術】
[0002] 偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病毒(PseudorabiesVirusJRV)引起的B 類傳染病(0IE認定),分布廣泛,危害嚴重,可W感染不同年齡段的豬,但W妊娠母豬和哺乳 仔豬感染最為嚴重,導致妊娠母豬流產、死胎和木乃伊胎,哺乳仔豬出現神經癥狀、麻搏、衰 竭死亡,死亡率高達100%。目前,偽狂犬病已成為對全球養豬業危害最大的傳染病之一,每 年給養豬業造成了巨大的經濟損失。
[0003] 偽狂犬病毒屬于瘤疹病毒科中的a瘤疹病毒亞科,基因組為雙鏈DNA分子,大小約 150kb,成熟病毒粒子攜帶50余種蛋白,其旨8、旨6、旨6、旨1、11(等毒力基因是其復制非必需基 因,其編碼的蛋白為非必需糖蛋白,缺失運些基因后,其復制擴增及抗原性并不受任何影 響,但毒力卻大大降低。巧基因是偽狂犬的主要毒力相關基因,也是世界動物衛生組織所規 定基因缺失疫苗的首選缺失基因。目前,歐美等發達國家應用巧基因缺失疫苗及其配套的 鑒別診斷方法已實現了偽狂犬的凈化,中國也已廣泛使用巧基因缺失弱毒疫苗用于偽狂犬 的預防和控制。濁基因是偽狂犬病毒復制所必需的基因,在野毒株與基因缺失株中均存在。
[0004] 目前,國內外常用的實驗室診斷偽狂犬病毒的方法主要包括病毒分離、兔體接種 實驗、抗體診斷、病原學診斷、分子生物學診斷等幾大類,其中分子生物學診斷中的實時巧 光定量PCR檢測技術W其快速、簡便、準確等優點成為快速發展的檢測手段。
[0005] 實時巧光定量PCR技術(Quantitative Real-time PCR,qPCR)是 1996年由美國 Appl ied Biosystems公司推出的,該技術是指在PCR反應體系中加入巧光基團,利用巧光信 號積累實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析[Heid CA, Stevens J,Livak KJ,Williams PM.Real time quantitative PCR.Genome Res.19960ct; 6( 10): 986-94.]。實時巧光定量PCR作為一個極有效的實驗方法,已被廣泛地應用于分子生 物學研究的各個領域。與常規PCR相比該技術可快速、靈敏的檢測病毒RNA和DNAW及細菌 DNA,目前該方法已廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量、W及動物病原體的檢測、畜禽 產品的檢驗檢疫、生物制品的鑒定等領域[Jozefczuk J,Adjaye J.Quantitative real? time PCR-based analysis of gene expression.Methods Enzymol.2011;500:99-109.]。 目前針對濁基因和巧基因建立的雙重qPCR檢測方法較少,Ma等根據PRV濁和姐基因分別設 計引物和探針,建立了診斷PRV野毒株的巧光定量PCR方法,該方法對PRV野毒株具有良好的 擴增效果,而對疫苗缺失株及其他常見豬病原的檢測均為陰性[文獻l:Development of real-time polymerase chain reaction assays for rapid detection and differentiation of wild-typep seudorabies and gene-deleted vaccine viruses, MaW,LagerKM,Richt JA,et al.J Vet Dia即Invest,2008,20(4):440-447.]。馬興杰等針 對gB、姐和gG建立了的鑒別診斷PRV強弱毒的納米PCR檢測方法并組裝了試劑盒,試驗結果 表明,該試劑盒具有較高的靈敏性、特異性及可重復性,檢驗結果可靠[文獻2:鑒別豬偽狂 犬病毒巧/gB/gG的納米PCR及巧光定量PCR方法的建立及評價,馬興杰,中國農業科學院學 位論文]。雖如此,由于病毒變異的風險客觀存在,更豐富的檢測技術有助于防范病毒變異 所導致的檢測失利,本發明利用自主設計的引物和探針建立了豬偽狂犬病野毒株與基因缺 失株的鑒定、檢測方法,與其它學者的引物和探針具有差異性。

【發明內容】

