一種新的胃癌標志物circ-EIF4G3的應用的制作方法

文檔序號:18145662發布日期:2019-07-10 11:47
一種新的胃癌標志物circ-EIF4G3的應用的制作方法

本發明涉及腫瘤分子生物學領域,具體為一種新的胃癌標志物circ-EIF4G3的應用。



背景技術:

目前,胃癌仍然在全球癌癥相關死亡排名第三位,是社會的主要健康負擔之一。在中國,胃癌是第二大流行癌癥,也是導致癌癥死亡的第二大原因,2015年估計有679,100新病例和498,000人死亡。雖然手術技術和聯合化療方案有所進步,但在大多數國家,胃癌的5年總生存仍低于30%,因為缺乏胃癌早期診斷標志物。因此,有必要仔細探索胃癌相關分子特征,并開發出合理的胃癌早期檢測方法。

環狀RNA(circRNA)被認為是由線性前體mRNA的非經典剪接產生的,在病毒樣感染性顆粒如類病毒、圓形衛星病毒及丁型肝炎病毒被廣泛發現。環狀RNAs似乎是錯誤的RNA剪接的結果,一直沒發現它的關鍵作用和功能,直到最近才發現并且已經永久地改變了我們對癌癥的觀點,特別是癌變和癌癥進展。迄今為止,在哺乳動物細胞中已經發現了一些內源性的circRNA,并且它們在腫瘤進展中可以高豐度存在以及進化保守性。另外,已經有大量研究證實環狀RNA可能調節轉錄及操控microRNA的通路。有幾種circRNA被認為是造成癌細胞惡性生物學行為的原因。然而,由于我們對于circRNA的理解是有限的,許多可以作為microRNA起作用的circRNA可能還沒有被發現。越來越多的證據表明,circRNA可能在包括胃癌在內的癌癥的發生和發展中起重要作用,并且可能成為癌癥的新生標志物。Zhang J的團隊發現circLARP4在胃癌組織中下調,并且通過擴增miR-424靶向作用于LATS1基因,抑制胃癌細胞的生物學行為,這是胃癌患者總生存的獨立預后因素。

目前,現有技術中,通通過檢測患者血液中CEA/CA199/CA153等腫瘤指標來評估患者的病情,這些指標特異性和靈敏性均較差。



技術實現要素:

為解決上述問題,本發明公開了一種新的胃癌標志物circ-EIF4G3的應用,針對目標人群對胃癌內鏡篩查依從性差,以及臨床上確診的胃癌患者絕大多數都是中晚期的現狀提出,在胃癌癌變進程中找到理想的分子預警信號,有針對性的進行內鏡檢查,病理確診,以減輕病人痛苦,避免過度醫療,節省醫療資源。本發明發現血circ-EIF4G3可作為胃癌患者淋巴結轉移和監測預后的標志物。

為了達到以上目的,本發明供如下技術方案:

本發明公開了一種circ-EIF4G3標志物在制備胃癌診斷試劑中的應用,所述circ-EIF4G3標志物的核苷酸序列為SEQ ID NO.1。

在本發明中,用于胃癌診斷試劑為實時定量PCR試劑。

一種胃癌診斷試劑,包括檢測circ-EIF4G3標志物的試劑,所述試劑包括檢測circ-EIF4G3標志物的引物和/探針。

在本發明中,根據核苷酸序列為SEQ ID NO.1的circ-EIF4G3設計了1對引物用于檢測該序列,引物核苷酸序列為SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

使用GAPDH作為內部對照,GAPDH(F),5'-GCATCCTGGGCTACACTG-3',核苷酸序列為SEQ ID NO.2;GAPDH(R),5'-ACTTCAGGAGCATCTGAAATAGGT-3',核苷酸序列為SEQ ID NO.3。

使用引物對,上游引物:5′-CCTACCCCATCCCCTTATTC-3′,核苷酸序列為SEQ ID NO.4。下游引物,5′-ACCGTGCTGTAGACTGCTGAG-3’,核苷酸序列為SEQ ID NO.5。

