靶向整合的制作方法

文檔序號:9793514
靶向整合的制作方法
【專利說明】祀向整合
[0001 ] 領域 本公開設及編碼重組蛋白的序列至感興趣的細胞中的祀向整合。具體而言,感興趣的 細胞包含位于預定的基因組位置之內或鄰近預定的基因組位置的外源核酸序列,其中所述 外源核酸序列包含至少一個識別序列,所述識別序列可被一種或更多種多核巧酸修飾酶利 用,用于編碼重組蛋白的序列的祀向整合。
[0002] 背景 近年^在哺乳動物細胞的基因組之內的限定位置的重組蛋白表達構建物的祀向整合 (TI)已在生物制藥行業中激發了很多興趣。TI技術允許細胞系開發科學家將感興趣的轉基 因整合到預先限定的、表征良好的基因組位置中,由此使得重組蛋白表達特征的預測成為 可能,其可引起增加的細胞系穩定性、降低的克隆至克隆和分子至分子異質性,并大體降低 的細胞系開發時間軸。中國倉鼠卵巢(CH0)細胞是用于生物治療蛋白生產的最常用的細胞 系。但是,盡管它們在治療性蛋白生產中的公認的有用性,但是迄今為止,010細胞中的TI獲 得有限的成功。因此,需要在CH0和其它細胞中實施TI的改善的方法,所述方法將有益于生 物生產行業。
[0003] 概述 在本公開的各種方面中,提供了分離的細胞,其包含位于基因組DNA中的至少一個外源 核酸序列,所述基因組DNA在表2中列舉的至少一個基因組位置之內或鄰近表2中列舉的至 少一個基因組位置,其中各外源核酸序列包含用于多核巧酸修飾酶的至少一個識別序列。 在一個實施方式中,所述細胞是C冊細胞。在另一實施方式中,所述至少一個識別序列包含 不內源存在于所述細胞(或C冊細胞)的基因組中的核酸序列。在又一實施方式中,所述多核 巧酸修飾酶是祀向核酸內切酶(如鋒指核酸酶(ZFN)、大范圍核酸酶、類轉錄激活因子效應 物核酸酶(TALENKCRIPSR核酸內切酶、I-TevI核酸酶或相關的單體雜合物,或人工祀向DNA 雙鏈斷裂誘導劑)、位點特異性重組酶(如λ整合酶、化e重組酶、FLP重組酶、丫-δ解離酶、Τη3 解離酶、OC31整合酶、Bxbl-整合酶或R4整合酶),或它們的組合。在又一實施方式中,第一 識別序列由第一ZFN對識別。在還一實施方式中,第一識別序列由第一ZFN對識別,且第二識 別序列由不同于第一ZFN對的第二ZFN對識別。在一次重復中,第一和第二ZFN對選自hSIRT、 hRSK4和hAAVSl。在還一實施方式中,外源核酸序列還包含至少一個選擇性標記序列、至少 一個報道序列、至少一個調節控制序列元件或它們的組合。
[0004] 本公開的另一方面包括用于制備包含至少一個外源核酸序列的細胞的方法,所述 外源核酸序列包含至少一個用于多核巧酸修飾酶的識別序列。所述方法包括(a)將至少一 種祀向核酸內切酶引入細胞中,所述祀向核酸內切酶被祀向至在表2中列舉的基因組位置 之內或鄰近在表2中列舉的基因組位置的序列;(b)將至少一種包含所述外源核酸的供體多 核巧酸引入細胞中,所述外源核酸側接(i)與祀向基因組位置具有實質的序列同一性的序 列或(ii)祀向核酸內切酶的識別序列;和(C)在使得外源核酸被整合到細胞的基因組中的 條件下維持所述細胞。在一個實施方式中,所述細胞是CK)細胞。在另一實施方式中,通過同 源介導法將外源核酸整合到基因組中。在又一實施方式中,通過直接連接法將外源核酸整 合到基因組中。在還一實施方式中,祀向核酸內切酶選自鋒指核酸酶(ZFN)、大范圍核酸酶、 類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALENKCRIPSR核酸內切酶、I-TevI核酸酶或相關的單體雜 合物,和人工祀向DNA雙鏈斷裂誘導劑。
