一種高產洛伐他汀的生產方法

文檔序號:8246988
一種高產洛伐他汀的生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物技術領域,具體涉及一種高產洛伐他汀的生產方法及該生產方 法所用到的紅曲菌。
【背景技術】
[0002] 洛伐他汀是一種能夠抑制體內膽固醇合成的生理活性物質,自1987年美國Merck 公司將洛伐他汀系列開發推出新一代的降膽固醇藥物以來,洛伐他汀作為新型的調整血脂 藥,深受廣大患者的歡迎。
[0003] 目前,洛伐他汀的生產菌株主要為土曲霉和紅曲霉。土曲霉發酵產量高,但出于安 全考慮,土曲霉發酵物需經有機溶劑提取,或再進行化學合成等步驟,得到的為純品閉環洛 伐他汀。這些是目前市場上醫藥類降脂藥物的主要成分。閉環洛伐他汀本身無活性,需經人 體內的羥基酯酶水解,從而增加肝、腎負擔,屬美國處方藥物管轄。而開環洛伐他汀可以被 人體直接利用,一般只有在天然發酵的紅曲霉中能夠得到。目前紅曲霉的洛伐他汀產量較 低,但紅曲霉發酵具有其獨特的優勢:其發酵產物中除了含有洛伐他汀之外,還有一系列洛 伐他汀結構類似物、Y -氨基丁酸等生理活性物質存在,這些相關成分和洛伐他汀相聯合, 不僅具有協同調節血脂的功效,而且還極大地降低了純品洛伐他汀的副作用。因此,以紅曲 霉開發的保健食品、保健藥品在國內、國際市場上都非常受歡迎。
[0004] 紅曲霉的發酵工藝主要有兩種,即固態發酵和液態發酵。目前紅曲霉生產洛伐他 汀主要采用固態發酵的方式。固態發酵具有生產過程簡單,投資少,產量高,后處理簡單等 優點。固態發酵也有缺點,如周期較液態發酵長,條件不易控制,容易染菌等。在工業化固 態發酵時,培養基和培養條件對其產量和品質的影響很大,獲得的產品品質參差不齊,已逐 漸失去市場競爭力。液態發酵法具有規模大,自動化程度高,人力成本低,生產過程易控制 等顯著優點。但是,由于受到產量和生產成本的限制,液體發酵生產洛伐他汀的研究一直停 留在實驗室水平,沒有形成產業化規模。
[0005] 因此,通過誘變育種獲得洛伐他汀產量更高的紅曲霉菌株,并通過優化發酵條件 提高紅曲霉的洛伐他汀的產量對推動紅曲類降脂產品的發展具有舉足輕重的作用。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的之一高產洛伐他汀的生產方法,并提供能夠有效提高洛伐他汀產量 的誘變菌株紅曲霉。
[0007] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的: 一種高產洛伐他汀的生產方法,包括下述步驟: a、菌種誘變:以生理鹽水從初始菌株紫色紅曲菌生長斜面上將孢子洗下,制得孢子懸 液,接種種子培養基,培養36 h左右,取菌懸液以無菌紗布過濾,以玻璃珠震蕩打散至單孢 子懸液,收集單孢子懸液然備用; 在無菌試管內加入等體積的單孢子懸液和1%的氯化鋰溶液,充分混合,放置3個小時, 最后用無菌磷酸緩沖液稀釋100倍,終止反應; 吸取I mL經氯化鋰處理過的孢子稀釋液注入無菌小皿中,置于激光下照射。照射時間 為8-12min,激光波長:630-640 nm照射功率密度為15-18 mw/cm2; 將誘變處理后的菌液稀釋后涂布PDA固體平板,26-32°C培養3-4 d ; 將長出的單菌落轉接到固體PDA平板的一側,26-32°C培養4-5 d后,在平板另一側轉 接構巢曲霉,26-32°C下進行對峙培養7-8 d; b、選取構巢曲霉菌落直徑為3. 0-5. Ocm的紅曲霉菌株,從平板上刮取紅曲霉孢子轉接 到種子培養基上,26-32°C培養2-5 d,按照12-16%的接種量,將長好的種子培養基轉接到 發酵培養基中,26-32°C搖床120-180 r/m培養2-5 d后,20-25°C搖床120-180 r/m培養 18-25d。
