蜻蜓腸道菌土曲霉qt122及其代謝產物和應用

文檔序號:8917545
蜻蜓腸道菌土曲霉qt122及其代謝產物和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物技術農業生產領域,涉及蜻蜓腸道共生土曲霉(Aspergillus terreus QT122)菌株及其代謝產物和應用。
【背景技術】
[0002] 昆蟲是地球生物圈中已知種類最多的一群生物,與昆蟲共生的特境微生物具有豐 富的多樣性。據已有的研宄報道我們可以知道昆蟲共生菌不僅種類繁多,而且在生態、代謝 特征、生理活性等方面均有一定的特殊性,因此其可能是抗菌、除草劑等新型藥源分子的廣 泛來源。但與昆蟲種類相比,目前人們對昆蟲共生菌研宄較少,對其代謝產物研宄更少,因 此,研宄昆蟲共生菌及其次生代謝產物對開拓發現新型活性物質具有重要意義。
[0003] 稗草(Echinochloa crusgalli)是世界性十大惡性雜草之一,是稻田、麥田地等最 重要的草害。近年來已經上升為水稻產區第一惡性雜草,嚴重影響水稻產量及品質。反枝 莧(Amaranthus retroflexus)是入侵種中發生頻率最多、分布最廣、危害最嚴重的雜草, 是菜園、果園及棉花和玉米等旱作物地中的常見雜草,并且該植物可富集硝酸鹽,家畜過量 食用后會引起中毒,造成大量經濟損失。目前治理稗草和反枝莧危害的主要措施是化學防 治。隨著化學除草劑的廣泛應用,其弊端日趨突出,化學除草劑造成環境污染,農藥殘留以 及雜草抗藥性的問題已經引起農藥科技工作者的高度關注,開發研制高效安全、無污染的 新型除草劑迫在眉睫。微生物源除草劑以其資源豐富、毒性小、不破壞生態環境、殘留少、選 擇性強、對非靶標生物和哺乳動物安全、環境兼容性好等優點,正逐步引起人們的重視,是 新型除草劑的重要研宄方向。已有研宄表明昆蟲腸道菌可能合成植物毒素,這類毒素能殺 死植物以利于昆蟲消化攝入的植物,如Zhang等分離篩選出具有除草活性的棉蝗腸道真菌 HC02(Phoma sp.)和負幢腸道真菌FHOl (Curvularia sp.),并從其代謝產物中分離到同樣 具有較好除草活性的單體化合物。因此,昆蟲腸道共生菌可能是新型除草劑的重要來源。

【發明內容】

[0004] 本發明要解決的技術問題是提供一種蜻蜓腸道共生土曲霉(Aspergillus terreus QT122)菌株及其及其代謝產物和用途。
[0005] 為了解決上述技術問題,本發明提供土曲霉QT122,為Aspergillus terreus QT122,其保藏編號為:CCTCC M 2015240。
[0006] 土曲霉QT122,保藏單位:中國典型培養物保藏中心(CCTCC);保藏名稱為: Aspergillus terreus QT122 ;保藏地址:中國武漢武漢大學;保藏日期:2015年4月17日; 保藏號:CCTCC NO :M 2015240。
[0007] 本發明還同時提供了土曲霉QT122發酵液的制備方法,包括以下步驟:
[0008] 1)、活化好的土曲霉(Aspergillus terreus QT122)接入麥芽液體培養基中,于 27. 5~28. 5°C (較佳為28°C )、160~180rpm/min (較佳為170rpm/min)的條件下培養2~ 3d (較佳為3d)作為種子液;
[0009] 備注說明:活化為經麥芽固體培養基的活化;即,具體為:從保藏菌種的MEA試管 斜面中取帶菌的菌絲體塊(約1~2g)于新鮮的麥芽固體培養基(MEA)上,然后于28°C恒 溫箱中倒置培養,得到活化好的土曲霉(Aspergillus terreus QT122)。
[0010] -般而言,將活化好的土曲霉(Aspergillus terreus QT122)的菌絲體塊(約2~ 3g)接種到裝有150mL麥芽液體培養基(ME培養基)中于上述條件下進行培養;就能得到 種子液;
[0011] 2)、將種子液按照1%~2%體積比的接種量接入麥芽液體培養基中,于27. 5~ 28. 5°C (較佳為28°C )、160~180rpm/min (較佳為170rpm/min)的條件下培養6~8d (較 佳為7d),得土曲霉QT122發酵液。
[0012] 本發明還同時提供了利用上述土曲霉QT122發酵液制備土曲霉QT122代謝產物的 方法,包括以下步驟:
