七種不同種屬來源細胞的pcr檢測引物和檢測方法與應用

文檔序號:10680039
七種不同種屬來源細胞的pcr檢測引物和檢測方法與應用
【專利摘要】本發明公開了對實驗室常用的七種不同種屬來源的細胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)的PCR檢測引物和檢測方法與應用。本發明的檢測引物包括7對引物,且各引物僅對各自種屬細胞的細胞色素b(Cytb)基因片段有特異性擴增,因此,用本發明的引物可以一次性對7種種屬來源的細胞進行檢測,具有較高的特異性,不僅可以對實驗室常用細胞的種屬來源(即細胞來源的可靠性)進行鑒定,還可以對培養過程中是否存在不同種屬間細胞的交叉污染進行判定,對細胞培養以及后續實驗的順利進行提供科學依據。本發明具有特異性強、靈敏度高、快速、簡便的優點。
【專利說明】
-t種不同種屬來源細胞的PCR檢測引物和檢測方法與應用
技術領域
[0001] 本發明屬于細胞檢測領域,特別是設及實驗室常用的屯種不同種屬來源細胞 (MD服、10邸、8服21、51\5?20、293、¥61?0)的?0?檢測引物和檢測方法,適用于細胞來源的鑒 定及細胞間交叉污染的檢測。
【背景技術】
[0002] 體外培養的動物細胞是目前醫學與生命科學領域應用最為廣泛、最重要的實驗工 具之一,確定細胞來源的可靠性W及培養過程中是否存在不同種屬間細胞的交叉污染,對 于實驗成功至關重要。目前,實驗室常用的檢測方法主要有染色體分析、STR分析、同工酶圖 譜分析法,運些方法成本較高、費時費力,并且可鑒定的種屬范圍較窄。針對運些情況,后續 又開發出了 PCR檢測方法。與傳統方法比較,PCR檢測方法具有快速、簡便、靈敏度高、檢測范 圍寬等特點,并且細胞使用量小,利于在實驗室中廣泛使用。
[0003] 在PCR檢測方法中,常選用線粒體DNA(mtDNA)作為目的基因。線粒體DNA是動物體 內唯一存在的核內遺傳信息載體,為共價閉合的雙鏈環狀分子,大多數脊椎動物的線粒體 DNA約為16化,包括由37個基因組成的編碼區和一段長度可變的非編碼序列(又稱控制區或 D-1 OOP),37個基因中包括2個rRNA基因(12SrRNA和16SrRNA),22個tRNA基因和13個蛋白質 基因。線粒體基因分子量小、結構簡單,并且種屬間特異性高、進化速度快、嚴格遵守母性遺 傳。

【發明內容】

[0004] 本發明目的在于對實驗室常用的屯種不同種屬來源細胞(MD服、MDCK、B皿21、ST、 SP20、293、VER0)的切tb基因設計特異性引物并建立PCR檢測方法,用W檢測細胞來源是否 可靠,W及鑒別培養過程中細胞是否存在交叉污染。
[0005] 本發明所提供的用于對屯種不同種屬來源細胞(MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、 VER0)進行PCR檢測的引物,其序列如下(見表1):
[0006] 1)用于檢測來源于牛的MDBK細胞(牛腎細胞)的引物,其上游引物如序列表中序列 1所示,其下游引物如序列表中序列2所示;
[0007] 2)用于檢測來源于狗的MDCK細胞(狗腎細胞)的引物,其上游引物如序列表中序列 3所示,其下游引物如序列表中序列4所示;
[000引3)用于檢測來源于倉鼠的B皿21細胞(倉鼠腎細胞)的引物,其上游引物如序列表 中序列5所示,其下游引物如序列表中序列6所示;
[0009] 4)用于檢測來源于豬的ST細胞(豬睪丸細胞)的引物,其上游引物如序列表中序列 7所示,其下游引物如序列表中序列8所示;
[0010] 5)用于檢測來源于鼠的SP20細胞(小鼠骨髓瘤細胞)的引物,其上游引物如序列表 中序列9所示,其下游引物如序列表中序列10所示;
[0011] 6)用于檢測來源于人的293細胞(人腎上皮細胞)的引物,其上游引物如序列表中 序列11所示,其下游引物如序列表中序列12所示;和/或
[0012] 7)用于檢測來源于非洲綠猴的VERO細胞(猴腎細胞)的引物,其上游引物如序列表 中序列13所示,其下游引物如序列表中序列14所示。
[0013] 本發明所提供的用上述引物對屯種不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、B服21、ST、 SP20、293、VERO)進行PCR檢測的方法,可包括W下步驟:
[0014] 1)提取待測細胞的基因組DNA;
[001引2似待測細胞的基因組DNA為模板,用上述7對引物分別進行PCR擴增,PCR反應體 系為(2扣L):2XDream Taq? Green PCR Master Mix^hermo公司)12.扣L,DNA模板(lOng/ 化)化L,上游引物0.化L,下游引物0 .扣L,此0 9.5化;PCR反應程序為:先95 °C預變性5min; 然后95°C變形30s,退火(退火溫度見表l)30s,72°C延伸Imin,共35個循環;最后72°C完全延 伸lOmin;
