一種以重組甲醇酵母發酵制備巴曲酶的方法

文檔序號:77493
專利名稱:一種以重組甲醇酵母發酵制備巴曲酶的方法
技術領域
本發明涉及甲醇酵母表達抗血栓藥物重組巴曲酶的發酵工藝。背景技術
隨著血栓栓塞性疾病患者的增加,抗血栓藥物的研制已成為熱點之一。人們一方面采用分子生物學技術對現有藥物進行分子結構改造,以期獲得更為優良的溶栓藥物。另一方面,積極的尋找一些安全性好、療效好、副作用小的天然來源的溶栓藥物。
在E.coli中表達某些蛋白已經是較為常規的生產藥用蛋白的基本手段,但是在對蛇毒類凝血酶實際研究中發現,在E. coli中表達蛇毒類凝血酶的量很少。潘華等采用 RT-PCR法擴增出蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒類凝血酶基因I^allas,以表達載 #pET-24a(+)構建T-7啟動子控制下的表達質粒pET-Pallas,轉化E. coli BL21(DE3), 并用0. 4mmol/L IPTG誘導表達,經SDS-PAGE電泳和蛋白質印跡分析表明有生物活性的 I^llas表達(潘華等,蝮蛇類凝血酶基因的分析及表達研究,生物化學與生物物理學報, 1999,31,79)。Fan等采用PCR法擴增出蝮蛇(Agkistrodon acutus)的蛇毒類凝血酶基因 Acutin,克隆到表達載體pET-Ma,在E. coli BL21DE(3)中表達,經SDS-PAGE電泳和蛋白質印跡分析表明有生物活性的Acutin表達(Fan C. Y.等,Biochemistry and Molecular Biology International, 1999,47,217)。但它們的表達效率普遍較低,沒有實際生產價值。
采用基因工程的手段生產富含多對二硫鍵的蛋白一直是一個技術難題,尤其是生產有六對二硫鍵的絲氨酸蛋白水解酶。這是因為二硫鍵配對錯誤率很高,在原核中得到的幾乎全是包涵體,雖然對包涵體的變性復性能得到少量的有活性的目的蛋白,但是其成本決定了不具備實際生產意義。真核表達系統(酵母、CHO和昆蟲細胞等)能保證較高的二硫鍵配對正確率。另外,蛇毒類凝血酶分子中有不同含量的糖基化,原核細胞不能對所表達的外原蛋白進行糖基化,而糖基對蛋白的空間結構和酶活性都起穩定作用。因此空間結構復雜、有糖鏈的蛋白本身就不適合用原核細胞進行表達。而真核表達系統除能保證較高的二硫鍵配對正確率外,還能對表達產物進行一定程度的糖基化,雖然糖基化的含量和種類與蛇毒中類凝血酶分子所含的糖基不同,但也很好地保證了表達產物的活性。
蛇毒類凝血酶現已廣泛應用于臨床并取得明顯的臨床效果,但仍有很多問題未解決一是蛇毒類凝血酶制劑作為一種生物制品,存在抗原性,偶有過敏反應出現,且多次應用后易產生相應的抗體,從而降低制劑的療效;二是蛇毒的來源有限,不利于大規模生產, 同時價格較高,不利于其廣泛應用;三是類凝血酶是從蛇毒中純化得到的,純度難以控制, 從而增加了毒副作用。解決這些問題的辦法是借助基因重組技術,在實驗室中進行表達,但這些必須在對蛇毒類凝血酶的結構及性質作更深入的研究后方可進行。
成熟的巴曲酶分子是由231個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白,理論計算出其分子量為25. 5KD,等電點為7.39,國外從Bothrops atrox毒液中提取的巴曲酶,其實際分子量為42KD,這種分子量的偏差是由于糖基化修飾的緣故。