[0013] 1)、將土曲霉QT122發酵液利用紗布(例如為4層紗布)進行過濾,得濾液(為對 反枝莧和稗草的幼根生長具有抑制作用的發酵濾液);
[0014] 將濾液經乙酸乙酯萃取后,真空減壓濃縮干燥(于0. 1個負壓的真空度,45°C干燥 30~40分鐘),得土曲霉QT122發酵液粗提物(為褐色);
[0015] 2)、將土曲霉QT122發酵液粗提物用硅膠柱層析進行粗分,采用二氯甲烷/甲醇進 行梯度洗脫,所述二氯甲烷與甲醇的體積比依次為:1〇〇:〇, 100:1,100:2, 100:4, 100:8, 100 :16, 100:32 ;進而相應得到7個餾分:F1~F7 ;
[0016] 3)、將Fl和F2分別進行如下操作:濃縮后用甲醇重結晶;總共得到4個土曲霉 QT122代謝產物。
[0017] 備注說明:Fl對應得到的是化合物1和化合物2, F2對應得到的是化合物3和化 合物4。
[0018] 本發明還同時提供了利用上述方法制備而得的4種土曲霉QT122代謝產物,分別 具有如下結構式:
[0019]
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[0020] 本發明還同時提供了上述土曲霉QT122的用途:用于抑制反枝莧或稗草幼根的生 長。
[0021] 作為本發明的土曲霉QT122的用途的改進:土曲霉QT122發酵液、土曲霉QT122發 酵液粗提物、土曲霉QT122代謝產物均能用于抑制反枝莧或稗草幼根的生長。
[0022] 本發明還同時提供了一類對反枝莧和稗草的幼根生長具有抑制活性的生物農藥, 該生物農藥中含有以下任意一種:土曲霉QT122發酵液、土曲霉QT122發酵液粗提物、土曲 霉QT122代謝產物。
[0023] 麥芽固體培養基(MEA培養基)為:生麥芽20g,蔗糖20g,蛋白胨lg,瓊脂20g,蒸 餾水1L。
[0024] 麥芽液體培養基(ME培養基)為:生麥芽20g,蔗糖20g,蛋白胨lg,蒸餾水1L。
[0025] 在本發明中,土曲霉QT122代謝產物的用法和用量可參照2, 4-D的用法和用量。
[0026] 即,本發明的第一個目的是提供一種蜻蜓腸道共生土曲霉(Aspergi I Ius terreus QT122)菌株及其用途;本發明的第二個目的是提供上述的蜻蜓腸道共生土曲霉 (Aspergillus terreus QT122)菌株的培養物;本發明的第三個目的是提供上述培養物的 制備方法;本發明的第四個目的是提供上述培養物的用途;本發明的第五個目的是提供具 有抑制反枝莧、稗草等雜草的幼根生長作用的微生物源農藥。
[0027] 綜上所述,本發明的蜻蜓腸道共生土曲霉(Aspergillus terreus QT122)菌株,該 菌發酵液及其代謝產物具有抑制反枝莧和稗草幼根生長的活性,因此對開發新型微生物源 除草劑具有重要的價值。本發明提供的菌株具有較好的除草活性可應用于制備微生物源除 草劑。
【附圖說明】
[0028] 圖1為蜻蜓腸道共生土曲霉(Aspergillus terreus QT122)菌株的培養特征圖;
[0029] 圖2蜻蜓腸道共生土曲霉(Aspergillus terreus QT122)菌株的孢子形態特征 圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合具體實施案例對本發明做進一步的解釋。
[0031] 實施例1、蜻蜓腸道共生土曲霉(Aspergillus terreus QT122)的分離、純化與鑒 定:
[0032] 供試蜻蜓采自浙江師范大學附近郊區。將捕捉回來的蜻蜓饑餓處理24h,于無菌條 件下用75% (體積% )酒精進行表面消毒2min,再用無菌水漂洗3次后用無菌鑷子解剖。 取出腸道置于無菌研缽中,加少量無菌水進行研磨,再用無菌水將其稀釋成1〇'1〇_ 2、1〇_3 三個濃度梯度。分別取各濃度梯度稀釋液〇.2mL涂布于麥芽固體培養基(MEA培養基)上, 于28°C恒溫箱中倒置培養。待菌落長出后,從菌落邊緣挑取少量菌絲,轉接到新的MEA培養 基上,如此反復轉接得到單菌落,并將該單菌落QT122保存至MEA試管斜面備用。