一種circ-EIF4G3標志物的檢測方法,包括總RNA提??;將RNA逆轉錄成cDNA;進行qRT-PCR反應。具體為:通過使用TRIzol試劑提取組織中總RNA,并且通過TIANamp Virus RNA試劑盒提取血漿中的總RNA。使用Prime-Script將RNA逆轉錄成cDNA TM一步法RT-PCR試劑盒,甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)用作內部對照。使用引物對,上游引物:5′-CCTACCCCATCCCCTTATTC-3′,核苷酸序列為SEQ ID NO.4。下游引物,5′-ACCGTGCTGTAGACTGCTGAG-3’,核苷酸序列為SEQ ID NO.5。通過qRT-PCR確定circ-CC2D1A表達水平。使用ABI7500系統和SYBR Green PCR Master Mix進行所有qRT-PCR反應。為了準確驗證GC組織中circ-CC2D1A表達的倍數變化,將計算的Ct值相對于從相同樣品擴增的GAPDH(ΔCt=Cttested-CtGAPDH)標準化,并且使用-ΔCt方法來估計變化的價值。每個樣本重復三次,所有反應獨立重復三次以確保所有數據的可重復性。circ-EIF4G3的Cutoff值為-7.374,當檢測出的-ΔCt大于這個值時為胃癌,其特異性為81.25%,敏感性為60.94%。

本發明還公開了一種用于胃癌診斷的實時定量PCR檢測試劑盒,包括根據核苷酸序列為SEQ ID NO.1的circ-EIF4G3分子標志物設計并合成出特異性用于實時定量PCR的檢測引物。

在本發明中,進一步的,所述特異性引物包括SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引物。

本發明還公開了一種用于胃癌診斷的分子標志物,所述分子標志物為核苷酸序列為SEQ ID NO.1的circ-EIF4G3分子標志物。

用于檢測circ-EIF4G3分子標志物的特異性引物,所述特異性引物包括SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引物。

本發明具有如下優點:

(1)提出了circ-EIF4G3的用途。(2)環狀RNA具有機構穩定、豐度度和組織特異性表達等特征。且circ-EIF4G3在胃癌與癌旁組織中表達量存在差異,并且與分期相關,因此circ-EIF4G3具有成為胃癌生物標志物的應用前景。

本發明是針對目標人群對胃癌內鏡篩查依從性差,以及臨床上確診的胃癌患者絕大多數都是中晚期的現狀提出,希望能在胃癌癌變進程中找到理想的分子預警信號,有針對性的進行內鏡檢查,病理確診,以減輕病人痛苦,避免過度醫療,節省醫療資源。本發明發現血circ-EIF4G3可作為胃癌患者診斷和監測預后的標志物。

附圖說明

圖1,用RNase R處理的GC細胞中circ-EIF4G3和EIF4G3mRNA的豐度;

圖2,用放線菌素處理的GC細胞中circ-EIF4G3和EIF4G3mRNA的豐度;

圖3,circ-EIF4G3表達水平的表達顯著高于GC患者相鄰非癌組織的表達水平;

圖4,ROC曲線已用于評估circ-EIF4G3潛在診斷價值,ROC曲線下面積(AUC)為0.7158;

圖5,根據circ-EIF4G3水平的Kaplan-Meier總生存曲線。

圖中:高表達患者的生存時間縮短,***P<0.0001。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式,進一步闡明本發明,應理解下述具體實施方式僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。

本發明公開了一種新的胃癌標志物circ-EIF4G3的應用,circ-EIF4G3分子標志物的核苷酸序列為SEQ ID NO.1,CCCTACCCCATCCCCTTATTCAGCACATGAAATAAACAAGGGGCATCCAAATCTTGCGGCAACGCCCCCGGGACATGCATCGTCCCCTGGACTCTCTCAA AATTCCTAGAGGACCTGTGCAACAACCTCTTGAGGATCGAATCTTCACTCCCGCTGTCTCAGCAGTCTACAGCACGGTAACACAAGTGGCAAGACAGCCG。

