重組酶介導等溫擴增-側流層析技術檢測橡樹疫霉的引物和探針組合及其應用的制作方法

文檔序號:18145640發布日期:2019-07-10 11:47
重組酶介導等溫擴增-側流層析技術檢測橡樹疫霉的引物和探針組合及其應用的制作方法

本發明屬于生物技術領域,具體涉及重組酶介導等溫擴增-側流層析技術(RPA-LFD)檢測橡樹疫霉的引物和探針組合及其應用。



背景技術:

橡樹疫霉(Phytophthora ramorum)引起的橡樹猝死病曾經引起美國西海岸橡樹的成片猝死,其寄主廣泛在加利福尼亞一些沿海地區,80%以上的櫟屬植物感病死亡,該病可在幾周內將成材樹危害致死。目前對該病害還沒有有效的防治措施,加強檢疫,防止病原菌的傳播擴散是控制該病的最有效措施。南朝鮮、加拿大等國已禁止從美國加利福尼亞州、德國、荷蘭等疫區進口各種櫟屬、石櫟屬、杜鵑花屬、越桔屬等的苗木、樹皮、帶皮原木、林地覆蓋物、木屑、橡子、薪材、紙漿原材、果實等繁殖和非繁殖材料。該病原菌的研究處于起步階段,為此應加強疫情監測,建立快速檢測方法,為病害的風險及研究決策提供依據,從而有利于降低橡樹疫病引起的損失。目前橡樹疫霉(P.ramorum)檢測的主要方法有:發病組織病原菌的分離、PCR檢測法、Real-time PCR檢測法、雜交陣列技術(DNA microarray and macroarray)和環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。這些診斷方法或程序繁瑣、周期長,或成本高,或需要使用昂貴的儀器和試劑等。

重組酶介導等溫擴增(Recombinase Polymerase Amlification,RPA)技術被公認是可以替代PCR的核酸檢測技術。其原理是利用重組酶與引物結合形成蛋白-DNA復合物,能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成,對模板上的目標區域進行指數式擴增。另外,RPA技術有多重工具酶匹配進行有效擴增,擴增效率遠高于傳統的PCR技術,所用時間更短,最短可在5min內實現。由于RPA技術具有擴增用時短、不需昂貴儀器、特異性好等特點,使其應用越來越廣泛。RPA技術的最大特點是只需要1對引物即可在37℃左右的恒溫條件下實現模板核酸的擴增,不需要通過高低溫度循環實現核酸解鏈和退火,因此不需要昂貴的儀器設備。而且37℃的常規反應溫度很容易滿足,適合基層對病原菌的快速檢測。

RPA可以與側流層析試紙條(Lateral flow dipstick,LFD)結合起來應用,在RPA擴增體系中,需要生物素標記的反向引物和熒光素標記的探針,探針在距熒光素30個堿基處有一個脫堿基位點(dSpacer),該位點可被nfo核酶識別、切割,產生新的羥基末端,并在DNA聚合酶作用下延伸,形成帶有生物素和熒光素雙標記的RPA產物,然后將產物應用LFD試紙條樣進行檢測。LFD樣品端包被有帶熒光素抗體的納米金粒,檢測線上包被有生物素抗體,當反應液進入試紙條時,帶有熒光素和生物素的擴增產物就會通過抗原抗體結合作用,在檢測線上形成生物素抗體-核算-納米金粒復合體并顯色。檢測時間短,5分鐘左右就能目測結果,肉眼判讀。

目前,RPA技術已經廣泛應用于人體、動物或植物上的病毒檢測,但在植物病原卵菌的檢測方面,尤其是對于橡樹疫霉的RPA檢測,未見相關應用報道。



技術實現要素:

發明目的:針對現有技術中存的上述問題,本發明的目的是提供一種基于RPA-LFD技術檢測橡樹疫霉(P.ramorum)的引物和探針組合,并建立一種橡樹疫霉的RPA-LFD檢測方法,特異性強,靈敏度高;本發明的另一目的是提供一種含有該橡樹疫霉的引物和探針組合的試劑盒,可用于快速檢測橡樹疫霉。

技術方案:為了解決上述問題,本發明所采用的技術方案如下:

一種基于RPA-LFD技術檢測橡樹疫霉(P.ramorum)的引物和探針組合,其正向引物序列如SEQ ID No.1所示,反向引物序列如SEQ ID No.2所示,探針序列如SEQ ID No.3所示,其中反向引物序列5′端用生物素(Biotin)標記;探針序列5′端用熒光素(FAM)標記,距離5′端30個堿基的位置處用四氫呋喃(THF)作為dSpacer替代一個堿基,3′端用C3-spacer阻斷;所述引物和探針序列如下:

正向引物RPA-PraRPA-F:

5′-CTCGGCArTCATGGGACTTCGCATTGAGGGGGCG-3′;(SEQ ID NO.1);

反向引物RPA-PraRPA-R:

5′-Biotin-TTACTTCAGCCAATGAGAGAGCGCCACGTCGAAG-3′;(SEQ ID NO.2);

所述探針序列為:PraRPA-P:

5′-FAM-CACGCCGATTACGCCACCAAGGATTACGC-THF-ACTGTCGATTACGCC-C3spacer-3′;(SEQ ID NO.3)。

所述的引物和探針組合在檢測橡樹疫霉(P.ramorum)中的應用。

所述的引物和探針組合在制備橡樹疫霉(P.ramorum)的檢測試劑或試劑盒中的應用。

本發明還提供了一種基于RPA-LFD技術檢測橡樹疫霉(P.ramorum)的試劑盒,其特征在于,至少包括1次用量以上所述的引物和探針組合,其正向引物序列如SEQ ID No.1所示,反向引物序列如SEQ ID No.2所示,探針序列如SEQ ID No.3所示。

所述試劑盒還包括:裝有凍干酶粉的TwistAmp反應單元管、Rehydration Buffer、MgAc、去離子水、HybriDetect assay buffer、LFD側流層析試紙條。

所述檢測橡樹疫霉(P.ramorum)的試劑盒在檢測橡樹疫霉(P.ramorum)中的應用。

本申請還提供了一種基于RPA-LFD技術檢測橡樹疫霉(P.ramorum)的方法,包括以下步驟:

1)提取待測樣本DNA;

2)以DNA為模板,利用所述引物和探針組合或所述檢測橡樹疫霉(P.ramorum)的試劑盒進行RPA擴增;

3)應用側流層析試紙條進行擴增產物檢測;當試紙條出現兩條棕色條帶(Control line and Test line),一條位于質控區內,一條位于檢測區,則結果為陽性,表明樣本中含有橡樹疫霉(P.ramorum);當試紙條只有質控區出現一條棕色條帶(Control line),檢測區沒有條帶,則結果是陰性,表明樣本中不含有橡樹疫霉(P.ramorum)。

橡樹疫霉的PrA3aPro DNA序列來源于JGI網站(the Joint Genome Institute:http://www.jgi.doe.gov/)(區域:scaffold_1220:1-342);DNA類轉座子序列A3aPro存在于已經測序的其他卵菌中,其序列在種間非常保守,在屬間具有較高的變異?;谠揇NA類轉座子序列同時具備高度的特異性和較高的拷貝數,本申請首先根據橡樹疫霉的PrA3aPro序列設計了橡樹疫霉RPA-LFD檢測的特異性引物和檢測探針。與常規PCR反應不同,RPA反應所需引物的長度通常為30-35bp,探針序列的長度為46-52bp,引物設計時為了避免形成引物內部及之間的二級結構,其長度的增加也使引物設計及選擇難度的增加,因此,引物的設計和選擇對RPA的結果至關重要。RPA技術正處于起步研究階段,尚無專門的引物、探針設計軟件,也沒有大量的數據為其引物設計原則提供依據。因此,本發明的引物和探針組合是需要從靶標序列兩端設計多對引物進行優化、篩選才能得到。

有益效果:相比于現有技術,本發明的優點為:

1)本發明選用的PrA3aPro基因引物是經大量實驗篩選獲得的,特異性好,與其它病原菌無交叉反應。本發明所使用的引物探針擴增效果良好,條帶特異性強,能夠在檢測區(Test line)形成較高濃度的引物-探針異二聚體,因而使試紙條呈現強陽性反應,增加檢測的靈敏度,本發明所建立檢測方法可檢測100pg·μL-1的橡樹疫霉(P.ramorum)基因組。