[0006] 本發明的第一個目的是提供用于對豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和 姐基因進行雙重實時巧光定量PCR檢測的引物與TaqMan探針,W實現豬偽狂犬病野毒株與 基因缺失株的鑒別。
[0007] 本發明所提供的用于對豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和姐基因進行 雙重實時巧光定量PCR檢測的引物為:
[000引用于檢測gB基因的上游引物(gB-F)的核巧酸序列如序列表中SED ID N0:1所示, 用于檢測濁基因的下游引物(濁-R)的核巧酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示;
[0009] 用于檢測巧基因的上游引物(姐-F)的核巧酸序列如序列表中SED ID N0:3所示, 用于檢測巧基因的下游引物(巧-R)的核巧酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。
[0010]由上述引物衍生的引物序列也屬于本
【發明內容】
。所述衍生序列是指在沈Q ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和/或沈Q ID N0:4的基礎上經過一至十個堿基的取代、缺失 或添加得到的引物序列。
[0011] 本發明所提供的用于對豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和姐基因進行 雙重實時巧光定量PCR檢測的化qMan探針,用于檢測gB基因的化qMan探針(PRV-gB)的核巧 酸序列如序列表中SED ID NO: 5所示;用于檢測gB基因的化qMan探針(PRV-gE)的核巧酸序 列如序列表中SEQ ID N0:6所示;所述探針為經過巧光標記的,其5'端標記有報告巧光基 團,3 '端標記有澤滅巧光基團。
[0012] 由上述化qMan探針序列的衍生序列也屬于本
【發明內容】
。所述衍生序列是指在SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6的基礎上,在序列的5'端和/或3'端再添加、減少一個或多個堿基得 到的序列。
[001引所述PRV-gB的報告巧光基團為FAM,巧光澤滅基團為TAMRA;所述PRV-巧的報告巧 光基團為R0X,巧光澤滅基團為B冊2。
[0014] 為防止PCR擴增時被延伸,所述探針的3'端已經憐酸化處理。
[0015] 本發明的第二個目的是提供用于對豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和 巧基因進行雙重實時巧光定量PCR檢測的試劑盒。
[0016] 本發明所提供的實時巧光定量PCR檢測試劑盒,包括上述用于對豬偽狂犬病野毒 株與基因缺失株的濁基因和巧基因進行雙重實時巧光定量PCR檢測的引物和化qMan探針。
[0017] 具體來講,所述試劑盒包括W下用于25化雙重實時巧光定量PCR反應體系的試劑: 實時巧光定量PCR反應液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.扣L(購于hkaRa公司),濁-F(2化 M) 0.5化,gB-R(20yM) 0.5化,gE-F(20yM) 0.5化,gE-R(20yM) 0.5化,PRV-gB (1 OiiM) 1化,PRV- 邑6(10咖)1化,尺臟-化66出0 6.5化。
[0018] 為方便檢測,所述試劑盒中還可包括陽性對照和陰性對照,所述陽性對照為豬偽 狂犬病野毒株基因組DNA和豬偽狂犬病毒基因缺失株基因組DNA或分別攜帶豬偽狂犬病野 毒株濁基因和巧基因的重組質粒pGEM-gB和pGEM-gE,所述陰性對照為不含豬偽狂犬病野毒 株與基因缺失株的反應體系,如出〇(雙蒸水、無菌去離子水等)。
[0019] 本發明的第S個目的是提供一種用上述雙重實時巧光定量PCR檢測試劑盒及雙重 實時巧光定量PCR技術對豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和巧基因進行定性、定 量檢測的方法。