[000引本公開的又一方面提供了用于再祀向細胞供至少一種重組蛋白生產用的方法。所 述方法包括(a)提供包含至少一個用于多核巧酸修飾酶的外源識別序列的細胞,所述外源 識別序列位于至少一個在表2中列舉的基因組位置之內或鄰近至少一個在表2中列舉的基 因組位置;(b)將(i)包含側接第一和第二序列的編碼重組蛋白的序列的至少一個表達構建 物,和(ii)識別細胞中的所述至少一個外源識別序列的至少一種多核巧酸修飾酶引入細胞 中;和(C)在使得編碼重組蛋白的序列被整合到細胞的基因組中的條件下維持所述細胞。在 一個實施方式中,所述細胞是C冊細胞。在另一實施方式中,所述細胞的至少一個外源識別 序列是祀向核酸內切酶識別位點;表達構建物的第一和第二序列是與靠近細胞中的外源識 別序列的染色體序列具有實質的序列同一性的序列;及所述至少一種多核巧酸修飾酶是祀 向核酸內切酶。在還一實施方式中,所述細胞的至少一個外源識別序列是祀向核酸內切酶 識別位點;表達構建物的第一和第二序列各自是祀向核酸內切酶的識別序列;及所述至少 一種多核巧酸修飾酶是祀向核酸內切酶。在一些實施方式中,祀向核酸內切酶是鋒指核酸 酶(ZFN)、大范圍核酸酶、類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)、CRIPSR核酸內切酶、I- TevI核酸酶或相關的單體雜合物、或人工祀向DNA雙鏈斷裂誘導劑。在又一實施方式中,所 述細胞的至少一個外源識別序列是位點特異性重組酶識別位點;表達構建物的第一和第二 序列各自是位點特異性重組酶識別序列;及所述至少一種多核巧酸修飾酶是位點特異性重 組酶,其中所述位點特異性重組酶選自λ整合酶、化e重組酶、FLP重組酶、丫 -δ解離酶、Τη3解 離酶、OC31整合酶、Bxbl-整合酶和R4整合酶。在另外的實施方式中,將編碼重組蛋白的序 列與至少一個表達控制序列可操作地連接。在替代的實施方式中,表達構建物還包含至少 一個選擇性標記序列、至少一個報道序列、至少一個調節控制序列元件或它們的組合。在另 一實施例中,在用于至少一種重組蛋白的表達的條件下維持所述細胞。
[0006] 本公開的還一個方面包括用于再祀向細胞供重組蛋白生產用的試劑盒。所述試劑 盒包含細胞,所述細胞包含位于基因組DNA中的至少一個外源核酸序列,所述基因組DNA在 表2中列舉的至少一個基因組位置之內或鄰近在表2中列舉的至少一個基因組位置,其中各 外源核酸序列包含至少一個用于多核巧酸修飾酶的識別序列,W及對應于識別序列的多核 巧酸修飾酶和用于編碼感興趣的重組蛋白的序列插入的構建物,其中所述構建物還包含一 對側翼序列,所述側翼序列對應于識別序列和/或側接識別序列的基因組DNA。在一個實施 方式中,所述細胞是CH0細胞。在另一實施方式中,所述試劑盒還包含用于完成編碼重組蛋 白的序列的祀向整合的說明書。在一些實施方式中,多核巧酸修飾酶是祀向核酸內切酶,其 選自鋒指核酸酶(ZFN)、大范圍核酸酶、類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)、CRIPSR核酸 內切酶、I-TevI核酸酶或相關的單體雜合物,和人工祀向DNA雙鏈斷裂誘導劑。在其它的實 施方式中,多核巧酸修飾酶是位點特異性重組酶,其選自λ整合酶、Cre重組酶、FLP重組酶、 丫 -S解離酶、Τη3解離酶、OC31整合酶、Bxbl-整合酶和R4整合酶。
[0007] 本公開其它的方面和重復如下詳述。
[000引 附圖簡述 圖1是用于將人AAVS1ZFN識別序列整合到CH0基因組位置參考序列ID NW_ 003618207.1,堿基對5366-20679中的供體質粒的示意圖。
[0009] 圖2是含有整合的AAVS著陸區(landing pad)的參考序列ID NW_003618207.1,堿 基對5366-20679示意圖。表明了用于接頭PCR的引物結合位點。
[0010] 圖3是兩種不同的一般供體設計的示意圖,可通過ZFN介導的祀向整合使用所述設 計將重組蛋白表達構建物引入基因組中。(A)欲整合的所需序列,包含,例如,重組蛋白表達 構建物(一種或更多種),(本文稱作"有效負載"序列),所述欲整合的所需序列側接與圍繞 ZFN識別序列的基因組DNA序列同源的序列。該設計將允許經由經典的同源重組的祀向整 合。(B)所述有效負載側接與在宿主細胞基因組中被祀向的那種相同的ZFN識別序列。因此, 一旦使用ZFN對進行轉染,ZFN將切割內源基因組DNA W及供體DNA二者,留下黏性末端 (sticky cohesive ends),所述黏性末端將允許有效負載經由DNA修復機制的祀向整合。在 兩種設計中,有效負載可包括用于感興趣的重組蛋白的表達盒W及用于選擇性標記的表達 盒。有效負載中的其它元件可包括報道分子、啟動子或任何其它的外源序列。