2)本發明的RPA技術并結合側流層析技術檢測橡樹疫霉(P.ramorum)的方法,既具有分子生物學檢測的高靈敏、高通量,又具有免疫學檢測的特異性好、操作簡便的優點,還不需復雜儀器,尤其適于基層實驗室和檢疫現場的橡樹疫霉(P.ramorum)快速篩查檢測。

3)本發明的方法與常規PCR相比,檢測速度快,不必經過變性、退火、延伸三個步驟,RPA反應的最適溫度在25℃-40℃之間,無需變性,在常溫下20min左右即可完成反應。不需要復雜的儀器設備,適用于現場檢測。實現了恒溫擴增,不像PCR法必須要熱循環,這樣就擺脫了對熱循環儀器的依賴,只要有穩定的熱源RPA反應就可以發生,極大的擴展了RPA使用的范圍,可以真正實現便攜式的現場快速核酸檢測。

4)本發明可以用于帶菌植株組織中橡樹疫霉的快速檢測,只需約2h即可完成檢測過程,是一種檢測橡樹疫霉的有效手段。

本發明系首次采用RPA-LFD技術建立快速檢測橡樹疫霉的方法,特異性強、靈敏度高,可用于實際樣品的檢測,為橡樹疫霉的現場檢測提供一種靈敏、可靠和便捷的新方法。該方法能夠在病害侵染初期就鑒定出病原物,可以對苗圃地或者發病植株中的橡樹疫霉進行檢測。

附圖說明

圖1為RPA-LFD檢測橡樹疫霉在種間的特異性檢測結果圖;圖中,1,2:橡樹疫霉(Phytophthora ramorum);3:雪松疫霉(P.lateralis);4:丁香疫霉(P.syringae);5:冬生疫霉(P.hibernalis);6:瓜類疫霉(P.melonis);7:致病疫霉(P.infestans);8:惡疫霉(P.cactorum);9:陰性對照;

圖2為RPA-LFD檢測橡樹疫霉在屬間的特異性檢測結果圖;1:橡樹疫霉(Phytophthora ramorum);2:終極腐霉(Pythium ultimum);3:木賊鐮孢菌(Fusarium equiseti);4:平頭炭疽菌(Colletotrichum truncatum);5:大麗輪枝菌(Verticilium dahliae);6:立枯絲核菌(Rhizoctonia solani);7:稻瘟病菌(Magnaporthe grisea);8:陰性對照;

圖3為RPA-LFD檢測橡樹疫霉的靈敏度試驗結果圖;

圖4為人工接種橡樹疫霉(P.ramorum)在杜鵑葉片上的樣品檢測;1號為陽性對照,樟疫霉DNA,2-5號為樟疫霉接種杜鵑葉片5天后提取的DNA樣品的RPA-LFD檢測結果;6-7:健康杜鵑葉片RPA-LFD檢測結果;8:陰性對照。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進一步進行描述。以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法,均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行,或者按照試劑盒和產品說明書進行。

下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業途徑得到。

實施例1:提取供試病原菌菌株的基因組DNA

具體提取過程如下:

取少量菌絲粉,加900μL 2% CTAB提取液和90μL 10% SDS,漩渦混勻,于60℃水浴1h,中間每10min上下顛倒幾次。12000rpm離心10min,取上清液加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1),顛倒混勻,12000rpm離心10min將上清液轉移至新管中,加入等體積的氯仿,輕輕顛倒混勻,12000rpm離心5min。取上清液轉移至新管中,加2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3M NaAc(pH5.2),-20℃沉淀(>1h)。12000rpm離心10min,傾去上清液,沉淀用70%乙醇洗滌兩次,室溫晾干。加適量滅菌超純水或TE(pH8.0)溶解沉淀(含20μg mL-1RNase),37℃處理1h后,-20℃保存備用。

對于土壤中DNA的提取,首先將每個土樣晾干碾碎,然后分別稱取0.5g土樣作為提取樣品,采月SPIN試劑盒(Q-Biogene Ltd,USA)進行DNA的提取。土壤DNA提取的具體步驟參見試劑盒說明書。

當發病組織中存在橡樹疫霉時,采用NaOH快速裂解法提取發病組織中的DNA,具體過程如下:取一段發病的組織樣品,每毫克組織加入10μL 0.5MNaOH,在研缽中充分研磨后轉移至1.5mL的EP管中,12000rpm離心5min,取5μL上清液加入495μL 0.1mM Tris(pH 8.0),混勻后取1μL直接用于RPA反應。