[0020] 利用本發明所提供的試劑盒對豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和姐基 因進行雙重實時巧光定量PCR檢測,可包括W下步驟:
[0021] 1)建立標準曲線:將分別攜帶豬偽狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重組質粒 pGEM-gB和pGEM-姐作為標準品,分別10倍梯度稀釋成1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 1〇5、1 X 104、1 X 103、1 X 102、1 X 1 〇1拷貝(copi eS) /化,W不同濃度的標準品作為模板,在上述引物 和TaqMan探針的引導下進行雙重實時巧光定量PCR檢測,檢測結束后,W各標準品的濃度 Log值(X軸)對其相應Ct值(Y軸)作圖,繪制標準曲線;
[0022] 2)提取待測樣品的基因組DNA,W提取的基因組DNA為模板,在上述引物和化qMan 探針的引導下進行雙重實時巧光定量PCR檢測;
[0023] 3)用得到的CT值或巧光信號的變化實現對濁基因和巧基因定性檢測,再根據巧光 信號的強度和步驟1)中的標準曲線,得出待測樣品中所含豬偽狂犬病毒gB基因和巧基因的 拷貝數,實現定量檢測。
[0024] 利用W上檢測結果,本發明提供一種鑒別豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的方 法,在上述步驟后還包括:
[00巧]4)結果判定:
[0026] 結果判定方法1:陽性對照樣品CT值<38,陰性對照樣品CT值>3別寸檢測成立,待 測樣品CT值<38時判定結果為陽性,CT值>38時則判定結果為陰性,若樣品中檢測到豬偽 狂犬病毒的gB基因和姐基因均為陽性,則判定樣品為豬偽狂犬病野毒株;若樣品中檢測到 濁基因為陽性,巧基因為陰性,則判定樣品為豬偽狂犬病毒基因缺失株;
[0027] 結果判定方法2:根據巧光信號的變化,對待測樣品中的gB基因和巧基因進行定性 檢測,同時出現gB基因和巧基因的巧光擴增曲線判定樣品為豬偽狂犬病野毒株,只出現gB 基因巧光擴增曲線判定樣品為豬偽狂犬病毒基因缺失株。
[0028] 在上述方法中,所述步驟2)中的待測樣品主要包括:血清、病毒細胞培養物。
[0029] 所述步驟1)和步驟2)中的25化雙重實時巧光定量PCR反應體系可包括:模板化L, 實時巧光定量PCR反應液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.扣L(購于hkaRa公司),濁-F(2化 M) 0.5化,gB-R(20yM) 0.5化,gE-F(20yM) 0.5化,gE-R(20yM) 0.5化,PRV-gB (1 OiiM) 1化,PRV- 姐(1〇咖)1化,RNA-free出0 6.化L。引物稀釋為20ngAiL,反應體系中最終加量為lOng。 化qMan探針稀釋為1 Ong/jiL,反應體系中最終加量為1 Ong。
[0030] 所述步驟1)和步驟2)中的實時巧光定量PCR反應條件可為:先95°C預變性2min;然 后95°C變性15s,60°C退火30s,共45個循環。在每個循環的延伸結束時進行巧光信號檢測。
[0031] 本發明提供了一種鑒別豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的雙重實時巧光定量PCR 檢測試劑盒與檢測方法。本發明的試劑盒中含有兩對引物和兩條探針,引物和探針分別針 對豬偽狂犬病病毒的濁基因和巧基因的保守區設計。本發明通過建立針對濁基因和巧基因 的雙重實時巧光定量PCR方法,能夠鑒別偽狂犬病野毒株(同時含有gB基因和巧基因)與基 因缺失株(僅含有gB基因),并可對病毒拷貝數進行精確定量。本發明可為疫苗生產過程中 的質量監控和合理化配苗提供有力依據,確保疫苗接種的安全性和合理性,對豬偽狂犬疫 苗的生產具有指導作用。本發明的試劑盒和檢測方法操作簡便、特異性強,將在豬偽狂犬病 毒的檢測及疫苗生產中發揮重要作用,應用前景廣闊。
[0032] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0033] 圖1為濁、巧基因雙重實時巧光定量PCR檢測濁基因的標準品擴增曲線;
