一種熒光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的引物、探針、試劑盒及方法

文檔序號:10565522
一種熒光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的引物、探針、試劑盒及方法
【專利摘要】本發明公開了一種熒光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的引物、探針、試劑盒及方法,所述引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示,所述探針如SEQ ID NO:3所示,所述方法為以待檢測樣品的RNA為模板,反轉錄得到cDNA,再進行熒光定量PCR擴增反應,收集熒光信號,繪制曲線。本發明的檢測豬delta冠狀病毒的引物和探針具有很高的特異性和靈敏度,能夠檢測出豬delta冠狀病毒,可以對各種臨床樣品進行檢測,從而可以快捷的對臨床中豬delta冠狀病毒感染情況進行監測,操作簡單、實用。
【專利說明】
-種黃光定量PCR檢測豬de I ta冠狀病毒的引物、探針、試劑盒 及方法
技術領域
[0001 ]本發明屬于動物病毒學和分子生物學技術領域,更具體地,本發明設及一種巧光 定量PCR檢測豬de 1 ta冠狀病毒的引物、探針、試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002] 豬delta冠狀病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是近年來新發現的可引起 豬只,特別是新生仔豬腹瀉的冠狀病毒,其引發的腹瀉具有較高的發病率和死亡率,是造成 新生仔豬死亡的重要原因之一。豬deUa冠狀病毒屬于尼多病毒目,冠狀病毒科,delta冠狀 病毒屬的成員,為有囊膜的單股正鏈RNA病毒。
[0003] 該病毒與2012年由Woo等首次在香港檢出(Woo,P.C.,Lau,S.K.,Lam,C.S.,Lau, C.C.,Tsang,A.K.,Lau,J.H.,Bai,民.,Teng,J.L.,Tsang,C.C.,Wang,M.,Zheng,B.J.,Chan, K.H.,Yuen,K.Y.,2012.Discovery of sevennovel Mammalian and avian coronaviruses in the genus delt過coro打過virussupports b過t coro打過viruses 過s the gene source of 過Iphscoroosvirus 過打dbet過coro打過virus 過打d 過vi過打 coro打過viruses 過s the gene source of gammacoronavirus and deltacoronavirus .J. Virol.86,3995-4008)。而第if歹ij PDCoV腹瀉的病例則在2014年美國報道(Ma^haler,D.,Raymond,L.,Jiang,Y. ,Collins, J.,Rossow,K.,Rovira,A.,2014b.Rapiddetection,complete genome sequencing,and phylogenetic analysis of poreinedeItacoronavirus.Emerg. Infect.Dis.20,1347- 1350)。最近又報道顯示,在2004年到2012年間,中國腹瀉的仔豬中即存在豬deUa冠狀病毒 (Dong,N.,Fang,L.,Zeng,S.,Sun,Q.,Chen,H.,Xiao,S.,2015.Porcinedeltacoronavirus in mainland China.Emerg.Infect.Dis.21,2254-2255DWang,Y.W.,Yue,H.,Fang,W., Huang,Y.W.,2015b.Complete genome sequence ofporcine deltacoronavirus strain CH/Sichuan/S27/2012from mainland China.Genome Announc.3,e00945-15.)〇
[0004] PDCo V基因組與PEDV基因組結構相似,大約為25kb,包含5'和3'非翻譯區及7個開 放閱讀框,分別編碼多聚蛋白(polymerase protein) la/b、纖突(spike,S)蛋白、小膜 化nvelope,E)蛋白、膜(Membrane,M)蛋白、非結構蛋白6(nonstructural protein6,NS6)、 核衣殼(Nucleocapsid,N)蛋白及非結構蛋白 7 (nonstructural protein 7,NS7)〇 Marthaler等(Marthaler,D.,民aymond,L.,Jiang,Y.,Collins,J.,民ossow,K.,民ovira,A., 2014b.