[0011] 詳述 編碼蛋白,特別是生物治療蛋白產物的序列的祀向整合對于所需基因材料的滲入 效率,W及對于整合之后的蛋白表達的改善的穩定性、均一性和水平而言,均強烈地優于隨 機整合。核酸內切酶技術,例如鋒指核酸酶(ZFN)技術W及本文討論的其它技術,目前允許 內源基因組序列的位點特異性的修飾的引入,運比使用祀向整合的某些現有方法具有對于 定制的更高的效率和更大的機會。本公開提供了用于編碼重組蛋白的序列的祀向整合的細 胞,其中由于"著陸區"位點在它們的基因組中的滲入,細胞是特別合適的??扇绫疚乃鰧?中國倉鼠卵巢(C冊)細胞或其它哺乳動物細胞進行修飾,W接受此類著陸區,即修飾W包括 合成核巧酸序列,所述合成核巧酸序列包含一個或更多個用于多核巧酸修飾酶,例如位點 特異性重組酶和/或祀向核酸內切酶的識別序列??稍谟糜谥亟M蛋白(一種或更多種)的表 達的合適的位置插入所述著陸區。著陸區(包含一個或更多個用于多核巧酸修飾酶的識別 序列的序列)在基因組內的特定位置整合之后,可使用對應的重組酶和/或祀向核酸內切酶 在含有一個或更多個識別序列的位置插入編碼一種或更多種蛋白的序列,且此類插入W高 于隨機整合或其它前述方法的效率水平發生。將理解多重著陸區可位于基因組中的不同位 置,運允許重組蛋白表達構建物或盒W及多個獨特蛋白表達盒的多拷貝整合。
[0012] I.包含至少一個識別序列的外源序列 一方面,本公開包括外源核酸序列(即著陸區),其包含用于至少一種多核巧酸修飾酶 的至少一個識別序列,所述多核巧酸修飾酶例如位點特異性重組酶和/或祀向核酸內切酶。 位點特異性重組酶在本領域中是眾所周知的,且一般可將其稱作轉化酶、解離酶或整合酶。 位點特異性重組酶的非限制性實例可包括λ整合酶、Cre重組酶、FLP重組酶、丫 -δ解離酶、 Τη3解離酶、ΦC31整合酶、Bxbl-整合酶和R4整合酶。位點特異性重組酶識別特異性識別序 列(或識別位點)或其變體,上述所有在本領域中都是眾所周知的。例如,Cre重組酶識別 LoxP位點,及FLP重組酶識別FRT位點。
[0013] 考慮的祀向核酸內切酶包括鋒指核酸酶(ZFN)、大范圍核酸酶、類轉錄激活因子效 應物核酸酶(TALEN)、CRIPSR/化S樣核酸內切酶、I-TeW核酸酶或相關的單體雜合物,或人 工祀向DNA雙鏈斷裂誘導劑。下文進一步描述運些祀向核酸內切酶的每一個。例如,典型地, 鋒指核酸酶包含DNA結合結構域(即鋒指)和剪切結構域(即核酸酶),上述二者在下文進行 描述。多核巧酸修飾酶的定義中還包括本領域技術人員已知的任何其它有用的融合蛋白, 例如可包含DNA結合結構域和核酸酶。
[0014] 著陸區序列是包含至少一個識別序列的核巧酸序列,所述識別序列由特異性多核 巧酸修飾酶,例如位點特異性重組酶和/或祀向核酸內切酶選擇性結合并修飾。一般而言, 著陸區序列中的識別序列(一個或更多個)不內源存在于欲修飾的細胞的基因組中。例如, 在欲修飾的細胞是CH0細胞的情況下,著陸區序列中的識別序列不存在于內源CH0基因組 中??赏ㄟ^選擇不內源存在于祀向細胞的基因組內的用于高效率核巧酸修飾酶的識別序列 來改善祀向整合的速率。不內源存在的識別序列的選擇還減少了可能的脫祀(off-target) 整合。在其它方面,天然存在于欲修飾的細胞中的識別序列的使用可能是合意的。例如,在 著陸區序列中采用多個識別序列的情況下,一個或更多個可為外源的,而一個或更多個可 為天然的。
[0015] 本領域普通技術人員可容易地確定由位點特異性重組酶和/或祀向核酸內切酶結 合并切割的序列。在下表1中提供巧巾示例性ZFN識別序列。
[0016] 表1.ZFN識別序列
曰'