從巴曲酶蛋白質一級結構中可以發現,其分子內有兩個N-糖基化位點=Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr^此外,Bothrops atrox的其他亞種以及其他種類毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白,不過其分子量從29. IKD到42KD不等,這可能是由于不同亞種之間氨基酸組成上差別或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12個半胱氨酸,根據已知的絲氨酸蛋白酶類分子的研究結果,推測這12個半胱氨酸可能有Cys7-Cys139、Cys26-Cys42, Cys74-Cys230, CyS118-Cys184、CyS15°-CyS163、CySm-CyS199六個分子內二硫鍵的形成(Itoh n. et al. The J. of BiologicalChemistry,262,3132,1987)。
考慮到進口蛇毒原料成本較高,同時,巴西矛頭蝮蛇是稀有的保護蛇種,蛇毒產量有限。因此,我們采用基因工程的方法大量生產重組巴曲酶,我們首先構建了表達天然巴曲酶的基因工程菌種,但發現在發酵表達時,目的蛋白有嚴重的降解現象,這就極大地影響了巴曲酶的產量。
因此,我們對巴曲酶進行定點突變,將巴曲酶基因上KEX2蛋白酶的酶切位點進行突變,避免其對發酵液中所表達的巴曲酶的降解,同時還不影響巴曲酶的凝血活性,這將極大地提高巴曲酶的產量,更好地滿足研究和臨床應用的需要。
巴曲酶蛋白雖然只有一條肽鏈,但是由于分子內二硫鍵多,還有糖基化修飾等,所以采用基因工程手段生產這種蛋白有很大的技術難度。這也是一直沒有重組產品問世的主要原因之一。
雖然研究者對天然巴曲酶的性質有比較多的了解,但是,對其分子生物學方面的研究一直進展緩慢,直到1987、1988年才由日本的研究者完成對巴曲酶基因的CDNA和基因組 DNA 測序工作(Nobuyuki Itoh etal J. Biol. Chem. 262(7) :3132-3135,1987 J. Biol. Chem. ,263 :7628-7631,1988) MaedaM等采用基因重組方法,在Ε. coli中,采用融合表達系統,以包涵體(InclusionBody)的形式表達出該成份,據報道得到了所謂有生物學活性巴曲酶(MaedaM. etal, J Biochem(Tokyo),109(4) :632-637,1991),而且還為此申請了專利 (Pat, No. :JP2124092,1990)。但沒有后續報道。
采用基因工程的手段生產富含多對二硫鍵的蛋白一直是一個技術難題,尤其是生產有六對二硫鍵的絲氨酸蛋白水解酶。這是因為二硫鍵配對錯誤率很高,在原核中得到的幾乎全是包涵體,雖然對包涵體的變性復性能得到少量的有活性的目的蛋白,但是其成本決定了不具備實際生產意義。真核表達系統(酵母、CHO和昆蟲細胞等)能保證較高的二硫鍵配對正確率。另外,蛇毒類凝血酶分子中有不同含量的糖基化,原核細胞不能對所表達的外原蛋白進行糖基化,而糖基對蛋白的空間結構和酶活性都起穩定作用。因此空間結構復雜、有糖鏈的蛋白本身就不適合用原核細胞進行表達。而真核表達系統除能保證較高的二硫鍵配對正確率外,還能對表達產物進行一定程度的糖基化,雖然糖基化的含量和種類與蛇毒中類凝血酶分子所含的糖基不同,但也很好地保證了表達產物的活性。
Weon-Kyoo You等報道了用甲醇酵母表達Batroxobin,獲得了每升發酵液產 13. 16mg 有活性的 Batroxobin (Weon-Kyoo You 等,FEBS Letters,2004,571,67)。
上海萬興生物制藥有限公司申請了基因工程表達Batroxobin的專利(公開號CN1534093A,2004),在大腸桿菌和甲醇酵母中均獲得表達,但在大腸桿菌中表達的 Batroxobin均為無活性蛋白。在甲醇酵母中獲得一定量Batroxobin的表達,產量達每毫升發酵液20克氏單位(20KU/ml),這一產量已初步具備生產意義。上述研究結果表明利用基因工程方法生產蛇毒類凝血酶是可行的,但要用真核表達系統。[0014]本公司也申請了相關專利,申請號200710011566.4(—種定點突變的基因工程巴曲酶及用途),產量達每毫升發酵液90克氏單位??赏耆糜诳寡ㄋ幬锏纳a開發。