[0016] 3)PCR反應結束后,對PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,上樣量均為10化, 若出現93化p(序列表中序列15)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于牛的MD服細胞;若出 現439bp(序列表中序列16)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于狗的MDCK細胞;若出現 198bp(序列表中序列17)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于倉鼠的B皿21細胞;若出現 780bp(序列表中序列18)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于豬的ST細胞;若出現839bp (序列表中序列19)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于鼠的SP20細胞;若出現689bp(序 列表中序列20)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于人的293細胞;若出現39化p(序列表 中序列21)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于非洲綠猴的VER0細胞。
[0017]在上述檢測方法中,所述步驟2)中用于檢測牛源MDBK細胞的退火溫度為55。用 于檢測狗源MDCK的退火溫度為60°C ;用于檢測倉鼠源BHK21細胞的退火溫度為60°C ;用于檢 測豬源ST細胞的退火溫度為65°C ;用于檢測鼠源SP20細胞的退火溫度為55°C ;用于檢測人 源293細胞的退火溫度為58°C ;用于檢測非洲綠猴源VER0細胞的退火溫度為60°C。
[0018] 本發明還進一步提供鑒別細胞污染與否的方法,用前述方法對待測細胞分別進行 針對屯種不同種屬來源細胞(MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0 )DNA的PCR檢測,依據所 出現的目的條帶進行W下鑒別:
[0019] 僅出現用待測細胞檢測引物擴增所對應的目的條帶,不出現用其它細胞檢測引物 擴增的目的條帶,判定待測物細胞無污染;和
[0020] 出現用待測細胞檢測引物擴增所對應的目的條帶,同時出現用其它細胞檢測引物 擴增的目的條帶,判定待測物細胞被其它細胞污染,且出現目的條帶的對應細胞為污染細 胞?;?br>[0021] 出現用待測細胞檢測引物擴增所對應的目的條帶,同時微弱出現用其它細胞檢測 引物擴增的目的條帶,判定待測物細胞可能被其它細胞污染,且出現微弱目的條帶的對應 細胞為可疑細胞。
[0022] 本發明還提供一種用于對屯種不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、B服21、ST、SP20、 293、VERO)進行PCR檢測的試劑盒。
[0023] 本發明所提供的試劑盒包括上述用于對屯種不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、 B服21、ST、SP20、293、VERO)進行 PCR檢測的引物。
[0024] 本發明所提供的試劑盒還包括用于25化PCR反應體系的試劑,包括:2 X化earn Taq? Green PCR Master ]?1又(化6^11〇公司)12.化L,上游引物0.扣L,下游引物0.化L,此0 9.如L。
[0025] 本發明針對實驗室常用的屯種不同種屬來源的細胞(MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、 293、VER0)提供了 PCR檢測引物和檢測方法。本發明的檢測引物包括7對引物,且各引物僅對 各自種屬細胞的細胞色素 b(切tb)基因片段有特異性擴增,因此,用本發明的引物可W-次 性對巧巾種屬來源的細胞進行檢測,具有較高的特異性,不僅可W對實驗室常用細胞的種屬 來源(即細胞來源的可靠性)進行鑒定,還可W對培養過程中是否存在不同種屬間細胞的交 叉污染進行判定,對細胞培養W及后續實驗的順利進行提供科學依據。本發明具有特異性 強、靈敏度高、快速、簡便的優點,應用前景廣闊。