所述circ-EIF4G3作為胃癌診斷和預后的標志物。以下實驗方法為具體實施例,實驗結果如圖1至圖5所示。

實施例1

1.RNase R消化和放線菌素-D消化

將2mg總RNA在37℃下溫育20分鐘,加入或不加入3U/mg RNase R,隨后使用RNeasy MinElute試劑盒。對于放線菌素D處理,將2mg總RNA在37℃下與或不加入1mg放線菌素(放線菌素D,Sigma,成都最好的試劑公司)一起溫育,并且在0,6,12,18小時分別檢測所得RNA。

2.患者及病例篩選

從GC患者中共收集到64個GC組織和相應的相鄰非腫瘤組織樣品,所有組織樣品均來自南京醫科大學附屬南京醫院普外科(2011年1月至2017年12月期間)。所有入組患者在術前均行放療和化療,并將他們的組織樣本立即儲存在RNA固定試劑中,并立即放入-80℃冰箱中保存。配對的相鄰非腫瘤組織需通過病理分析沒有腫瘤細胞,并且定位在距離瘤體邊緣5cm處。根據國際抗癌聯盟的腫瘤-淋巴結轉移(TNM)分期系統,所有腫瘤均準確分期。每位患者均簽署書面知情同意書,當地醫療道德委員會批準了該研究方案。

3.臨床組織樣本取樣

(1)準備事項:

液氮罐(檢查液氮容積,事先及時充裝液氮)、冰盒、冰生理鹽水、無菌無酶凍存管(分裝好RNA保護液并編號備用)、消毒手套(不含滑石粉)、口罩、帽子、鑷子、剪刀、低溫記號筆等。

(2)操作流程:

A.確定在患者術前已留取其血液樣本,并按照血液樣本提取流程處理,后將提取的血清移入Greiner凍存管中并以紅色低溫記號筆標記編號,保存于低溫冰箱,并記錄于病例資料表及其電子版本中。

B.預先填寫組織標本病例資料表(記錄有效的聯系方式以便于隨訪),注意填寫內容的完整性。預先確定留取癌與癌旁組織的凍存管的編號,并將其編號記錄于病例資料表中。

C.組織離體后立即置于彎盤中,迅速用冰鹽水沖淋(低溫可暫時抑制RNA酶活性以爭取取樣時間;洗滌組織樣本中混雜的血液,減少污染;維持組織樣本的滲透性以利于RNA保護液迅速滲透并發揮抑酶作用)。

D.選取胃粘膜組織并將其分解成約黃豆大小的小塊分裝,注意取樣順序:取2~4塊癌旁正常組織和2~4塊腫瘤組織,厚度不超過5mm,先取正常組織,再取腫瘤組織,一根凍存管僅適宜存放一塊樣本,勿混淆腫瘤與瘤旁正常組織的凍存管編號。

E.取樣完成后擰緊凍存管(如未旋緊瓶蓋液氮滲入凍存管中,常溫狀態下取出凍存管時易引發凍存管爆裂),輕柔倒置并搖晃凍存管,使組織與保護液混勻,后迅速置于液氮罐中。

F.檢查組織標本病例資料表填寫是否完善,在《冰箱標本定位表》中預先確定并錄入樣本在深低溫冰箱中的存儲位置,及時將液氮罐中的樣本移入深低溫冰箱。避免因疏忽遺忘,導致液氮揮發殆盡后樣本浪費不可用。