[0034] 圖2為濁、巧基因雙重實時巧光定量PCR檢測濁基因的標準品標準曲線;
[0035] 圖3為濁、巧基因雙重實時巧光定量PCR檢測巧基因的標準品擴增曲線;
[0036] 圖4為濁、巧基因雙重實時巧光定量PCR檢測巧基因的標準品標準曲線;
[0037] 圖5為濁、巧基因雙重實時巧光定量PCR檢測特異性實驗的擴增曲線;
[0038] 圖6為濁、巧基因實時巧光定量PCR引物與探針篩選的擴增曲線。
【具體實施方式】
[0039] 下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法,具體步驟可參見: 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russel1,David W., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd edit ion,2001,NY,Cold Spring Harbor)。
[0040] 所述百分比濃度如無特別說明均為質量/質量(W/W,單位g/lOOg)百分比濃度、質 量/體積(W/V,單位g/lOOmU百分比濃度或體積/體積(V/V,單位mL/lOOmU百分比濃度。
[0041] 實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑W達 到具體公開的目的,不應成為對本發明生物材料來源的限制。事實上,所用到的生物材料的 來源是廣泛的,任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可W按照實施例中的提 示替換使用。
[0042] 所用引物由華大基因公司合成,TaqMan探針由化kara公司合成。
[0043] 實施例在W本發明技術方案為前提下進行實施,給出了詳細的實施方式和具體的 操作過程,實施例將有助于理解本發明,但是本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0044] 實施例1、設計對豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和姐基因進行雙重實 時巧光定量PCR檢測的引物及化qMan探針
[0045] 從NCBI的核酸數據庫GenBank化t1:p://www.ncbi .nlm.nih.gov)檢索獲得豬偽狂 犬病野毒株的gB基因(GenBank號:NC_006151)和巧基因(GenBank號:AF207700)的序列,用 DNA Man軟件進行比對后,根據引物設計原則,分別對gB基因和巧基因各設計3對引物對用 于PCR擴增,通過電泳結果各自篩選到引物特異性高、擴增效果好的引物對,確定gB基因特 異性的引物對序列為自5'端第17211-17574位堿基,姐基因特異性的引物對序列為自5'端 第443-1357位堿基;在此基礎上再用Primer Express 6.0軟件對豬偽狂犬病野毒株與基因 缺失株在該片段范圍進行雙重實時巧光定量PCR檢測的引物及TaqMan探針,各設計2對引物 探針,并通過單重巧光定量PCR進行優選,最終確定最優的濁基因特異性的引物探針序列為 自5'端第17411-17543位堿基,姐基因特異性的引物探針序列為自5'端第1060-1143位堿 基。
[0046] 引物和探針優選過程:分別對所設計的2對gB基因和巧基因 (gB 1、gB2; gE 1、巧2)巧 光定量引物與探針進行單重實時巧光定量PCR,所用反應體系與反應條件如下:
[0047] 1)25化單重實時巧光定量PCR反應體系可包括:模板化L,實時巧光定量PCR反應液 Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.扣L(購于hkaRa公司),上游引物F(20yM)0.扣L,下游引物 R(20山00.5化,探針(10咖)1化,RNA-free出08.5化。引物稀釋為20ng/iiL,反應體系中最終 加量為lOngeTaqMan探針稀釋為lOng/jiL,反應體系中最終加量為lOng。
[004引 2)單重實時巧光定量PCR反應條件可為:先95°C預變性2min;然后95°C變性15s,60 °C退火30s,共45個循環。在每個循環的延伸結束時進行巧光信號檢測。