[0026] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0027] 圖1為巧中引物對PCR產物的電泳圖;
[002引圖2為牛源引物對(C-F和C-R)對牛源MD服細胞的特異性檢測結果;
[0029] 圖3為狗源引物對(D-F和D-R)對狗源MDCK細胞的特異性檢測結果;
[0030] 圖4為倉鼠源引物對(M-F和M-R)對倉鼠源B服21細的特異性檢測結果;
[0031] 圖5為豬源引物對(P-F和P-R)對豬源ST細胞的特異性檢測結果;
[0032] 圖6為鼠源引物對(R-F和R-R)對鼠源SP20細胞的特異性檢測結果;
[0033] 圖7為人源引物對化-F和H-R)對人源293細胞的特異性檢測結果;
[0034] 圖8為非洲綠猴源引物對(GM-F和GM-R)對非洲綠猴源VER0細胞的特異性檢測結 果;
[0035] 圖9為牛源引物對(C-F和C-R)對牛源MDBK細胞的靈敏性檢測結果;
[0036] 圖10為狗源引物對(D-F和D-R)對狗源MDCK細胞的靈敏性檢測結果;
[0037] 圖11為倉鼠源引物對(M-F和M-R)對倉鼠源B服21細胞的靈敏性檢測結果;
[0038] 圖12為豬源引物對(P-F和P-R)對豬源ST細胞的靈敏性檢測結果;
[0039] 圖13為鼠源引物對(R-F和R-R)對鼠源SP20細胞的靈敏性檢測結果;
[0040] 圖14為人源引物對化-F和H-R)對人源293細胞的靈敏性檢測結果;
[0041 ] 圖15為非洲綠猴源(GM-F和GM-R)對非洲綠猴源VER0細胞的靈敏性檢測結果;
[0042 ]圖16為倉鼠源B服21細胞樣品的檢測結果;
[0043] 圖17為豬源ST細胞樣品的檢測結果;
[0044] 圖18為牛源MD服細胞樣品的檢測結果。
【具體實施方式】
[0045] 下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法,具體步驟可參見: 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russel1,David W., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd edit ion,2001,NY,Cold Spring Harbor)。
[0046] 所述百分比濃度如無特別說明均為質量/質量(W/W,單位g/lOOg)百分比濃度、質 量/體積(W/V,單位g/lOOmU百分比濃度或體積/體積(V/V,單位mL/lOOmU百分比濃度。
[0047] 實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑W達 到具體公開的目的,不應成為對本發明生物材料來源的限制。事實上,所用到的生物材料的 來源是廣泛的,任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可W按照實施例中的提 示替換使用。
[0048] 所用引物由華大基因公司合成。
[0049] 實施例在W本發明技術方案為前提下進行實施,給出了詳細的實施方式和具體的 操作過程,實施例將有助于理解本發明,但是本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[(K)加]實施例1、設計用于對屯種不同種屬來源的細胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、 VER0)進行PCR檢測的引物
[0051 ] PCR檢測中常選用線粒體DNA(mtDNA)作為目的基因,發明人分析確認線粒體DNA中 的細胞色素 b(切tb)基因作為種屬鑒定的目的基因較為適宜。運是因為切tb基因全長約為 1100-1200bp,在物種間序列長度沒有明顯差異,但在核巧酸組成上具有偏好,并且具有種 間的差異。Cytb基因的編碼序列區進化緩慢、相對保守,在所有哺乳動物中都存在。
[0化2] 基于W上構思,發明人檢索Genbank上屯種不同種屬來源的細胞(MDBK、MDCK、 6服21、51\5?20、293、¥61?0)的細胞色素6化7計)基因的核巧酸序列,用生物信息學的方法對 細胞色素 b基因的核巧酸序列進行比對,選取各種細胞的細胞色素 b基因高度保守且具有特 異性的序列(保守區)為PCR檢測的各祀目標(發明人分析細胞色素 b基因長度較小,可W將 其全長當做保守序列設計引物),用引物設計軟件PrimerE邱ress6.0分別設計用于PCR檢測 的特異性引物。
[0053] 屯種不同種屬來源細胞(MD服、]\?)〇(、8服21、51'、5口20、293、¥61?0)細胞色素6基因保 守區核巧酸序列參見表1:
[0054] 表1引物設計參考序列
[0化5]
[0056]獲得的各引物序列如表2所不:
[0057] 表2用于對屯種不同種屬來源細胞(]\?)61(、]\?)〇(、8服21、51'、5?20、293、¥邸0)進行 PCR檢測的引物
[0化引 [0化9]
[0060] 實施例2、建立屯種不同種屬來源的細胞(MD服、MDCK、B皿21、ST、SP20、293、VER0) 的PCR檢測方法
[0061 ] 本發明用實施例1中的引物對屯種不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、B服21、ST、 SP20、293、VER0)進行PCR檢測,包括W下步驟:
[0062] 1)提取待測細胞的基因組DNA
[0063] 選取實驗室培養的MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、293和VER0 7種細胞,提取基因組 DNA,具體步驟如下:
[0064] (1)取凍存的MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、293和VER0 7種細胞各兩支,將凍存管置 于37 °C溫水中快速解凍,收集細胞于1.5mL離屯、管中,800化mp離屯、lOmin,棄上清,分別用 ImL PBS重懸細胞;
[00化](2)取重懸后的細胞20化L至新的1.5mL離屯、管中,加入ImL DNAzol裂解液振蕩混 勻,靜置10分鐘裂解;
[0066] (3)12000rpm離屯、10分鐘,取上清約800化至新的1.5mL離屯、管中,加入500化無水 乙醇,輕輕混勻靜置5分鐘,使DNA析出;
[0067] (4) 1200化pm離屯、10分鐘,棄上清,加入80化L 75%乙醇洗涂DNA沉淀,輕輕混勻后 12000巧m離屯、5分鐘;
[0068] (5)重復上一步驟;
[0069] (6)棄上清,待離屯、管中殘留液體驚干后,加入20化無酶水溶解DNA沉淀,-20°C凍 存備用。
[0070] 2) W待測細胞的基因組DNA為模板,用化no化op對各細胞的基因組DNA測定濃度, 分別稀釋至lOng/化,用上述7對引物分別進行PCR擴增,PCR反應體系為(2化L): 2 X化earn Taq? Green PCR Master Mix^hermo公司)12.5化,0臟模板(10雌/化)2化,上游引物0.5^ L,下游引物0.扣L,此0 9.5化;PCR反應程序為:先95°C預變性5min;然后95°C變形30s,退火 (退火溫度見表l)30s,72°C延伸Imin,共35個循環;最后72°C完全延伸lOmin。
[0071] 3)PCR反應結束后,對PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,上樣量均為10化, 如圖巧日表1所示,若出現93化p(序列表中序列15)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于牛 的MDBK細胞;若出現439bp(序列表中序列16)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于狗的 MDCK細胞;若出現198bp (序列表中序列17)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于倉鼠的 BHK21細胞;若出現780bp(序列表中序列18)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于豬的ST 細胞;若出現839bp(序列表中序列19)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于鼠的SP20細 胞;若出現689bp(序列表中序列20)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于人的293細胞;若 出現39化p(序列表中序列21)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于非洲綠猴的VER0細胞。
[0072] 實施例3、本發明引物及檢測方法的特異性檢測
[0073] W濃度為lOng/化的屯種不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、B皿21、ST、SP20、293、 V邸0)的基因組DNA為模板,分別用實施例1設計的屯對引物對屯種模板進行PCR擴增,檢測 各對引物的特異性。PCR反應體系和PCR反應程序與實施例2相同,PCR反應完成后對PCR產物 進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,上樣量均為10化。