發明內容
本發明是對定點突變巴曲酶的高密度連續發酵工藝的研究,其目的在于提供一種抗血栓的重組巴曲酶的發酵方法,研究結果表明,該方法可大幅提高發酵效率,使目的產物的表達量得到顯著提高。
本發明具體提供了一種以重組甲醇酵母發酵制備巴曲酶的方法,包括酵母菌的分批發酵、補料發酵及甲醇誘導表達巴曲酶階段,所述酵母菌是相對于天然的巴曲酶的第45 位精氨酸突變為賴氨酸的重組定點突變巴曲酶,具體為
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本發明提供的一種以重組甲醇酵母發酵制備巴曲酶的方法,其特征在于,酵母菌的分批發酵、補料發酵的碳源為甘油,PH = 5. 0-5. 5 ;甲醇誘導表達巴曲酶階段的pH = 6. 8-7. 0,溫度為25°C,甲醇濃度為0. 5%。進行甘油和甲醇混合補料誘導和表達時,其誘導時菌體OD高于300,誘導階段維持3小時士0. 5小時,菌體高密度表達,最高達到0D600。當菌體活性不再增長時,進行放料補料,開始連續培養;其中補料為鹽培養基。放料補料后,OD 值應保持在300-350之間。
本發明所述重組定點突變巴曲酶能夠通過以分泌表達的方式大量生產獲得,同時具有較高的生物活性。它可以通過將人工合成的定點突變的巴曲酶結構基因在酵母菌細胞中,以分泌表達的方式大量產生獲得,優選通過甲醇酵母菌以分泌表達的方式大量產生獲得。
本發明所述重組定點突變巴曲酶,在甲醇酵母菌中實現分泌表達時,可以依據巴曲酶的天然氨基酸序列,選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼子,人工合成定點突變的巴曲酶結構基因序列,再將人工合成的定點突變的巴曲酶結構基因重組到甲醇酵母菌表達載體 pPICZa中。并轉化到KM7IH酵母菌種。
通過優化發酵條件,確定了酵母菌最優發酵表達條件,并對表達產物進行了分離純化,得到了高活性的重組定點突變巴曲酶。結果表明,定點突變基因工程巴曲酶較從蛇毒中提取的天然巴曲酶的比活性提高了一倍多。產率達到每毫升發酵液高于90KU。
具體實施方式
實施例1
挑YPD平板培養基30°C培養的單菌落于搖瓶中進行震蕩培養18小時,然后轉接到 1. 5升繼續培養過夜,直接接種到30升發酵罐中,培養基15升為鹽培養基,溶氧保存30 %, 轉數700-800rpm。碳源耗盡后進行甘油流加補料。[0029]在OD值達到300-350時,進入甲醇誘導階段,在2小時的時間內甲醇加到0. 2%。 當甲醇開始利用時,甲醇濃度逐漸提高到0. 5% 1%,并逐漸降低培養溫度到25°C,pH調至6. 8 7. 0,發酵過程中要維持罐壓在0. 04-0. 06MPa之間,空氣流量在0. 2-0. 25VVM之間,轉速維持在700 800rpm之間。
當OD接近600,活性達90U時,進行放料、補料,放料補料后,OD值應在300-350左
右。培養基裝量為15L左右,然后進行連續培養。通過連續培養,每批產量都可大幅提高, 放料補料次數越多,產量越高。按照放料補料一次,可提高70%左右,達到4. OX 106KU。
采用同類產品活性的測定方法進行體外凝血試驗,具體實驗方法為取人一枸櫞酸抗凝血漿0. anl,加入直徑Icm的試管中,置37°C水浴中保溫3分鐘,加入37°C預熱的樣品溶液0. anl,立即混勻計時,于40秒開始,檢查血漿凝固情況,記錄初凝時間,同時測定3 管,3管初凝時間誤差應小于20秒。若初凝時間小于40秒,則適當稀釋供試品溶液,記錄 60士20秒內凝固的供試品溶液濃度,在上述條件下,能使0. 2ml人-枸櫞酸抗凝血漿在60 秒凝固的酶量,定義為一個KU。