[0049] 反應結束后比較CT值和平臺期所能達到的擴增值,篩選出較好的濁基因和巧基因 巧光定量引物與探針。實時巧光定量PCR擴增曲線見圖6。
[0050] 經過優選,本發明確定的對豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株進行雙重實時巧光定 量PCR檢測的引物及化qMan探針序列如下:
[0化1]濁基因上游引物(濁斗):5'-6641'(:1'〔6口'61461〇:46646-3'(沈0 10備:1)
[0化2]濁基因下游引物(濁-1〇:5'-646616〔01;464〔641'〔46-3'(沈0 10備:2);
[0化3]巧基因上游引物(邑6斗):5'-(:1'〔6164164〔〇:4〔44466-3'(沈0 10備:3)
[0化4]巧基因下游引物(邑6-10:5'-(:1764164〇1^'64〔614(:1'(:-3'(5邸10備:4);
[0055] gB基因 TaqMan巧光探針(PRV-gB) :5'-(FAM)TGACCCTGAACCTGACGCTGCTGGA (TAMRA)-3'(S邸 ID N0:5)
[0056] 姐基因 haMan巧光探針(PRV-gE): 5 ' -(ROX) CGCCACCTGGGACTACACGCT (BHQ2) -3 ' (沈D ID N0:6)。
[0057] PRV-gB的報告巧光基團為FAM,巧光澤滅基團為TAMRA;PRV-巧的報告巧光基團為 R0X,巧光澤滅基團為B冊2。為防止PCR擴增時被延伸,所述探針的3'端已經憐酸化處理。
[0058] 實施例2、用本發明的引物及TaqMan探針對豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB 基因和巧基因進行雙重實時巧光定量PCR檢測
[0化9] 一、提取待測樣品的基因組DNA
[0060] 對滅活的豬偽狂犬野毒株與基因缺失株的細胞培養物W及收集的12份臨床疑似 血清病料提取基因組DNA,具體方法包括W下步驟:
[0061] (1)分別取20化L滅活的偽狂犬野毒株與基因缺失株細胞培養物W及臨床血清加 入到1.5mL離屯、管中,加入ImL DNAzol裂解液振蕩混勻,靜置10分鐘裂解;
[00創 (2)12000rpm離屯、10分鐘,取上清約800化至新的1.5mL離屯、管中,加入500化無水 乙醇,輕輕混勻靜置5分鐘,使DNA析出;
[0063] (3) 1200化pm離屯、10分鐘,棄上清,加入80化L 75%乙醇洗涂DNA沉淀,輕輕混勻后 12000巧m離屯、5分鐘;
[0064] (4)重復上一步驟;
[0065] (5)棄上清,待離屯、管中殘留液體驚干后,加入20化無酶水溶解DM沉淀,-20°C凍 存備用。
[0066] 二、豬偽狂犬病毒濁基因和巧基因的雙重實時巧光定量PCR標準曲線的建立
[0067] 1、PCR擴增豬偽狂犬病毒濁基因和巧基因
[0068] 對步驟一提取的豬偽狂犬病毒野毒株基因組DNA進行PCR擴增,分別得到豬偽狂犬 病毒濁基因(引物為gB-F和濁-R)和巧基因(引物為巧-F和巧-R)的目的片段,2扣L反應體系 如下:
[00例表1濁基因和巧基因的PCR擴增體系 「00701
[0071] 2、標準品制備
[0072] 將純化回收的豬偽狂犬病毒濁基因和巧基因目的片段分別克隆至pGEM-T載體(購 自Promega公司)中,構建成重組質粒,并篩選陽性重組質粒送華大基因公司測序,驗證質粒 構建知否成功。測序結果表明獲得了序列正確的分別攜帶gB基因和巧基因的重組質粒,分 別命名為pGEM-濁和pGEM-巧。
[0073] 3、雙重實時巧光定量PCR標準曲線的建立
[0074] 對測序正確的分別攜帶gB基因和姐基因重組質粒pGEM-gB和pGEM-姐用化no化op 測定濃度,并計算各標準品的拷貝數,按照10倍梯度將gB基因和巧基因標準品分別稀釋至1 X 1〇8、1 X 1〇7、1 X 1〇6、1 X 1〇5、1 X 1〇4、1 X 1〇3、1 X 1〇2、1 X l〇icopiesAiL,每個樣品做2個重 復,W不同濃度的標準品作為模板,在引物和TaqMan探針的引導下進行雙重實時巧光定量 PCR檢測。
