藏獒分子標記的特異性引物及檢測方法與流程

本發明屬于分子標記技術領域，具體涉及家犬品種藏獒單核苷酸變異及微衛星標記的特異性引物及檢測方法技術領域。

背景技術：

藏獒(Tibetan Mastiff)隸屬于食肉目犬科犬屬灰狼種的家犬亞種(Canis lupus familiaris)，是青藏高原特有的家犬品種，主要分布于青藏高原及喜馬拉雅山脈，包括尼泊爾、印度、不丹。歷史上，藏獒主要被當地牧民飼養，用于保護畜牧牲口免于野外捕食動物的侵害。近年來，由于其獨特適應高原的表型和能力備受市場追捧，過度貿易、錯誤引種、隨意繁殖、人為炒作等市場行為使藏獒種質資源面臨巨大威脅。為了科學保護藏獒種質資源，實現資源的可持續發展與利用，開展該種的特異遺傳變異標記及群體遺傳特征分析以及分子標記育種具有重要意義。目前，尚未見藏獒遺傳分子標記開發的相關報道。

技術實現要素：

本發明正是為了解決上述問題缺陷，提供一種藏獒分子標記用的特異性引物并交代了詳細的檢測方法，對藏獒犬的遺傳特征、譜系地理格局、群體結構的分析，以及種質資源的科學保護與利用均具有重要的應用價值。

本發明采用如下技術方案實現。

一種SNP分子標記引物，本發明該分子標記引物擇一包含以下引物對；

TM-P1：F:TGCAAGGAGGAGGAAGAAGG，

R:CTCCCAGTCTCTTGCCTCTG；

TM-P2：F:TGCAAGGAGGAGGAAGAAGG，

R:CTCCCAGTCTCTTGCCTCTG；

TM-E：F:CATTCAGTCAGCATTTCTGC

R:GGGCTGCAGGTTGCGAGGGT；

TM-M：F:TTCTTACATGGCAGCTGGTG，

R:CTTTTCCCTGTGAGCTCTGG；

TM-M1：F:GCTGCAATCCACAATGAAGA，

R:ATGCAGTCAGAACCCCAAGT；

TM-H1：F:GAGGCTTCAAATGCCTTGAG，

R:CATGCCTTAGGGGCAGTAAA；

TM-H2：F:GAGGCTTCAAATGCCTTGAG，

R:CATGCCTTAGGGGCAGTAAA；

TM-C：F:AGTCCCCAGAAGGTTCCATG，

R:GCAACCGGTGGAAAGTTTCT；

TM-S：F:GGCCTCCATGCTTAGCTCTA，

R:AGCACCTTACAGACTCCACC；其中F為上游引物，R為下游引物。

一種SNP分子標記引物組，本發明該引物組包含以下任意兩組引物對及其以上的組合；TM-P1、TM-P2、TM-E、TM-M、TM-M1、TM-H1、TM-H2、TM-C、TM-S；具體序列如上述記載。

一種SSR分子標記引物，本發明該分子標記引物擇一包含以下引物對；

TM-CAS5：F:TCCCTCCTCAGCAGAGAGTC，

R:AACCTCAGGGCTATTCATTTCA；

TM-CAS6：F:TCCCTCTCCCTGTGTCTCTG，

R:CAATCCTTGAGCATGAAACG；

TM-CAS7：F:ACTGTCCTGGTGCCACCTAC，

R:CAACATCCTCTCCCCTGAAA；

TM-CAS8：F:CCACAAAAGACCCACCCATA，

R:CTTCATGGAGCCTGCTTTTC；

TM-CAS9：F:GCTTTTGCTGTGTCCCAAAG，

R:AACTGTGGCCATCATTAGCA；

TM-CAS10：F:TGGCAACATGCTGAAAGTGT，

R:AGGTGGGCTCTGTGACCATA；

TM-CAS11：F:CTCCCTCTGCCTGTCTTCTG，

R:CTTGGGTGCAGAGCTAGTCC；

TM-CAS12：F:TACATCAGCCCCTGCTTTCT，

R:TTGGCTTTAGTTCAGATGGAAG；其中F為上游引物，R為下游引物。

一種SSR分子標記引物組，本發明該引物組包含以下任意兩組引物對及其以上的組合；TM-CAS5、TM-CAS6、TM-CAS7、TM-CAS8、TM-CAS9、TM-CAS10、TM-CAS11、TM-CAS12；具體序列如上述記載。

一種結合SNP和SSR分子標記引物組，本發明該引物組包含至少兩組引物對，即：引物對A和引物對B；所述的引物對A為屬于SNP分子標記引物組中的引物對；所述的引物對B為屬于SSR分子標記引物組中的引物對；SNP分子標記引物組中的引物對為，TM-P1、TM-P2、TM-E、TM-M、TM-M1、TM-H1、TM-H2、TM-C、TM-S；具體序列如上述記載。屬于SSR分子標記引物組中的引物對為，TM-P1、TM-P2、TM-E、TM-M、TM-M1、TM-H1、TM-H2、TM-C、TM-S；具體序列如上述記載。