實施例2:橡樹疫霉(P.ramorum)RPA引物和探針設計及RPA-LFD檢測方法建立

RPA引物長度一股為30至35個核苷酸。引物過短會嚴重影響重組酶的活性,長引物并不一定能提高擴增性能,反而會增加形成二級結構的可能性,增大來自引物的噪音。此外,引物設計時應盡量避免容易形成二級結構、引物-引物互作、發夾結構的序列,減少引物二聚體的形成。擴增產物大小不超過500bp。

基于該DNA類轉座子序列A3aPro具備高度的特異性和較高的拷貝數,本研究根據橡樹疫霉的PrA3aPro序列設計了橡樹疫霉RPA檢測的特異性引物和檢測探針。使用Primer Premier 5.0設計了正向引物序列RPA-PraRPA-F,反向引物序列RPA-PraRPA-R,探針序列PraRPA-P。其中反向引物序列RPA-PraRPA-R的5′端用生物素(Biotin)標記;探針序列PraRPA-P的5′端用熒光素(FAM)標記,距離5′端30個堿基的位置處用四氫呋喃(THF)作為dSpacer替代一個堿基,3′端用C3-spacer阻斷;具體序列如下:

RPA-PraRPA-F:5′-CTCGGCATTCATGGGACTTCGCATTGAGGGGGCG-3′;(SEQ ID NO.1);

RPA-PraRPA-R:

5′-Biotin-TTACTTCAGCCAATGAGAGAGCGCCACGTCGAAG-3′;(SEQ ID NO.2);

PraRPA-P:

5′-FAM-CACGCCGATTACGCCACCAAGGATTACGC-THF-ACTGTCGATTACGCC-C3spacer-3′;(SEQ ID NO.3)。

以提取的DNA為模板,采用設計的RPA引物,在下述反應體系中進行RPA反應:

樣品檢測:向裝有凍干酶粉的0.2mL TwistAmp反應單元管(TwistAmp Basic kits,Twist)中加入Rehydration Buffer(TwistAmp Basic kits,Twist)29.5μL,10μM的上游引物2.1μL,10μM的下游引物2.1μL,280mM探針0.6μL,DNA 2.0μL,MgAc 2.5μL,去離子水補足至50μL;將RPA擴增體系充分混勻,5,000×g離心10s,置于39℃金屬浴上反應30min,溫育4分鐘,將反應管再次混勻,離心3-5s,放入水浴鍋39℃繼續反應30min。應用側流層析試紙條(LFD strip(Milenia Biotec,Giessen,Germany))進行擴增產物檢測;取RPA反應產物10μL加入190μL的HybriDetect assay buffer(Milenia Biotec,Giessen,Germany)進行稀釋,稀釋后取10μL滴在試紙條的HybriDetect 1 strip。另一端試紙條垂直插入100μL的HybriDetect assay buffer中,室溫放置5min。當試紙條出現兩條棕色條帶,一條位于質控區內(Control line),一條位于檢測區(Test line),則結果為陽性,表明樣本中含有橡樹疫霉(P.ramorum);當試紙條只有質控區出現一條棕色條帶,檢測區(Test line)沒有條帶,則結果是陰性,表明樣本中不含有橡樹疫霉(P.ramorum)。

陰性對照:操作步驟同樣品檢測,將2.0μL模板DNA改為加入2.0μL去離子水。RPA反應結束后,應用LFD進行擴增產物檢測。當試紙條出現兩條棕色條帶,一條位于質控區內(Control line),一條位于檢測區(Test line),則結果為陽性,表明樣本中含有橡樹疫霉(P.ramorum);當試紙條只有質控區出現一條棕色條帶,檢測區(Test line)沒有條帶,則結果是陰性,表明樣本中不含有橡樹疫霉(P.ramorum)。

實施例3:RPA-LFD檢測橡樹疫霉方法的特異性驗證

為了驗證RPA側流層析試紙條檢測方法的特異性,以橡樹疫霉菌株和其它疫霉以及病原菌為供試材料(表1),RPA側流層析試紙條檢測方法的結果顯示橡樹疫霉的試紙條出現兩條棕色條帶,一條位于質控區內(Control line),一條位于檢測區(Test line),則結果為陽性(+),其它鐮孢菌以及病原菌的試紙條只有質控區出現一條棕色條帶,檢測區(Test line)沒有條帶,則結果是陰性(-),表明樣本中不含有橡樹疫霉。