[0075] 雙重實時巧光定量PCR的反應體系(2化L)如下:
[0076] 表2濁基因和巧基因的雙重實時巧光定量PCR反應體系 r00771
[007引雙重實時巧光定量PCR的反應條件為:先95°C預變性2min;然后95°C變性15s,60°C 退火30s,45個循環。
[0079] 標準品的雙重實時巧光定量PCR擴增曲線如圖l(gB基因)和圖3(姐基因)所示,標 準品擴增曲線為平滑的"S"形曲線,圖中八組線條從左向右對應的標準品濃度分別為IX 108、lX107、lX106、lX105、lX104、lX103、lX102、lX10lcopiesA^L。檢測結束后,W各標 準品的濃度Log值(X軸)對其相應Ct值(Y軸)作圖,繪制標準曲線,標準曲線如圖2(gB基因) 和圖4(姐基因)所示,相關系數分別為R2 = 0.998與R2 = 0.993,誤差較小,標準曲線可用,由 標準曲線得到的線性方程為:
[0080] y = -0.998X+37.806 (gB基因)和y = -0.993X+42.716 (gE基因)。
[0081 ] 4、豬偽狂犬病臨床血清病料的雙重實時巧光定量PCR檢測
[0082] 用本發明建立的豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的雙重實時巧光定量PCR檢測試 劑與方法,對所收集的12份臨床疑似血清病料進行檢測,分別W滅活的豬偽狂犬病野毒株 細胞培養物和基因缺失株細胞培養物為陽性對照,W無酶水為陰性對照,根據gB基因和姐 基因雙重實時巧光定量PCR檢測結果,對臨床樣本所感染的豬偽狂犬病毒的類型進行判定, 并對所感染病毒的拷貝數進行定量。
[0083] 結果如表3所示,所檢測的12份疑似血清中有2份血清判定為陰性(不含gB基因和 巧基因,即未感染豬偽狂犬病毒),10份血清判定為陽性(感染豬偽狂犬病毒),其中4份血清 為豬偽狂犬病野毒株感染(含濁基因和巧基因),6份血清為豬偽狂犬病基因缺失株感染(僅 含濁基因,缺失巧基因)。
[0084] 表3疑似血清病料的雙重實時巧光定量PCR檢測結果
[0085]
[0086]
[0087]實施例3、本發明檢測方法的特異性實驗
[008引按照實施例2所述方法對豬攝病毒(CSFV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)提取RNA并進 行反轉錄,對豬圓環病毒2型(PCV2)、鼻氣管炎病毒(IBR)直接提取DNA,同時W滅活的豬偽 狂犬病野毒株細胞培養物為陽性對照,W無酶水為陰性對照,在本發明引物和化qMan探針 的引導下進行雙重實時巧光定量PCR檢測,PCR反應體系及反應條件參照實施例2,W驗證該 方法的特異性。
[0089] 檢測結果如圖5所示,陽性對照gB基因和姐基因的CT值分別為20/21 (< 38 ),結果 陽性;陰性對照CT值為41/40( >38),試驗成立;而豬攝病毒(CSFV)、牛病毒性腹瀉病毒 (BVDV)、豬圓環病毒2型(PCV2)、鼻氣管炎病毒(IBR)的CT值均>38,且未出現特定的擴增曲 線,結果陰性。檢測結果表明用本發明的方法可特異性地檢測出豬偽狂犬病野毒株。
[0090] 實施例4、本發明檢測方法的靈敏度實驗
[0091] 按照實施例2所述,將gB基因和姐基因標準品按照10倍梯度分別稀釋至IX 108、1 X 1〇7、1 X 1〇6、1 X 1〇5、1 X 1〇4、1 X 1〇3、1 X 1〇2、1 X l〇icopiesAiL,W不同濃度的標準品作為 模板,在本發明引物和TaqMan探針的引導下進行雙重實時巧光定量PCR檢測,PCR反應體系 及反應條件參照實施例2,W驗證該方法的靈敏度。
[0092] 結果濁基因和巧基因的擴增曲線如圖1和圖3所示,顯示gB基因和巧基因的雙重實 時巧光定量PCR檢測均可W檢測至lXl〇icopiesAiL,靈敏度較高,與文獻2檢測靈敏度相 當。
[0093] 實施例5:鑒別豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的雙重實時巧光定量PCR檢測試劑 盒
[0094] 基于實施例1和2,本發明所提供的實時巧光定量PCR檢測試劑盒,包括所述用于對 豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和巧基因進行雙重實時巧光定量PCR檢測的引物 和l^gMan探針。