使用上述引物或引物組的用途，該用途為鑒定或區分藏獒犬和其它家犬。

本發明提供一種藏獒單核苷酸標記的檢測方法，包括以下步驟：

(1)、提取藏獒基因組DNA；

(2)、以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，利用所述的藏獒單核苷酸標記的特異性引物中的每個單核苷酸多態位點的特異性引物分別進行PCR擴增；

(3)、利用ABI3730測序儀對PCR擴增產物進行測序；

(4)檢測單核苷酸多態位點。

本發明通過構建藏獒群體基因組數據庫，篩選具有藏獒特異變異的單核苷酸多態位點，設計單核苷酸多態位點的特異性引物，并對這些單核苷酸多態位點在藏獒中的特異性進行了檢測，開發了9個在藏獒中具有特異變異的單核苷酸多態位點。9個單核苷酸多態位點的編號分別為：TM-P1，TM-P2，TM-E，TM-M，TM-M1，TM-H1，TM-H2，TM-C，TM-S；其核苷酸序列分別如表1所示。

利用本發明中的藏獒單核苷酸標記的特異性引物對100個家犬樣品(包含50只藏獒，50只其它犬種)進行了檢測，結果表明，9個單核苷酸多態位點能夠有效擴增，擴增效率達到100％，利用ABI3730測序儀檢測表明，9個單核苷酸多態位點均表現出藏獒特異的變異，說明本發明中的9對單核苷酸標記的特異性引物能夠用于藏獒的品種遺傳特征鑒定工作。

本發明公開了一組能夠高效擴增藏獒群體單核苷酸標記的特異性引物及檢測方法，且本發明的單核苷酸多態位點具有藏獒群體特異的變異，因此，本發明提供的藏獒單核苷酸標記的特異性引物及檢測方法可應用于在藏獒的品種遺傳特征鑒定等領域。

本發明提供一種藏獒微衛星標記的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、提取藏獒基因組DNA；

(2)、以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，利用所述的藏獒微衛星標記的特異性引物中的每個微衛星位點的特異性引物分別進行PCR擴增；

(3)、利用ABI3730測序儀對PCR擴增產物進行多態性檢測。

本發明通過構建藏獒群體基因組數據庫，篩選含有微衛星序列的DNA序列，設計微衛星位點的特異性引物，并對這些微衛星位點進行了多態性檢測，開發了8個多態性豐富的藏獒微衛星位點。8個微衛星位點的編號分別為：TM-CAS5，TM-CAS6，TM-CAS7，TM-CAS8，TM-CAS9，TM-CAS10，TM-CAS11，TM-CAS12；其核苷酸序列分別如表2所示。

利用本發明中的藏獒微衛星標記的特異性引物對100個家犬樣品(包含50只藏獒，50只其它犬種)進行了檢測，結果表明，9個微衛星位點能夠有效擴增，擴增效率達到100％，利用ABI3730測序儀檢測表明，9個微衛星位點均表現出豐富的多態性，具有藏獒特異的變異特征，且均符合哈迪-溫伯格平衡。說明本發明中的9對微衛星標記的特異性引物能夠用于藏獒的品種遺傳特征鑒定、種群遺傳結構分析、親緣關系鑒定等工作。

本發明公開了一組能夠高效擴增藏獒群體微衛星標記的特異性引物及檢測方法，且本發明的微衛星位點多態性豐富，具有藏獒群體特異的變異，因此，本發明提供的藏獒微衛星標記的特異性引物及檢測方法可應用于在藏獒的品種遺傳特征鑒定、種群遺傳結構分析、親緣關系鑒定等領域，為下一步分子遺傳學研究奠定了基礎。

下面結合附圖和具體實施方式本發明做進一步解釋。

附圖說明

圖1a為本發明使用引物對TM-E擴增所得的單核苷酸PCR產物的瓊脂糖膠電泳圖。

圖1b為本發明使用引物對TM-M擴增所得的單核苷酸PCR產物的瓊脂糖膠電泳圖。

圖1c為本發明使用引物對TM-M1擴增所得的單核苷酸PCR產物的瓊脂糖膠電泳圖。

圖2為采用本發明方法分辨藏獒和其它家犬的示意圖。

圖3為采用本發明方法分辨藏獒亞群體的示意圖。

具體實施方式

以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，所采用的技術手段通常為本領域技術人員所熟知的常規手段。