民apiddetection,complete genome sequencing,and phylogenetic analysis of porcinedeltacoronavirus .Emerg. Infect .DiS .20,1347-1350)檢測了293份糞便、腸道、飼 料^及環境樣本,發現PDCoV的檢出率為30% (89/293),且與其他病毒的共感染現象較為嚴 重,其中與輪狀病毒的共感染率高達58%(52/89)DMa等(Ma Y M,Zhang Y,Laing X Y,Lou F F,Oglesbee !,Krakowkaa S,Li J 民.Origin,evolution and virulence of porcine deltacoronaviruses in the United States.! Bio,2015,6(2):e00064-15.)將分離的 PDCoV病毒接種悉生仔豬和新生商品仔豬,接種豬只均發生水樣腹瀉、嘔吐等流行性腹瀉癥 狀,證明了該病毒可導致仔豬的腹瀉。研究人員還發現,無論是自然感染還是人工感染的情 況下,PDCo V造成的仔豬腹瀉癥狀及病理變化與PEDV及TGEV等造成的癥狀都非常相似,臨床 上很難區分。因此需要采用實驗室手段進行鑒別診斷。
[0005] 巧光定量PCRW特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快的諸多優點成為 分子生物學研究W及檢測中的重要工具。本發明擬通過分析PDCoV的相關序列從而建立一 種靈敏、特異的PDCoV巧光定量PCR檢測方法。

【發明內容】

[0006] 基于此,為了克服上述現有技術的缺陷,本發明通過對豬delta冠狀病毒N基因的 分析,設計了引物和報告基團標記的探針,并建立了巧光定量PCR方法,可W對豬delta冠狀 病毒進行快捷的檢測。
[0007] 為了實現上述發明目的,本發明采取了 W下技術方案:
[000引一種巧光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的引物,所述引物如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示。
[0009] 本發明還公開了一種巧光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的探針,所述探針如SEQ ID NO:3所示。
[0010] 在其中一些實施例中,所述探針的5'端和3'端分別標記FAM和肌Ql。
[0011] 上述引物和探針在制備巧光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的試劑盒中的應用。
[0012] -種巧光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的試劑盒,所述試劑盒包括上述的引物和 探針。
[0013] 在其中一些實施例中,所述試劑盒還包括RT預混液1、RT預混液2、Realtime PCR Master Mix及無菌蒸饋水。
[0014] 在其中一些實施例中,所述RT預混液1包括隨機引物和dNTP mix;RT預混液2包括5 倍反轉錄緩沖液、RNA酶抑制劑、反轉錄酶和不含RNA酶的雙蒸水。
[0015] -種巧光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的方法,采用上述引物和探針,包括W下 步驟:W待檢測樣品的RNA為模板,反轉錄得到CDNA,再進行巧光定量PCR擴增反應,收集巧 光信號,繪制曲線;
[0016] 其中,所述反轉錄步驟為:將RNA與RT預混液1混勻,65°C反應5min,然后迅速置于 冰上2min,再加入到RT預混液2中,混勻后進行PCR擴增反應,所述PCR擴增的反應程序為:30 °C IOmin;42°C60min; 70°C 15min;反轉錄體系中,RT預混液 1 的成分為:Ramdom 9mer和dNTP mix各化LRT預混液2的成分為:5XP;rimeSci;rpt Buffer 4]iL,Rnase Inhibitor 0.!5化, PrimeScript Reverse Transcriptase luL,Rnase free 出0 4.5化;
[0017] 所述巧光定量PCR擴增反應的反應體系為:
[001 引
[0019] 所述巧光定量PCR擴增反應
的反應程序為:95°C 20s ;然后95°C 5s,55 °C4s,72°C 30s,共進行40次循環;72 °C時收集巧光。
[0020] 與現有技術相比,本發明具有W下顯著效果:
[0021] 本發明的巧光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的引物和探針具有很高的特異性和 靈敏度,能夠檢測出豬delta冠狀病毒,可W對各種臨床樣品進行檢測,從而可W快捷的對 臨床中豬delta冠狀病毒感染情況進行監測,操作簡單、實用。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發明實施例1中對樣品擴增的曲線圖;
[0023] 圖2為本發明試驗例1的特異性檢驗結果,其中曲線1為PDCoV陽性,曲線2-7分別為 豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒、豬圓環病毒、豬攝病毒、 豬偽狂犬病毒;