實施例2
挑YPD平板培養基30°C培養的單菌落于搖瓶中進行震蕩培養18小時,然后轉接到
1.5升繼續培養過夜,直接接種到30升發酵罐中,培養基15升為鹽培養基,溶氧保存30 %, 轉數700-800rpm。碳源耗盡后進行甘油流加補料。
按invitrogin的發酵方法進行中試規模的發酵。其它誘導200小時以上。當發酵液中蛋白活性不再增加時,將發酵液離心收集上清,蛋白活性達到90KU/ml,產量達到
2.34X 106KU。經微濾除菌,采用疏水柱層析、離子交換柱層析、凝膠柱層析等生化分離技術,得到純度達97%以上的活性蛋白。
實施例3
種子液在1. 5L酵母氮源基礎培養基中發酵M小時后,轉到30L發酵液中進行發酵培養。13. 5L 鹽培養基,組成如下=H3PO4, 27ml/L ;CaSO4 · 2H20,0. 9g/L ;K2SO4,18g/ L ;MgSO4 · 7H20,15g/L ;Κ0Η,4· 13g/L ;甘油 40g/L ;4. 4ml/L 微量礦物質溶液。
在發酵過程中,用NH4OH調pH值,使其維持在5. 0。30°C通氧劇烈攪拌(IOOOrpm) 發酵,添加消泡劑。發酵M小時后,加入含12ml/L微量礦物質的50%甘油,溶氧濃度為 30%,繼續培養10小時。當碳原饑餓30分鐘后,加入甲醇誘導。剛開始的5小時加入甲醇的速率低,不提供氧量,以使酵母適應甲醇,100%甲醇含12ml/L微量礦物質溶液,其溶氧量在30%以上。繼續發酵活性不再增加,凝血活性達到43KU/ml,產量達到1. 12X 106KU。
權利要求
1.一種以重組甲醇酵母發酵制備巴曲酶的方法,包括酵母菌的分批發酵、補料發酵及甲醇誘導表達巴曲酶階段,所述酵母菌是相對于天然的巴曲酶的第45位精氨酸突變為賴氨酸的重組定點突變巴曲酶,其特征在于酵母菌的分批發酵、補料發酵的碳源為甘油,PH =5. 0-5. 5 ;甲醇誘導表達巴曲酶階段的pH = 6. 8-7. 0,溫度為25°C,甲醇濃度為0. 5%。
2.按照權利要求
1所述以重組甲醇酵母發酵制備巴曲酶的方法,其特征在于,進行甘油和甲醇混合補料誘導和表達,其誘導時菌體OD高于300,誘導階段維持3小時士0. 5小時,菌體高密度表達,最高達到0D600。
3.按照權利要求
1所述以重組甲醇酵母發酵制備巴曲酶的方法,其特征在于,當菌體活性不再增長時,進行放料補料,開始連續培養;放料補料后,OD值應保持在300-350之間。
4.按照權利要求
3所述以重組甲醇酵母發酵制備巴曲酶的方法,其特征在于,所述補料為鹽培養基。
專利摘要
本發明的目的在于提供一種以重組甲醇酵母發酵制備巴曲酶的方法,包括酵母菌的分批發酵、補料發酵及甲醇誘導表達巴曲酶階段,所述酵母菌是相對于天然的巴曲酶的第45位精氨酸突變為賴氨酸的重組定點突變巴曲酶,其特征在于,酵母菌的分批發酵、補料發酵的碳源為甘油,pH=5.0-5.5;甲醇誘導表達巴曲酶階段的pH=6.8-7.0,溫度為25℃,甲醇濃度為0.5%。研究結果表明,該方法可大幅提高發酵效率,使目的產物的表達量得到顯著提高。
文檔編號C12N9/60GKCN102242101SQ201010166684
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月10日
發明者姜大威, 孟威, 徐梅, 楊宇, 王宏英, 王建華, 薛百忠, 薛雁 申請人:遼寧諾康醫藥有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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