實施例：

一、藏獒基因組DNA的提取

1、試劑配制：

消化緩沖液：稱取Tris1.2114g，EDTA37.224g，SDS5g，用滅菌超純水定容只1000mL(終濃度為Tris10mmol/L，EDTA0.1mol/L，SDS0.5％)，調節至pH值至8.0，4度保存備用。

2、DNA抽提：

分別提取100個家犬血液樣品200μL，加400μL消化緩沖液，40μL蛋白酶K(10mg/mL)，混勻后于55℃消化5小時；消化清透后，加入600μL水飽和酚，輕輕顛倒混勻30分鐘，6000rpm/min離心10分鐘，抽提上清；再加入300μL水飽和酚，300μL氯仿/異戊醇(24:1)，輕輕顛倒混勻30分鐘，6000rpm/min離心10分鐘，抽提上清；再加入600μL氯仿/異戊醇(24:1)，輕輕顛倒混勻30分鐘，6000rpm/min離心10分鐘，抽提上清；再加入800μL預冷的異丙醇，于-20℃靜置過夜，13000rpm/min離心10分鐘，棄上清；再加預冷的70％乙醇，小心吹打洗滌沉淀，13000rpm/min離心10分鐘，棄上清；晾干乙醇，加入50μL超純水溶解沉淀，置于-20℃保存備用。

二、藏獒特異單核苷酸及微衛星分子標記的挖掘

通過大規?；蚪M測序構建家犬群體基因組數據庫，通過比較藏獒群體和其它家犬群體的基因組差異，鑒定藏獒特異的單核苷酸多態位點變異以及藏獒基因組受選擇區域的微衛星位點。

三、特異性引物設計

用Primer 3軟件設計單核苷酸和微衛星引物，引物退火溫度控制在50℃以上。單核苷酸PCR產物長度控制在350～800bp之間，微衛星PCR產物長度控制在150～500bp之間。

8個單核苷酸多態位點TM-P1，TM-P2，TM-E，TM-M，TM-M1，TM-H1，TM-C，TM-S和1個插入缺失變異位點TM-H2的引物序列、突變類型、退火溫度如表1所示。

表1. 8個單核苷酸多態位點及1個插入缺失變異位點的特異性引物序列、突變類型及退火溫度

表中F表示上游引物，R表示下游引物。

8個微衛星位點CAST5,，CAST6，CAST7，CAST8，CAST9，CAST10，CAST11，CAST12的引物序列、核心重復、退火溫度如表2所示。

表2. 8個微衛星位點特異性引物序列、核心重復及退火溫度

表中F表示上游引物，R表示下游引物

四、單核苷酸多態位點引物及微衛星引物在家犬群體中擴增

利用本發明的單核苷酸多態位點引物及微衛星引物對100只家犬樣本進行PCR擴增。PCR反應體系如表3所示：

表3.PCR反應體系

PCR反應程序如表4所示。

表4.PCR反應程序

五、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物

1、試劑配制：

10×TBE：54.495gTris，27.81g硼酸，14.615gEDTA，pH調至8.0～8.2，定容至500ml(終濃度0.9mol/LTris，0.9mol/L硼酸，0.1mol/LEDTA)，高壓滅菌，室溫保存備用；

0.5×TBE：量取50ml 10×TBE溶液，加超純水定容至1000ml，室溫保存備用。2、制膠：

稱取0.2g瓊脂糖粉，加0.5×TBE定容至100ml(終濃度2％)，高溫溶解，凝膠凝固。

3、電泳

1、單核苷酸PCR產物10μL，加入5μL 6×loading buffer，混勻后上樣，電泳。電壓120V/cm，恒壓電泳40分鐘。

2、微衛星PCR產物1μL，加入0.5μL 6×loading buffer，混勻后上樣，電泳。電壓120V/cm，恒壓電泳40分鐘。

部分PCR產物的瓊脂糖膠電泳如圖1a、1b、1c所示，由于篇幅關系，只提供部分PCR產物的瓊脂糖膠電泳圖。DNA Macker為DL2000(從上到下依次是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)

六、單核苷酸PCR產物測序

1、PCR產物回收：

在紫外燈照射下，將目的條帶切下，放入干凈EP管中，按照通用“DNA產物純化回收試劑盒”提供的步驟回收及純化。

2、將回收產物作為DNA模板分別用正下游引物進行測序反應，反應體系如表5所示。

表5.測序反應體系

測序反應程序如表6所示。

表6.測序反應程序

3、純化測序反應產物：

吸取30μL預冷的75％異丙醇，加入測序反應產物，混勻后于-20℃放置30分鐘。

4℃環境下以3800rpm/min的速度離心30分鐘。

棄上清，烘干測序反應產物。

加入75μL ddH2O，4℃放置2小時溶解。

4、測序：

通過ABI 3730測序儀進行測序。

七、等位基因型分析

八、利用seqman軟件分析SNP位點的等位基因型

九、單核苷酸多態位點的遺傳學參數計算

用plink軟件計算等位基因頻率、觀測雜合度和期望雜合度；檢測位點是否符合哈迪-溫伯格平衡；評估位點在藏獒群體和其它家犬群體的分化程度，計算FST值。本發明用上述方法獲得9個單核苷酸多態位點標記，各單核苷酸多態位點的遺傳學參數如表7所示，所有位點均在藏獒和其它家犬群體間表現出高分化，并且都符合哈迪-溫伯格平衡。