[0008] 上述種子培養基包括米粉2-5g、碳源l-3g、氮源0. l-o. 5g、蛋白胨1.0-2. 0g、 MgSO4 · 7H20 0· 02-0. 08g、KH2PO4 0· 10-0. 20g,加水至 100 mL。
[0009] 優化的,上述碳源為葡萄糖、乳糖或木糖,所述氮源為NaN03。
[0010] 作為上述種子培養基的一種優化,上述種子培養基包括米粉3g、葡萄糖2g、NaNO3 〇· 2g、蛋白胨 I. 5g、MgSO4 · 7H20 0· 05g、KH2PO4 0· 15g,加水至 100 mL。
[0011] 上述發酵培養基包括米粉5-10 g、碳源1-5 mL、氮源0. l-o. 5 g、蛋白胨 1. 0-2. 0g、MgSO4 · 7H20 0· 02-0. 08g、KH2PO4 0· 10-0. 20g、加水至 100 mL。
[0012] 優化的,上述碳源為甘油或葡萄糖,所述氮源為NaN03。
[0013] 作為上述發酵培養基的一種優化,上述發酵培養基包括米粉7 g、甘油5mL、NaNO3 〇· 2 g、蛋白胨 I. 5g、MgSO4 · 7H20 0· 05g、KH2PO4 0· 15g、加水至 100 mL。
[0014] 優化的,上述的一種高產洛伐他汀的生產方法,包括下述步驟: a、 菌種誘變:以生理鹽水從初始菌株Monascus purpureus紫色紅曲菌生長斜面上將 孢子洗下,制得孢子懸液,接種種子培養基,培養36 h,取菌懸液以無菌紗布過濾,以玻璃珠 震蕩打散至單孢子懸液,收集單孢子懸液然備用; 在無菌試管內加入等體積的單孢子懸液和1%的氯化鋰溶液,充分混合,放置3個小時, 最后用無菌磷酸緩沖液稀釋100倍,終止反應; 吸取I mL經氯化鋰處理過的孢子稀釋液注入無菌小皿中,置于激光下照射。照射時間 為lOmin,激光波長:632. 8nm照射功率密度為17. 6 mw/cm2; 將誘變處理后的菌液稀釋涂布PDA固體平板,30°C培養3 d ; 將長出的單菌落轉接到固體PDA平板的一側,30°C培養4 d后,在平板另一側轉接構巢 曲霉,30°C下進行對峙培養8 d; b、 選取構巢曲霉菌落直徑為3. 0-5. Ocm的紅曲霉菌株,從平板上刮取紅曲霉孢子轉接 到種子培養基上,30°C培養3d,按照15%的接種量,將長好的種子培養基轉接到發酵培養基 中,30°C搖床150r/m培養3 d后,24°C搖床150 r/m培養20d。
[0015] 上述的一種高產洛伐他汀的生產方法中,所述初始菌株紫色紅曲菌Monascus sp.于2012年11月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保 藏編號為CGMCCNo. 6807,保藏單位地址為:北京市朝陽區大屯路。
[0016] 本發明的紫色紅曲霉(Jfoftascw1S 具有以下形態特征: 于400倍顯微鏡觀察紫色紅曲霉的菌絲體形態,菌株形態特征為:菌絲體分枝甚繁、有 隔,直徑3. O μ m-7. O μ m,幼時有內含物,分生孢子球形或洋梨形、無色,子囊果球形、無色、 短柄,橢圓形(5. 0-7. 0) μ mX (4. 5-5. 0) μ m。