表1用于檢測反應特異性的真菌和卵菌菌株及擴增結果

選擇與橡樹疫毒不同種(雪松疫毒;丁香疫毒;冬生疫毒;瓜類疫毒;致病疫霉;惡疫霉等)和不同屬的菌(終極腐霉;木賊鐮孢菌;平頭炭疽菌;大麗輪枝菌;立枯絲核菌;稻瘟病菌等)的DNA作為模板,進行RPA-LFD檢測。按照實施例1-2的方法進行檢測,檢測結果如圖1和圖2所示,由圖可見,以實施例1設計的引物進行RPA擴增反應后,含有橡樹疫霉樣本RPA擴增產物的LFD檢測結果顯示2條棕色條帶,目標條帶清析,能有效檢測出橡樹疫霉。而其它真菌和卵菌只有在質控區出現一條棕色條帶,陰性對照也只有在質控區出現一條棕色條帶。結果表明所設計的引物和探針組合以及所建立的RPA-LFD檢測橡樹疫霉方法能特異地檢出橡樹疫霉,可用于橡樹疫霉的檢測應用。

實施例4:RPA-LFD檢測橡樹疫霉的靈敏度測定

使用Nanodro 2000微量分光光度計測出實施例1提取橡樹疫霉DNA的濃度為100ng·μL-1。將其依次稀釋為100pg·μL-1、10pg·μL-1、1pg·μL-1、100fg·μL-1、10fg·μL-1,根據實施例1-2采用的引物、反應體系和反應條件,對不同濃度的DNA進行RPA-LFD檢測。

結果如圖3所示,反應體系中分別含有100ng·μL-1、10ng·μL-1、1ng·μL-1、100pg·μL-1橡樹疫霉DNA的試紙條出現兩條棕色條帶,呈陽性反應,反應體系中分別含有10pg·μL-1、1pg·μL-1、100fg·μL-1、10fg·μL-1橡樹疫霉DNA的紙條出現一條棕色條帶,呈陰性反應;顯色結果表明RPA-側流層析試紙條技術的靈敏度達到100pg·μL-1;RPA檢測時間僅需20min,且不需要PCR儀等昂貴的儀器設備,操作程序簡便,更有利在生產中推廣應用。

實施例5:人工接種杜鵑葉片進行實際樣品實驗檢測

首先采用實施例1的方法快速提取接種樣品的DNA。然后,采用實施例2的方法對提取的DNA進行RPA反應并應用LFD進行擴增產物檢測。結果如圖4所示,當試紙條出現兩條棕色條帶,一條位于質控區內(Control line),一條位于檢測區(Test line),則結果為陽性。圖4中1號為陽性對照,2-5號為橡樹疫霉接種杜鵑葉片5天后提取的DNA樣品,表明接種樣品2-5號中含有橡樹疫霉;當試紙條只有質控區出現一條棕色條帶,檢測區(Test line)沒有條帶,則結果是陰性,健康植株6-7號和陰性對照樣本8號僅有一條帶,不含有橡樹疫霉。再次證明了RPA-LFD側流層析試紙條檢測方法檢測結果準確可靠,有很強的實用性。

除非另外具體說明,否則在這些實施例中闡述的數值并不限制本發明的范圍。在這里示出和描述的所有示例中,除非另有規定,任何具體值應被解釋為僅僅是示例性的,而不是作為限制,因此,示例性實施例的其他示例可以具有不同的值。

最后應說明的是:以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案,而非對其限制;盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明,本領域的普通技術人員應當理解:其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改,或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換;而這些修改或者替換,并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍,其均應涵蓋在本發明的權利要求和說明書的范圍當中。

序列表

<110> 南京林業大學

<120> 重組酶介導等溫擴增-側流層析技術檢測橡樹疫霉的引物和探針組合及其應用

<130> 100

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> RPA-PraRPA-F引物序列(Artificial)

<400> 1

ctcggcattc atgggacttc gcattgaggg ggcg 34

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> RPA-PraRPA-R引物序列(Artificial)

<400> 2

ttacttcagc caatgagaga gcgccacgtc gaag 34

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> PraRPA-P探針序列(Artificial)

<400> 3

cacgccgatt acgccaccaa ggattacgca ctgtcgatta cgcc 44

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