表7.單核苷酸多態位點在家犬群體中的遺傳學參數

九、微衛星PCR產物長度測定

1、PCR產物變性：

吸取900μL Hidye放入EP管中，加入7.4μL的LIZ500分子內標，混勻后分裝到96孔板，每孔加9μL混合液。

吸取1μLPCR產物加入分裝好的Hidye混合液中

95℃變性10分鐘

馬上放入-20℃冷卻5分鐘

4℃放置2小時

2、PCR產物長度測定

通過ABI3730測序儀進行長度測定

十、微衛星位點的遺傳學參數計算

用genescan軟件讀取每個微衛星PCR產物的長度；用geneAlEx軟件計算等位基因數、群體分化系數Fst，哈迪-溫伯格平衡；用Cervus3.0軟件計算每個微衛星位點的多態信息含量。本發明用上述方法獲得8個微衛星標記，各微衛星位點的遺傳學參數如表8所示，所有位點均為高度多態性位點(多態信息含量>0.5)，并且都符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)。

表8.微衛星位點在家犬群體中的遺傳學參數

十一、整合單核苷酸多態位點和微衛星位點信息聚類家犬個體

用STRUCTURE軟件分析每個家犬個體的單核苷酸多態位點和微衛星位點遺傳信息，并以此將所有家犬個體進行聚類分析。本發明用上述方法獲得9個單核苷酸多態位點標記，8個微衛星標記，整合17個位點的遺傳信息通過STRUCTURE軟件進行MCMC分析，如圖2所示分辨藏獒和其它家犬，如圖3所示分辨藏獒亞群體。

圖2.17個位點的聚類分析，假設有2個群體。

圖3.17個位點的聚類分析，假設有3個群體。

以上所述的僅是本發明的具體實施例，方案中公知的具體參數等常識在此未作過多描述。應當指出，上述實施例不以任何方式限制本發明，對于本領域的技術人員來說，凡是采用等同替換或等效變換的方式獲得的技術方案均落在本發明的保護范圍內。本申請要求的保護范圍應當以其權利要求的內容為準，說明書中的具體實施方式等記載可以用于解釋權利要求的內容。

<110>云南中科藏獒種質資源技術開發有限公司

<120>藏獒分子標記的特異性引物及檢測方法

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<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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TGCAAGGAGGAGGAAGAAGG

<210> 2

<211>20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CTCCCAGTCTCTTGCCTCTG

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TGCAAGGAGGAGGAAGAAGG

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CTCCCAGTCTCTTGCCTCTG

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CATTCAGTCAGCATTTCTGC

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGGCTGCAGGTTGCGAGGGT

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TTCTTACATGGCAGCTGGTG

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<211>20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CTTTTCCCTGTGAGCTCTGG

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCTGCAATCCACAATGAAGA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ATGCAGTCAGAACCCCAAGT

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GAGGCTTCAAATGCCTTGAG

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CATGCCTTAGGGGCAGTAAA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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GAGGCTTCAAATGCCTTGAG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CATGCCTTAGGGGCAGTAAA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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AGTCCCCAGAAGGTTCCATG

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCAACCGGTGGAAAGTTTCT

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<212> DNA

<213> 人工序列

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GGCCTCCATGCTTAGCTCTA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

AGCACCTTACAGACTCCACC

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TCCCTCCTCAGCAGAGAGTC

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

AACCTCAGGGCTATTCATTTCA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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TCCCTCTCCCTGTGTCTCTG

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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CAATCCTTGAGCATGAAACG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ACTGTCCTGGTGCCACCTAC

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CAACATCCTCTCCCCTGAAA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CCACAAAAGACCCACCCATA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CTTCATGGAGCCTGCTTTTC

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<212> DNA

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GCTTTTGCTGTGTCCCAAAG

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<212> DNA

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AACTGTGGCCATCATTAGCA

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<212> DNA

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TGGCAACATGCTGAAAGTGT

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<212> DNA

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AGGTGGGCTCTGTGACCATA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CTCCCTCTGCCTGTCTTCTG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CTTGGGTGCAGAGCTAGTCC

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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TACATCAGCCCCTGCTTTCT

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<212> DNA

<213> 人工序列

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TTGGCTTTAGTTCAGATGGAAG