[0033] 按照BioTeke新型快速基因組DNA提取試劑盒說明書,提取上述所得的共生 菌 QT122 基因組 DNA,采用 ITS 通用引物 ITSl (5, -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' 正向)和 ITS4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',反向)擴增 rDNA ITS 區基因序列并純化。
[0034] 測序結果通過BLAST程序進行相似度比較;分析結果表明,共生真菌QT122與 Aspergillus terreus (KM 924436)具有較高相似度,相似度為99%。結合該菌形態學特征, 鑒定該菌為A. terreus。
[0035] 上述MEA培養基配方為:生麥芽20g,蔗糖20g,蛋白胨lg,瓊脂20g,蒸餾水lL,pH 7.0, 并于I. 1個大氣壓,121°C下滅菌20min (為常規滅菌)。
[0036] 將上述土曲霉(Aspergillus terreus)轉接至MEA試管斜面保存備用。
[0037] 對上述土曲霉(Aspergillus terreus)進行了菌種保藏,保藏單位:中國典型培 養物保藏中心(CCTCC);保藏名稱為:Aspergi Ilus terreus QT122 ;保藏地址:中國武漢武 漢大學;保藏日期:2015年4月17日;保藏號:CCTCC NO :M 2015240。
[0038] 實施例2、蜻蜓腸道共生土曲霉(Aspergillus terreus QT122)的液體發酵:
[0039] 土曲霉(Aspergillus terreus QT122)的活化:從保藏菌種的MEA試管斜面中取 帶菌的菌絲體塊(約1~2g)于新鮮的麥芽固體培養基(MEA)上,于28°C恒溫箱中倒置培 養,得到活化好的土曲霉(Aspergillus terreus QT122)。
[0040] 將活化好的土曲霉(Aspergillus terreus QT122)的菌絲體塊(約2~3g)接種 到裝有150mL麥芽液體培養基(ME培養基)的250mL三角瓶中,于28°C,170rpm/min的條 件下培養3d作為種子液;共接種6~7瓶。
[0041] 然后按照1 %體積比的接種量,將5ml的種子液轉接入裝有500mL麥芽液體培養基 (ME培養基)的1000 mL三角瓶中,于28°C,170rpm/min的條件下培養7d ;得土曲霉QT122 發酵液(簡稱發酵液)。
[0042] 麥芽液體培養基(ME培養基)為:生麥芽20g,蔗糖20g,蛋白胨lg,蒸餾水1L,pH 7.0, 并于I. 1個大氣壓,121°C下滅菌20min (為常規滅菌)。
[0043] 實施例3、蜻蜓腸道共生土曲霉(Aspergillus terreus QT122)代謝產物的分離純 化:
[0044] 將按照實施例2所述方法制備而得的40L發酵液經4層紗布過濾,所得濾液用等 體積的乙酸乙酯進行萃取,共萃取3次,將萃取液經真空濃縮干燥(于0. 1個負壓的真空 度,45°C干燥30~40分鐘),得到褐色的發酵液粗提物(26. 23g)。
[0045] 將所得的發酵液粗提物(26. 23g)用硅膠柱層析(200~300目的硅膠,約260g)進 行粗分,采用二氯甲烷/甲醇進行梯度洗脫,所述二氯甲烷與甲醇的體積比依次為:1〇〇:〇, 100:1,100:2, 100:4, 100:8, 100:16, 100:32 ;每種洗脫液的用量分別約為 5100ml、4500ml、 3750ml、3000ml、2250ml、1500ml、1500ml,流速為lOml/min。不同的梯度洗脫所得分別進行 收集。
[0046] 將所得的第1種洗脫部分Fl進行濃縮(于0. 1個負壓的真空度,45°C干燥30~ 40分鐘)后于甲醇中進行重結晶,能分別得到化合物1(橙色針狀結晶,約5. Ig)和化合物 2 (橙色粉末,約6. 9g)。對所得的第2種洗脫部分F2進行同樣的處理(即,濃縮后于甲醇中 進行重結晶),得到化合物3 (白色針狀結晶,約12. Ig)和化合物4 (黃色粉末,約15. 9g)。 共得到上述4個單一代謝產物。最后結合多種波譜技術對所述4個化合物進行結構鑒定。
[0047] 上述4個化合物的波譜數據為:
[0048] 化合物 1 :橙色針狀結晶。ESI-MS:m/
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