[0024] 圖3為本發明試驗例2的靈敏度檢驗結果,其中,曲線1、2、3、4、5、6、7、8代表的拷貝 數分別為 l.〇lXl〇9、l.〇lXl〇8、l.〇lXl〇7、1.01Xl〇6、l.〇lXl〇5、1.01Xl〇4、l.〇lXl〇3、 1.01Xl〇2。
【具體實施方式】
[0025] W下結合附圖和具體實施例來詳細說明本發明。
[0026] W下實施例中設及的實驗材料如無特殊說明,均來源于市售,W下實施例中所采 用的操作均為本領域技術人員所熟知的常規操作。
[0027] 實施例1 一種巧光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的引物、探針和方法 [002引 1、引物設計
[00巧]根據NCBI登陸的豬delta冠狀病毒基因組序列,登錄號:KJ601780、KJ601778、 KU051649、KU051641、KR131621、KJ601777提供的信息,經過比對分析,設計了巧光定量PCR 的引物和探針,分別為F、R、P:
[0030] 上游引物F:GAGCTGACACTTCTATTAAA(SEQ ID N0:1);
[0031] 下游引物R:TGGAGTTAACAGATTGAGA(沈Q ID N0:2);
[0032] 探針P:TTCCACGCTCCTGAGGTCTTC(沈Q ID N0:3)
[0033] 其中,P的5'端和3'端分別標記FAM和肌Ql。
[0034] 使用上述引物和探針進行巧光定量PCR擴增,可W通過擴增曲線檢測豬delta冠狀 病毒,省去測序的步驟,節省了時間和成本。
[00巧]2、檢測方法
[0036] 包括W下步驟:
[0037] (1 )、待檢樣品RNA提取
[0038] 200化細胞培養液(感染自主分離毒株JS,該毒株經鑒定為delta冠狀病毒KlOOmg 的腸道病料和IOOmg糞便(病料和糞便未知是否感染病毒)W及DMEM(細胞培養基,不含 陽DV)作為待檢樣品,分別進行W下操作:
[00例加入ImL PBS緩沖液進行充分研磨,-20°C反復凍融3次,SOOOrpm離屯、IOmin,取上 清液20化L,加入0.2mL氯仿,震蕩混勻15s后在室溫下(15°C~30°C)放置2~3min后,12000g (2 °C~8 °C )離屯、15min;取上層水相置于新EP管中,加入0.5mL異丙醇,在室溫下(15 °C~30 °C )放置IOmin,12000g(2°C~8°C)離屯、IOmin;棄上清,加入ImL 75 %乙醇進行洗涂,滿旋混 合,7500g( 2 °C~8 °C)離屯、Smin,棄上清;讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥后加入20化 化as e-Free出0溶解,即為RNA模板。提取的RNA放于-80°C保存。
[0040] (2)提取的RNA加入到反轉錄預混反應液中進行反轉錄,得到CDNA模板
[0041 ] 反轉錄體系及過程:祉L的RNA與化L RT預混液1混勻,65°C反應5min,然后迅速置 于冰上2min。此反應混合溶液再加入到RT預混液2中,混勻后置于PCR儀上,按如下條件反 應:30°(:10111111;421:60111111;70°(:15111111(無循環)。其中,1?1'預混液1:1?日111(1〇11191116^50礎)和 dNTP mix(lOmM)各化LRT預混液2:5 XPrimeScbpt Buffer 化L Jnase Inh;Lbito;r(40U/ii L)0.5化,PrimeScript Reverse Transcriptase(200U/jiL)IuURnase free 此O 4.5化,均 購自大連TaKaRa公司。
[0042] (3)巧光定量PCR
[0043] 將化L CDNA模板加入到定量PCR預混液中,配制20化反應體系,并混合均勻,將PCR 管置于ABI公司750(Fas t定量PCR儀上進行擴增反應。其中定量PCR預混液:raUNDERBIRD Probe qPCR Mix 10化、50XR0X reference dye 0.04化,購自TOYOBO公司;F和R(均為 2化mol)各0.化L,P(20pmol )0.3化,由上?;瞪锛夹g有限公司合成;無菌雙蒸水6.96y U自制。
[0044] 擴增條件為:
[0045]
[0046] (4)結果判定
[0047] 有擴增曲線出現的即是delta冠狀病毒陽性,若無擴增曲線產生,則說明樣品中不 含delta冠狀病毒。其中擴增曲線CT值小于35的判為陽性,CT值大于35而小于40的判為可 疑,需重復試驗。第二次CT值仍在運個范圍的判為陽性。
[0048] 本實施例的樣品的檢測結果見圖1和表1。
[0049] 表1待檢樣品檢測結果 「00 加 1 '[0051]試驗例1特異性檢驗 '
' '
[0052] W存在分離毒株JS的病毒液作為陽性對照,同時取豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀 病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒、豬圓環病毒、豬攝病毒、豬偽狂犬病毒的培養液進行 特異性檢測,使用實施例1的方法與引物和探針,結果除含有JS毒株的病毒液陽性對照外均 沒有擴增曲線(見圖2)。