[0074] 結果如圖2-圖8所示:
[0075] 圖2為牛源引物對(C-F和C-R)對巧巾細胞基因組DNA模板的特異性檢測結果,結果 顯示牛源特異性引物僅對牛源MDBK細胞的DNA模板擴增出932bp片段,對其它種屬細胞的 DNA模板無擴增條帶;說明牛源引物對(C-F和C-R)對牛源MD服細胞DNA有特異性。
[0076] 圖3為狗源引物對(D-F和D-R)對巧巾細胞基因組DNA模板的特異性檢測結果,結果 顯示狗源特異性引物僅對狗源MDCK細胞DNA模板擴增出439bp片段,對其它種屬細胞的DNA 模板無擴增條帶;說明狗源引物對(D-F和D-R)對狗源MDCK細胞DNA有特異性。
[0077] 圖4為倉鼠源引物對(M-F和M-R)對巧中細胞基因組DNA模板的特異性檢測結果,結 果顯示倉鼠源特異性引物僅對倉鼠源B皿21細胞DNA模板擴增出198bp片段,對其它種屬細 胞的DNA模板無擴增條帶;說明倉鼠源引物對(M-F和M-R)對倉鼠源BHK21細胞DNA有特異性。 [007引圖5為豬源引物對(P-F和P-R)對巧中細胞基因組DNA模板的特異性檢測結果,結果 顯示豬源特異性引物僅對豬源ST細胞的DNA模板擴增出780bp片段,對其它種屬細胞的DNA 模板無擴增條帶;說明豬源引物對(P-F和P-R)對豬源ST細胞的DNA有特異性。
[0079] 圖6為鼠源引物對(R-F和R-R)對巧中細胞基因組DNA模板的特異性檢測結果,結果 顯示鼠源特異性引物僅對鼠源SP20細胞的DNA模板擴增出839bp片段,雖然對其它種屬細胞 的DNA模板有擴增條帶,但位置與目的片段不符;說明鼠源引物對(R-F和R-R)對鼠源SP20細 胞的DNA有特異性。
[0080] 圖7為人源引物對化-F和H-R)對巧巾細胞基因組DNA模板的特異性檢測結果,結果 顯示人源特異性引物僅對人源293細胞的DNA模板擴增出689bp片段,雖然對其它種屬細胞 的DNA模板有擴增條帶,但位置與目的片段不符;說明人源引物對化-F和H-R)對人源293細 胞的DNA有特異性。
[0081 ]圖8為非洲綠猴源引物對(GM-F和GM-R)對巧巾細胞基因組DNA模板的特異性檢測結 果,結果顯示非洲綠猴源特異性引物僅對非洲綠猴源VER0細胞的DNA模板擴增出390bp片 段,雖然對其它種屬細胞的DM模板有擴增條帶,但位置與目的片段不符。說明洲綠猴源引 物對(GM-F和GM-R)對對非洲綠猴源VERO細胞的DNA有特異性。
[0082] 實施例4、本發明引物及檢測方法的靈敏性檢測
[0083] 將巧中不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、B服21、51\5口20、293、¥61?0)的基因組0麻 (lOng/化)按照10倍梯度稀釋后作為模板,濃度分別為10ngAiL、lngAiL、0.1ngAiL、0.01ng/ 化,分別用實施例1設計的7對引物對7種不同濃度的模板進行PCR擴增,檢測各對引物的靈 敏性。PCR反應體系和PCR反應程序與實施例2相同,PCR反應完成后對PCR產物進行1.5 %瓊 脂糖凝膠電泳檢測,上樣量均為lOyL。
[0084] 結果如圖9-圖15所示:
[0085] 圖9為牛源引物對(C-F和C-R)對牛源MDBK細胞的靈敏性檢測結果,結果顯示模板 濃度為0.0 lng/iiL時仍能檢測到明亮條帶;
[0086] 圖10為狗源引物對化-F和D-R)對狗源MDCK細胞的靈敏性檢測結果,結果顯示模板 濃度為0.0 lng/iiL時仍能檢測到明亮條帶;
[0087] 圖11為倉鼠源引物對(M-F和M-R)對倉鼠源B皿21細胞的靈敏性檢測結果,結果顯 示模板濃度為0.0 lng/iiL時仍能檢測到明亮條帶;
[0088] 圖12為豬源引物對(P-F和P-R)對豬源ST細胞的靈敏性檢測結果,結果顯示模板濃 度為0.0 lng/iiL時仍能檢測到明亮條帶;
[0089] 圖13為鼠源引物對(R-F和R-R)對鼠源SP20細胞的靈敏性檢測結果,結果顯示模板 濃度為0.1 ng/iiL時仍能檢測到明亮條帶;
[0090] 圖14為人源引物對化-F和H-R)對人源293細胞的靈敏性檢測結果,結果顯示模板 濃度為0.0 lng/iiL時仍能檢測到明亮條帶;
[0091] 圖15為非洲綠猴源(GM-F和GM-R)對非洲綠猴源VER0細胞的靈敏性檢測結果,結果 顯示模板濃度為0.1 ng/iiL時仍能檢測到明亮條帶。