[00M]具體來講,該試劑盒包括W下用于25化雙重實時巧光定量PCR反應體系的試劑:實 時巧光定量PCR反應液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.扣L(購于hkaRa公司),gB-F(20yM) 0.5化,gB-R(20yM) 0.5化,gE-F(20yM) 0.5化,gE-R(20yM) 0.5化,PRV-gB (1 OiiM) 1化,PRV-gE (10咖)1化,3臟-化66出0 6.5化。
[0096] 為方便檢測,試劑盒中還可包括陽性對照和陰性對照,陽性對照為豬偽狂犬病野 毒株基因組DNA和豬偽狂犬病毒基因缺失株基因組DNA或分別攜帶豬偽狂犬病野毒株gB基 因和姐基因的重組質粒pGEM-gB和pGEM-gE;陰性對照為不含豬偽狂犬病野毒株與基因缺失 株的反應體系,如出〇(雙蒸水、無菌去離子水等)。
[0097] 試劑盒中各試劑的使用可參考實施例2的內容。
【主權項】
1. 用于對豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和gE基因進行雙重實時熒光定量 PCR檢測的引物,是基于豬偽狂犬病野毒株的gB基因的特異性保守序列自5'端第17411-17543位堿基和gE基因的特異性保守序列自5 '端第1060-1143位堿基作為檢測序列,通過軟 件設計得到。2. 根據權利要求1所述的引物,其特征在于:用于檢測gB基因的上游引物(gB-F)的核苷 酸序列如序列表中SED ID ΝΟ:1所示,用于檢測gB基因的下游引物(gB-R)的核苷酸序列如 序列表中SEQ ID NO:2所示;用于檢測gE基因的上游引物(gE-F)的核苷酸序列如序列表中 SED ID NO:3所示,用于檢測gE基因的下游引物(gE-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 4所示。3. 用于對豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和gE基因進行雙重實時熒光定量 PCR檢測的TaqMan探針(0F-P),是基于豬偽狂犬病野毒株的gB基因的特異性保守序列自5 ' 端第17411-17543位堿基和gE基因的特異性保守序列自5'端第1060-1143位堿基作為檢測 序列,通過軟件設計得到。4. 根據權利要求3所述的TaqMan探針(0F-P),其特征在于:用于檢測gB基因的TaqMan探 針(PRV-gB)的核苷酸序列如序列表中SED ID N0:5所示,用于檢測gB基因的TaqMan探針 (PRV-gE)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 6所示;所述探針為經過熒光標記的,其5 '端 標記有報告熒光基團,3 '端標記有淬滅熒光基團。5. 根據權利要求4所述的TaqMan探針(0F-P),其特征在于:所述PRV-gB的報告熒光基團 為FAM,焚光淬滅基團為TAMRA;所述PRV-gE的報告熒光基團為R0X,焚光淬滅基團為BHQ2;為 防止PCR擴增時被延伸,所述探針的3'端已經磷酸化處理。6. 用于對豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和gE基因進行雙重實時熒光定量 PCR檢測試劑盒,包括權利要求1或2和權利要求3或4或5所述的用于對豬偽狂犬病野毒株與 基因缺失株的gB基因和gE基因進行雙重實時熒光定量PCR檢測的引物和TaqMan探針。7. 根據權利要求4所述的雙重實時熒光定量PCR檢測試劑盒,其特征在于:所述試劑盒 包括以下用于25yL雙重實時熒光定量PCR反應體系的試劑:實時熒光定量PCR反應液Premix Ex Taq(Probe qPCR) 12 · 5yL(購于TakaRa公司),gB-F(20yM)0 · 5yL,gB-R(20yM)0 · 5yL,gE-F (20μΜ)0·5yL,gE-R(20μΜ)0·5yL,PRV-gB(1ΟμΜ)lyL,PRV-gE(1ΟμΜ)1yL,RNA-free H20 6 · 5μ L〇8. 