G.術后一周追蹤病理報告結果,并及時錄入病例資料表中,確定樣本是否能夠入組研究。

4.RNA的提取、反轉錄和實時定量PCR

通過使用TRIzol試劑提取組織中總RNA,并且根據制造商的說明書通過TIANamp Virus RNA試劑盒提取血漿中的總RNA。使用Prime-Script將RNA逆轉錄成cDNA TM一步法RT-PCR試劑盒,甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)用作內部對照。使用引物對,上游引物:5′-CCTACCCCATCCCCTTATTC-3′,核苷酸序列為SEQ ID NO.4。下游引物,5′-ACCGTGCTGTAGACTGCTGAG-3’,核苷酸序列為SEQ ID NO.5。使用ABI7500系統和SYBR Green PCR Master Mix進行所有qRT-PCR反應。為了準確驗證GC組織中circ-CC2D1A表達的倍數變化,將計算的Ct值相對于從相同樣品擴增的GAPDH(ΔCt=Cttested-CtGAPDH)標準化,并且使用-ΔCt方法來估計變化的價值。每個樣本重復三次,所有反應獨立重復三次以確保所有數據的可重復性。circ-EIF4G3的Cutoff值為-7.374,當檢測出的-ΔCt大于這個值時為胃癌,其特異性為81.25%,敏感性為60.94%。

實驗操作步驟:

(1)Trizol提取組織RNA:

A.戴口罩及手套,打開4℃低溫離心機,設置好溫度備用。計算所需提取的樣本數,準備雙份數量的1.5ml無菌無酶EP管,置于EP管架上備用。

B.研磨器皿中倒入適量液氮預冷,取50-100mg組織置入液氮中,研磨組織至粉末狀。

C.加入1ml Trizol到研磨器皿中,繼續研磨凝固狀的組織與Trizol的混合物。

D.靜置待其液化,轉移至Rnase free 1.5ml EP管中。

E.室溫下靜置5min,每1ml Trizol加入200ul氯仿。

F.劇烈震蕩15s,室溫下靜置2-3min。

G.4℃,12000g-14000g,離心15min。

H.轉移水相至新的Rnase free 1.5ml EP中,每1ml Trizol加入500ul異丙醇,室溫放置10min。

I.4℃,12000g,離心10min。預配清洗RNA的75%乙醇(需用DEPC水配制)。

J.小心棄去上清,每管加入至少1ml 75%乙醇洗滌RNA沉淀,渦旋混合。

K.4℃,7500-10000g,離心5-10min。小心棄去上清。

L.風干RNA沉淀(風干后RNA為無色),使用DEPC-水溶解沉淀(依據沉淀大小加入10-80ul左右),用槍頭吸打吹勻。

(2)Trizol提取細胞RNA:

A.待提取細胞用PBS清洗兩遍。

B.加入適量Trizol到培養器皿中(小瓶/六孔板每孔1ml,大皿3ml,大瓶5ml)。

C.反復吹打幾次,轉移至Rnase free 1.5ml EP管中。

D.室溫下靜置5min,每1ml Trizol加入200ul氯仿。

E.劇烈晃動15s,室溫下靜置2-3min。

F.4℃,12000-14000g,離心15min。

G.轉移水相至新的Rnase free 1.5ml EP中,每1ml Trizol加入500ul異丙醇,室溫放置10min。

H.4℃,12000g,離心10min。

I.棄去上清,加入至少1ml 75%乙醇洗滌RNA沉淀,渦旋混合。

J.4℃,7500-10000g,離心5-10min。

K.風干RNA沉淀,使用DEPC-水溶解沉淀(依據沉淀大小加入10-80ul左右)。

(3)檢測所提取的樣本RNA濃度:

A.按照1%濃度在新的Rnase free200ul EP管中配置每個待測樣本(每個待檢測樣本1ul+99ulDEPC水)。

B.打開紫外分光光度計,清洗比色皿,取100ulDEPC水設置空白對照。

C.依次注入待測樣本檢測并記錄樣本濃度、OD260/280比值。

(4)RNA逆轉錄:

A.從-20℃冰箱中取出逆轉錄試劑盒,將2種酶插入冰盒冰中,其它試劑冰上融化,RNase Free水常溫融化備用。

B.根據所測RNA濃度,計算逆轉錄每管所需RNA體積,并同時計算出DEPC水體積。

C.取PCR管架置于冰上,按需要放入無菌無酶200ul PCR管并按編號標記。移液器吸取適量RNA后,將槍頭垂直插入PCR管底,勻速輕柔打出液體。

D.移液器吸取適量DEPC水,槍頭貼著后壁打入PCR管內。

E.逆轉錄Step1:每管加入gDNA Eraser 1ul及5x gDNA Eraser Buffer 2ul。

F.置于八聯管離心機上,輕輕彈掉管底或管壁氣泡,短時離心。

G.RT-PCR儀上42℃2分鐘,反應后產物置于冰上備用。

H.逆轉錄Step2:取1.5ml EP管,按照以下配方,配置每管反應Mix

設定反應條件:37℃,15min;85℃,5sec;4℃維持。

I.扣緊管蓋,將其從管架上取下來,置于離心管架上,有氣泡者可輕彈管底,短時離

心,確認每管的液平一致且管內無氣泡后,復置于冰上。

J.設置反應條件:37℃,15min;85℃,5sec;4℃維持。上機操作,15-20min后將cDNA置于-20℃保存。

(5)qRT-PCR步驟:

A.準備好冰盒,從-20℃冰箱中取出待測樣本的cDNA、引物、PCR試劑,冰上解凍。

B.備好八聯管及管蓋、八聯管架、鑷子、無菌1.5ml EP管、EP管架、適宜量程的移液器、無菌薄膜手套。

C.將解凍好的cDNA、引物、PCR試劑先依次短時振蕩離心,冰上靜置備用。

D.依據檢測樣本及指標數量,劃分不同目的基因加樣區域。將八聯管架置于冰上,用鑷子夾取八聯管并將其鋪置于八聯管架上。

E.取1.5ml EP管,按以下每孔19ul配制八聯管PCR Mix,并震蕩離心。

F.按預設好每個樣本及復孔在八聯管的位置,依次加入樣本的1ul cDNA及19ul PCR Mix。

G.離心去氣泡,上機操作,設置反應條件。

(6)qRT-PCR反應體系:

qRT-PCR反應條件:

6、數據分析:

實驗結果如圖1-圖5所示,如表1、表2所示,采用t檢驗和卡方檢驗及生存分析的方法circ-EIF4G3與胃癌患者臨床分期資料及預后的相關性。進行受試者工作特征(ROC)曲線來評估其診斷價值。所有統計分析均使用SPSS for Windows v.17.0進行。對于所有結果,P<0.05被認為有統計學意義。

表1.circ-EIF4G3的表達與分期及淋巴結轉移相關

Table 1.Clinicopathological characteristics and expression of circ-EIF4G3

*P<0.05

表2.綜合生存的單變量和多變量分析

Table 2.Univariate and multivariate analysis for overall survival

*P<0.05

本發明方案所公開的技術手段不僅限于上述實施方式所公開的技術手段,還包括由以上技術特征任意組合所組成的技術方案。應當指出,對于本技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明原理的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也視為本發明的保護范圍。

序列表

<110> 江蘇萬成生物醫學研究院有限公司

<120> 一種新的胃癌標志物circ-EIF4G3的應用

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<212> DNA

<213> 1(human)

<400> 1

ccctacccca tccccttatt cagcacatga aataaacaag gggcatccaa atcttgcggc 60

aacgcccccg ggacatgcat cgtcccctgg actctctcaa aattcctaga ggacctgtgc 120

aacaacctct tgaggatcga atcttcactc ccgctgtctc agcagtctac agcacggtaa 180

cacaagtggc aagacagccg 200

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 2(人工序列)

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gcatcctggg ctacactg 18

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<211> 24

<212> DNA

<213> 3(人工序列)

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acttcaggag catctgaaat aggt 24

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cctaccccat ccccttattc 20

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accgtgctgt agactgctga g 21

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