[0092] 實施例5、用本發明的引物及檢測方法對倉鼠源BHK21細胞、豬源ST細胞、牛源MD服 細胞進行檢測
[0093] 將倉鼠源B皿21細胞、豬源ST細胞、牛源MDBK細胞的基因組DNA(lOngAiL)作為模 板,分別用實施例1設計的7對引物對S種不同的模板進行PCR檢測。PCR反應體系和PCR反應 程序與實施例2相同,PCR反應完成后對PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,上樣量均 為10化。
[0094] 結果如圖16-圖18所示,倉鼠源B皿21細胞僅在用倉鼠源引物對(M-F和M-R)進行 PCR擴增時出現198bp的目的條帶,用其它引物進行擴增時雖有擴增條帶,但不屬于目的條 帶,說明細胞無污染;
[0095] 豬源ST細胞除在用豬源引物對(P-F和P-R)進行PCR擴增時出現780bp的目的條帶 夕h在用非洲綠猴源引物對(GM-F和GM-R)和倉鼠源引物對(M-F和M-R)擴增時分別出現 390bp和198bp的條帶,判定該豬源ST細胞可能有非洲綠猴源和倉鼠源細胞的污染;
[0096] 牛源MD服細胞除在用牛源引物對(C-F和C-R)進行PCR擴增時出現932bp的目的條 帶外,在用倉鼠源引物對(M-F和M-R)進行PCR擴增時中也出現較淺的198bp的條帶,可能有 倉鼠源細胞的污染,判定為可疑。
[0097] 實施例6、制備用于對屯種不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、B皿21、ST、SP20、293、 VERO)進行PCR檢測的試劑盒
[009引本發明的試劑盒包括實施例1中用于對屯種不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、 B服21、ST、SP20、293、VERO)進行 PCR檢測的引物;
[0099] 本發明的試劑盒還包括用于25化PCR反應體系的試劑,包括:2X化earn Taq? Green PCR Master Mix(Thermo公司)12.^iL,上游引物O.^iL,下游引物O.^iL,出0 9.扣L。
[0100] 本發明試劑盒的使用方法參見實施例2。
【主權項】
1. 用于對七種不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0)進行PCR檢測 的引物,其序列如下: 1) 用于檢測來源于牛的MDBK細胞(牛腎細胞)的引物,其上游引物如序列表中序列1所 示,其下游引物如序列表中序列2所示; 2) 用于檢測來源于狗的MDCK細胞(狗腎細胞)的引物,其上游引物如序列表中序列3所 示,其下游引物如序列表中序列4所示; 3) 用于檢測來源于倉鼠的BHK21細胞(倉鼠腎細胞)的引物,其上游引物如序列表中序 列5所示,其下游引物如序列表中序列6所示; 4) 用于檢測來源于豬的ST細胞(豬睪丸細胞)的引物,其上游引物如序列表中序列7所 示,其下游引物如序列表中序列8所示; 5) 用于檢測來源于鼠的SP20細胞(小鼠骨髓瘤細胞)的引物,其上游引物如序列表中序 列9所示,其下游引物如序列表中序列10所示; 6) 用于檢測來源于人的293細胞(人腎上皮細胞)的引物,其上游引物如序列表中序列 11所示,其下游引物如序列表中序列12所示;和/或 7) 用于檢測來源于非洲綠猴的VERO細胞(猴腎細胞)的引物,其上游引物如序列表中序 列13所示,其下游引物如序列表中序列14所示。2. 對七種不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0)進行PCR檢測的方 法,包括以下步驟: 1) 提取待測細胞的基因組DNA; 2) 以待測細胞的基因組DNA為模板,用權利要求1所述的七對引物分別進行PCR擴增, PCR反應體系為(25yL):2XDream Taq? Green PCR Master Mix(Thermo公司)12.5yL,DNA 模板(1 〇ng/yL) 2yL,上游引物0.5yL,下游引物0.5yL,H20 9.5yL; PCR反應程序為:先95 °C預 變性5min;然后95°C變形30s,退火(退火溫度見表l)30s,72°C延伸lmin,共35個循環;最后 72°C完全延伸lOmin; 3 )PCR反應結束后,對PCR產物進行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測,上樣量均為10yL,若出 現932bp(序列表中序列15)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于牛的MDBK細胞;若出現 