根據權利要求6或7所述的雙重實時熒光定量PCR檢測試劑盒,其特征在于:所述試劑 盒中還可包括陽性對照和陰性對照,所述陽性對照為豬偽狂犬病野毒株基因組DNA和豬偽 狂犬病毒基因缺失株基因組DNA或分別攜帶豬偽狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重組質粒 pGEM-gB和pGEM-gE,所述陰性對照為不含豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的反應體系,如 H20(雙蒸水、無菌去離子水等)。9. 權利要求6或7或8所述的雙重實時熒光定量PCR檢測試劑盒的應用,該應用為對豬偽 狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和gE基因進行定性、定量檢測,檢測包括以下步驟: 1)建立標準曲線:將分別攜帶豬偽狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重組質粒pGEM-gB 和pGEM-gE作為標準品,分別10倍梯度稀釋成1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102、1 X 101拷貝(C〇pieS)AiL,以不同濃度的標準品作為模板,在權利要求1所述引 物和權利要求2或3所述TaqMan探針的引導下進行雙重實時熒光定量PCR檢測,檢測結束后, 以各標準品的濃度Log值(X軸)對其相應Ct值(Y軸)作圖,繪制標準曲線; 2) 提取待測樣品的基因組DNA,以提取的基因組DNA為模板,在所述引物和TaqMan探針 的引導下進行雙重實時熒光定量PCR檢測; 3) 用得到的CT值或熒光信號的變化實現對gB基因和gE基因定性檢測,再根據熒光信號 的強度和步驟1)中的標準曲線,得出待測樣品中所含豬偽狂犬病毒gB基因和gE基因的拷貝 數,實現定量檢測; 所述步驟1)和步驟2)中的25yL雙重實時熒光定量PCR反應體系包括:模板2yL,實時熒 光定量PCR反應液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5yL,gB-F(20yM)0.5yL,gB-R(20yM)0.5y L,gE-F(20μΜ)0·5yL,gE-R(20μΜ)0·5yL,PRV-gB(ΙΟμΜ)lyL,PRV-gE(ΙΟμΜ)lyL,RNA-free H 20 6.5yL;雙重實時熒光定量PCR反應條件為:先95°C預變性2min;然后95°C變性15s,60°C 退火30s,共45個循環。10.-種鑒別豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的方法,在權利要求9所述步驟后還包 括: 4) 結果判定: 結果判定方法1:陽性對照樣品CT值<38,陰性對照樣品CT值多38時試驗成立,待測樣 品CT值<38時判定結果為陽性,CT值多38時則判定結果為陰性,若樣品中檢測到豬偽狂犬 病毒的gB基因和gE基因均為陽性,則判定樣品為豬偽狂犬病野毒株;若樣品中檢測到gB基 因為陽性,gE基因為陰性,則判定樣品為豬偽狂犬病毒基因缺失株; 結果判定方法2:根據熒光信號的變化,對待測樣品中的gB基因和gE基因進行定性檢 測,同時出現gB基因和gE基因的熒光擴增曲線判定樣品為豬偽狂犬病野毒株,只出現gB基 因熒光擴增曲線判定樣品為豬偽狂犬病毒基因缺失株。
【文檔編號】C12R1/93GK106048094SQ201610634845
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月3日 公開號201610634845.5, CN 106048094 A, CN 106048094A, CN 201610634845, CN-A-106048094, CN106048094 A, CN106048094A, CN201610634845, CN201610634845.5
【發明人】韓志玲, 張貴剛, 商曉桂, 郝鵬, 孔彩萍, 閆聰, 陳君彥, 劉國英, 范秀麗
【申請人】金宇保靈生物藥品有限公司
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