[0017] 本發明的紫色紅曲霉MPB3具有以下培養特征: 紫色紅曲霉在PDA瓊脂培養基中30°C培養7d,菌落較大,稍凸起,疏松,呈絨氈狀,蔓 延性一般,正面中間淺粉色,背部深紅色,菌落大?。?. 0-4. 0) cmX (4. 5-5. 5) cm,生長速度 較快; 紫色紅曲霉MPB3在察氏瓊脂培養基中30°C培養7d,菌落小,凸起最高,呈絨氈狀,疏 松,蔓延性差,正面淺紅色,背部紅色,菌落大?。?. 5-3. 0) cmX (3. 5-4. 5) cm,生長速度較 慢。
[0018] 本發明的紫色紅曲霉的生物學特性如下: 生長溫度為20°C -38°C,最適生長溫度為35°C -32°C,在pH2. 0-7. 0的范圍內均能生 長。在察氏培養基和PDA瓊脂培養基30°C培養7d,連續傳代數代培養,其培養特征及形態 特征均無明顯變化,該菌株的生物學性狀基本穩定。
[0019] 本發明的有益效果是: 本發明的誘變菌株及其生產洛伐他汀的方法,與常規紅曲霉生產菌株及生產方法相 t匕,其洛伐他汀產量可達到1650mg/L以上,洛伐他汀生產能力更高,提高了洛伐他汀的質 量。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發明紫色紅曲霉在PDA培養基平板上生長時菌落形態; 圖2為本發明紫色紅曲霉在在查氏培養基平板上生長時菌落形態。
【具體實施方式】
[0021] 以下是本發明的具體實施例,對本發明的技術方案做進一步作描述,但是本發明 的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發 明的保護范圍之內。
[0022] 實施例1 高產洛伐他汀紅曲霉菌株的誘變及初篩 以生理鹽水從初始菌株Monascus purpureus紫色紅曲菌生長斜面上將孢子洗下,制得 孢子懸液,接種種子培養基,培養36 h左右,取菌懸液以無菌紗布過濾,以玻璃珠震蕩打散 至單孢子懸液,收集單孢子懸液備用。
[0023] 在無菌試管內加入等體積的單孢子懸液和1%的氯化鋰溶液,充分混合,放置3個 小時,最后用無囷憐Ife緩沖液稀釋100倍,終止反應。
[0024] 吸取I mL經氯化鋰處理過的孢子稀釋液注入無菌小皿中,置于激光下照射。照射 時間為10 min。激光波長:632. 8 nm照射功率密度為17. 6 mW/cm2。
[0025] 將經過誘變處理后的菌液稀釋至適當濃度后涂布PDA固體平板,30°C培養3 d。將 長出的單菌落利用打孔器轉接到固體PDA平板的一側,30°C培養4 d后,利用打孔器在平板 另一側轉接構巢曲霉,30°C下進行對峙培養8 d后,通過比較構巢曲霉菌落直徑來篩選洛伐 他汀高產的紅曲霉菌株。
[0026] 實施例2 紅曲霉液態發酵生產洛伐他汀 發酵菌株:Monascus purpureus紫色紅曲菌 種子培養基: 米粉 3 g,葡萄糖 2 g,NaNO3 0.2 g,蛋白胨 1.5 g,MgSO4WH2O 0.05 g,KH2PO4 0. 15 g,加水至100 mL。
[0027] 發酵培養基: 米粉 7 g,甘油 5 mL,NaN03 0.2 g,蛋白胨 1.5 g,MgS04.7H20 0.05 g,KH2P04 0.15 g,加水至100 mL。
[0028] 培養條件: 從平板上刮取紅曲霉孢子轉接到裝有50 mL種子培養基的三角瓶中,30°C培養3 d。按 照15%的接種量,將長好的種子培養基轉接到150 mL發酵培養基中,30°C搖床150 r/m培 養3 d后,24°C搖床150 r/m培養20d. 樣品
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