439bp(序列表中序列16)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于狗的MDCK細胞;若出現 198bp(序列表中序列17)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于倉鼠的BHK21細胞;若出現 780bp(序列表中序列18)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于豬的ST細胞;若出現839bp (序列表中序列19)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于鼠的SP20細胞;若出現689bp(序 列表中序列20)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于人的293細胞;若出現390bp(序列表 中序列21)的目的條帶,則待測細胞中含有來源于非洲綠猴的VER0細胞。3. 根據權利要求2所述的檢測方法,其特征在于:所述步驟2)中的退火溫度為: 用于檢測牛源MDBK細胞的退火溫度為55°C ; 用于檢測狗源MDCK的退火溫度為60°C ; 用于檢測倉鼠源BHK21細胞的退火溫度為60°C ; 用于檢測豬源ST細胞的退火溫度為65°C ; 用于檢測鼠源SP20細胞的退火溫度為55°C ; 用于檢測人源293細胞的退火溫度為58°C ; 用于檢測非洲綠猴源VERO細胞的退火溫度為60°C。4. 鑒別細胞污染與否的方法,用權利要求2或3所述方法對待測細胞分別進行針對七種 不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0)DNA的PCR檢測,依據所出現的目 的條帶進行以下鑒別: 僅出現用待測細胞檢測引物擴增所對應的目的條帶,不出現用其它細胞檢測引物擴增 的目的條帶,判定待測物細胞無污染;和出現用待測細胞檢測引物擴增所對應的目的條帶, 同時出現用其它細胞檢測引物擴增的目的條帶,判定待測物細胞被其它細胞污染,且出現 目的條帶的對應細胞為污染細胞。5. 根據權利要求4所述鑒別細胞污染與否的方法,還包括以下鑒別: 出現用待測細胞檢測引物擴增所對應的目的條帶,同時微弱出現用其它細胞檢測引物 擴增的目的條帶,判定待測物細胞可能被其它細胞污染,且出現微弱目的條帶的對應細胞 為可疑細胞。6. -種用于對七種不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0)進行PCR 檢測的試劑盒,包括權利要求1所述的用于對七種不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、BHK21、 ST、SP20、293、VERO)進行PCR檢測的引物。7. 根據權利要求6所述的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒還包括用于25yL PCR反應體 系的試劑,包括:2XDream Taq? Green PCR Master Mix(Thermo公司)12.5yL,上游引物 〇.5yL,下游引物0.5yL,H20 9.5yL。8. 權利要求1所述的用于對七種不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、 VERO)進行PCR檢測的引物在對細胞來源的可靠性以及培養過程中是否存在不同種屬間細 胞的交叉污染進行判定中的應用。9. 權利要求6或7所述的用于對七種不同種屬來源細胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、 293、VER0)進行PCR檢測的試劑盒在對細胞來源的可靠性以及培養過程中是否存在不同種 屬間細胞的交叉污染進行判定中的應用。
【文檔編號】C12Q1/04GK106048054SQ201610634844
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月3日 公開號201610634844.0, CN 106048054 A, CN 106048054A, CN 201610634844, CN-A-106048054, CN106048054 A, CN106048054A, CN201610634844, CN201610634844.0
【發明人】韓志玲, 郝鵬, 陳光達, 商曉桂, 閆聰, 陳君彥, 張貴剛, 范秀麗, 劉國英, 魏學峰
【申請人】金宇保靈生物藥品有限公司
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