[0017] 多個識別序列可存在于單一著陸區中,允許通過兩種或更多種多核巧酸修飾酶相 繼地祀向著陸區,W使得可插入兩個或更多個獨特有效負載序列(除其它W外,包含蛋白表 達盒)?;蛘?,多個識別序列在著陸區中的存在允許相同的有效負載序列的多拷貝被插入到 著陸區中。當兩個有效負載序列被祀向到單一著陸區時,著陸區包括用于第一多核巧酸修 飾酶的第一識別序列(例如第一 ZFN對),和用于第二多核巧酸酶的第二識別序列(例如第二 ZFN對)?;蛘?,或另外,可在細胞的基因組之內的多個位置整合包含一個或更多個識別序列 的單個著陸區,W允許包含重組蛋白表達構建物的有效負載序列的多拷貝整合??稍谑褂?包含表達構建物的有效負載序列的多拷貝進行轉化的細胞中觀察增加的蛋白表達?;蛘?, 當插入包含不同的表達盒的多個獨特有效負載序列時,無論是在相同還是不同的著陸區 中,均可同時表達多種蛋白產物。不管有效負載序列的數量和類型,當祀向核酸內切酶是 ZFN時,示例性ZFN對包括hSIRT、hRSK4和hAAVSl,補充的識別序列如上表1中鑒定。
[0018] -般而言,用作著陸區的外源核酸可包含至少一個識別序列。例如,外源核酸可包 含至少一個、至少兩個、至少Ξ個、至少四個、至少五個、至少六個、至少屯個、至少八個、至 少九個或至少十個或更多個識別序列。在包含多于一個識別序列的實施方式中,識別序列 可彼此之間獨特(即由不同的多核巧酸修飾酶識別),可為相同的重復序列,或可為重復序 列和獨特序列的組合。
[0019] 本領域普通技術人員將容易地理解,除了識別序列(一個或更多個)之外,用作著 陸區的外源核酸也可包括其它序列。例如,包括一個或更多個編碼選擇性標記的序列可能 是有利的,所述選擇性標記例如抗生素抗性基因、代謝選擇標記或巧光蛋白。也可存在其它 補充序列,例如轉錄調節和控制元件(即啟動子、部分啟動子、啟動子包載、起始密碼子、增 強子、內含子、絕緣子和其它表達元件)的使用。
[0020] 除了適當的識別序列(一個或更多個)的選擇之外,具有高切割效率的祀向核酸內 切酶的選擇也改善著陸區(一個或更多個)的祀向整合的速率??墒褂帽绢I域眾所周知的方 法測定祀向核酸內切酶的切割效率,包括,例如,使用例如CEkl測定或在PCR擴增子中的插 入/缺失(插入/缺失(Indel))的直接測序的測定。
[0021] 可改變并將改變用在本文所公開的方法和細胞中的祀向核酸內切酶的類型。祀向 核酸內切酶可為天然存在的蛋白或人工改造的蛋白。祀向核酸內切酶的一個實例是鋒指核 酸酶,其在下文被進一步詳細討論。
[0022] 可使用的祀向核酸內切酶的另一實例是包含至少一種核定位信號的RNA指導的核 酸內切酶,其允許核酸內切酶進入真核細胞的核中。RNA指導的核酸內切酶還包含至少一個 核酸酶結構域和至少一個與指導RNA相互作用的結構域。通過指導RNA將RNA指導的核酸內 切酶導向至特異性染色體序列,W使得RNA指導的核酸內切酶剪切該特異性染色體序列。因 為指導RNA為祀向剪切提供特異性,所WRNA指導的核酸內切酶的核酸內切酶是通用的,并 可與不同的指導RNA-起使用,W剪切不同的祀染色體序列。下文進一步詳細討論的是示例 性RNA指導的核酸內切酶蛋白。例如,RNA指導的核酸內切酶可為CRISPR/化S蛋白或CRISPR/ Cas樣融合蛋白、源自成簇的規律間隔的短回文重復序列(CRISPRVCRISPR相關(Cas)系統 的RNA指導的核酸內切酶。
[0023] 祀向核酸內切酶也可為大范圍核酸酶。大范圍核酸酶是由大識別位點,即一般在 約12對堿基對至約40對堿基對范圍內的識別位點表征的限制性核酸內切酶。由于該要求, 該識別位點在任何給定的基因組中一般僅出現一次。在大范圍核酸酶中,名為LAGLIDADG的 歸巢核酸內切酶家族已成為用于基因組和基因組工程的研究的有價值的工具??赏ㄟ^使用 本領域技術人員眾所周知的技術來修飾它們的識別序列而使大范圍核酸酶祀向特異性染 色體序列。參見,例如,Epinat 等人,2003,Nuc. Acid Res. ,31(11) :2952-62 和 Stoddard, 2005,如arterly Review of Bio地ysics,第1-47頁。
[0024] 可使用的祀向核酸內切酶的另一實例是類轉錄激活因子效應物(TALE)核酸酶。 TAL
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