[0053] 試驗例2靈敏度檢驗
[0054] 將實施例1的存在分離毒株JS的病毒液的巧光定量PCR擴增出的產物(186bp,SEQ ID NO. 4)連接到克隆載體pMD 18-T(大連寶生物工程有限公司)制備含有N基因的標準陽性 質粒(pMD-N),經測定其濃度分別為1.01 X l〇iicopiesAiL。
[0055] 將陽性質粒pMD-N用配置的滅菌雙蒸水10倍遞增稀釋作為模板,每個稀釋度各取2 yL作為模板,按實施例1方法進行檢測,觀察擴增曲線,W出現陽性預期曲線所用模板量的 最高稀釋度計算其敏感性,結果表明最小檢出量為1.01 X 102。
[0056] W上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式,其描述較為具體和詳細,但并 不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是,對于本領域的普通技術人員 來說,在不脫離本發明構思的前提下,還可W做出若干變形和改進,運些都屬于本發明的保 護范圍。因此,本發明專利的保護范圍應W所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種熒光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的引物,其特征在于,所述引物如SEQ ID N0:GPSEQIDN0:2K*。2. -種熒光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的探針,其特征在于,所述探針如SEQ ID NO: 3所示。3. 根據權利要求2所述的熒光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的探針,其特征在于,所述 探針的5 '端和3 '端分別標記有FAM和BHQ1。4. 權利要求1所述的熒光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的引物、或權利要求2或3所述 的檢測豬delta冠狀病毒的探針在制備檢測豬delta冠狀病毒的試劑盒中的應用。5. -種熒光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包括權 利要求1所述的檢測豬delta冠狀病毒的引物、以及權利要求2或3所述的檢測豬delta冠狀 病毒的探針。6. 根據權利要求5所述的熒光定量PCR檢測豬del ta冠狀病毒的試劑盒,其特征在于,所 述試劑盒還包括RT預混液1、RT預混液2、Realtime PCR Master Mix及無菌蒸餾水。7. 根據權利要求6所述的熒光定量PCR檢測豬del ta冠狀病毒的試劑盒,其特征在于,所 述RT預混液1包括隨機引物和dNTP mix;RT預混液2包括反轉錄緩沖液、RNA酶抑制劑、反轉 錄酶和不含RNA酶的雙蒸水。8. -種熒光定量PCR檢測豬delta冠狀病毒的方法,其特征在于,采用權利要求1所述的 檢測豬delta冠狀病毒的引物、以及權利要求2或3所述的檢測豬delta冠狀病毒的探針,包 括以下步驟:以待檢測樣品的RNA為模板,反轉錄得到cDNA,再進行熒光定量PCR擴增反應, 收集熒光信號,繪制曲線; 其中,所述反轉錄步驟為:將RNA與RT預混液1混勻,65 °C反應5min,然后迅速置于冰上 2min,再加入到RT預混液2中,混勻后進行PCR擴增反應,所述PCR擴增的反應程序為:30°C lOmin; 42°C60min; 70°C 15min;反轉錄體系中,RT預混液 1 的成分為:Ramdom 9mer和dNTP mix各lyL;RT預混液2的成分為:5XPrimeScirpt Buffer 4yL,Rnase Inhibitor 0.5yL, PrimeScript Reverse Transcriptase lyL,Rnase free H2O 4.5yL; 所述熒光定量PCR擴增反應的反應體系為: THUNDERBIRD Probe qPCR Mix 10pL 5〇xRDX reference dye 0:04 μ.Ε SEQ ID NO; 1 0.3μL SEQ IDNO:2 0 3pL SEQ ID NO:3 0 3pL cDNA 2pL Rnase Free H20 加至 20|iL; 所述熒光定量PCR擴增反應的反應程序為:95°C20s;然后95°C5s,55°C4s,72°C3〇S,共 進行40次循環;72°C時收集熒光。
【文檔編號】C12Q1/68GK105925729SQ201610509065
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月29日
【發明人】王東東, 田小艷, 潘永飛, 李春梅, 宋延華
【申請人】廣東溫氏食品集團股份有限公司
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