用于檢測致病鮑特桿菌的寡核苷酸組合、方法及試劑盒與流程

文檔序號:18145671發布日期:2019-07-10 11:47
用于檢測致病鮑特桿菌的寡核苷酸組合、方法及試劑盒與流程
本發明屬于分子學生物檢測領域,更具體的,屬于鮑特桿菌鑒定領域。
背景技術
:鮑特桿菌為革蘭陰性球桿菌,無芽胞,某些菌株有鞭毛,光滑型菌株有莢膜,是專性需氧型細菌,最適生長溫度為35~37℃,最適pH6.8~7.0,營養要求比較高。鮑特桿菌包括7個菌種,分別為百日咳鮑特桿菌(B.pertussis)、副百日咳鮑特桿菌(B.parapertussis)、支氣管敗血鮑特桿菌(B.branchiseptica)、鳥鮑特桿菌(B.avium)、欣氏鮑特桿菌(B.hinzii)、霍氏鮑特桿菌(B.holmesii)和創口鮑特桿菌(B.trematum)。百日咳鮑特桿菌能引起的一種嚴重急性呼吸道傳染病百日咳(pertussis),傳染性較強,人群普遍易感,其中尤以嬰幼兒多見,是嚴重威脅人類健康的主要傳染病之一;副百日咳鮑特桿菌是與百日咳鮑特桿菌引起的癥狀類似,只是相對較輕;霍氏鮑特桿菌是一種能夠引起敗血癥、心肌炎、呼吸道疾病,尤其對于免疫缺陷的患者更易感染(例如:免疫功能不全者、艾滋病患者)。而支氣管敗血鮑特桿菌在一般情況下感染動物,但少數情況也能感染人,感染之后引起敗血癥、腦膜炎、肺炎等,而其易與其它細菌感染的癥狀混淆,因此,臨床上容易遺漏支氣管敗血鮑特桿菌的檢測。目前,主要利用細菌學、血清學檢測以及PCR技術來對鮑特桿菌進行檢測。細菌學檢測實驗周期太長,靈敏度低,只有15%~30%,方法也不易標準化;因此,其僅適合病程早期的診斷,遠不能滿足臨床需要。血清學檢測靈敏度不高,存在一定的假陽性且操作比較繁瑣,對操作人員要求較高。PCR檢測,特別是熒光定量PCR檢測是近年來發展迅速的一種核酸檢測技術,其特異性好,靈敏度高,且實驗周期短。中國專利公開CN109153699A披露了一種檢測鮑特桿菌的方法,通過三對引物實現了對百日咳鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌和霍氏鮑特桿菌的檢測。由于需要使用三對引物,檢測的操作更加復雜且不可避免地增加了檢測成本。另外,美國專利公開US2010/0221715A1也披露了一種檢測鮑特桿菌的組合物,其包括兩對引物,能夠檢測百日咳鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌和霍氏鮑特桿菌,但無法檢測出其他鮑特桿菌,如支氣管敗血鮑特桿菌,的存在。因此,現有技術存在對用盡量少的引物檢測盡量多的鮑特桿菌的高靈敏度試劑的強烈需求。技術實現要素:有鑒于此,在第一方面,本發明提供了一種寡核苷酸組合在制備檢測鮑特桿菌的試劑盒中的用途,所述鮑特桿菌為選自百日咳鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌、霍氏鮑特桿菌和支氣管敗血鮑特桿菌中的一種或更多種,所述寡核苷酸組合包括:第一上游引物、第一下游引物、第一探針、第二上游引物、第二下游引物、和第二探針。在一個實施方式中,第一上游引物具有SEQIDNO:1所示的序列,第一下游引物具有SEQIDNO:2所示的序列,第一探針具有SEQIDNO:3所示的序列,第二上游引物具有SEQIDNO:4所示的序列,第二下游引物具有SEQIDNO:5所示的序列,第二探針具有SEQIDNO:6所示的序列。在另一個實施方式中,第一上游引物具有SEQIDNO:10所示的序列,第一下游引物具有SEQIDNO:11所示的序列,第一探針具有SEQIDNO:12所示的序列,第二上游引物具有SEQIDNO:4所示的序列,第二下游引物具有SEQIDNO:13所示的序列,第二探針具有SEQIDNO:6所示的序列。使用該寡核苷酸組合,可以同時檢測出樣品中所存在的百日咳鮑特桿菌、支氣管敗血鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌、霍氏鮑特桿菌中的一種或更多種,從而判斷受試者是否感染有百日咳鮑特桿菌、支氣管敗血鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌或霍氏鮑特桿菌,以及是否存在復合感染。百日咳鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌與支氣管敗血鮑特桿菌是公認的鮑特菌屬中被認為對人類有較大危害的3種菌;另外,近期發表的文獻表明:霍氏鮑特菌會造成與百日咳鮑特菌相似的癥狀。因此,如果能同時對上述4種鮑特桿菌進行檢測,則覆蓋范圍將更廣,不容易造成漏檢;同時還意味著全面地檢測了感染人類的常見鮑特桿菌。另一方面,本發明的用于檢測的寡核苷酸組合可以僅包括兩套引物和探針組,因而操作更加容易并節約了成本。在優選的實施方式中,所述本發明中的寡核苷酸組合還包括:用作內標檢測的寡核苷酸組合。具體地,用作內標檢測的寡核苷酸組合可包括內標上游引物、內標下游引物和內標探針。在一個實施方式中,內標上游引物具有SEQIDNO:7所示的序列,內標下游引物具有SEQIDNO:8所示的序列,內標探針具有SEQIDNO:9所示的序列。在另一個實施方式中,內標上游引物具有SEQIDNO:14所示的序列,內標下游引物具有SEQIDNO:15所示的序列,內標探針具有SEQIDNO:16所示的序列。也就是說,本發明的寡核苷酸組合可進一步包括內標引物以及內標探針。其可與本發明的寡核苷酸組合中的其它引物和探針聯用且互不影響。內標引物和探針的使用能夠判斷本次檢測是否有效,進一步確保所述寡核苷酸組合的檢測準確性。在本發明中,寡核苷酸組合可攜帶有用于實時熒光PCR檢測的熒光報告基團和淬滅基團。在一些實施方式中,本發明的寡核苷酸組合中第一探針和第二探針上的熒光報告基團可互不干涉地選自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE。優選地,第一探針和第二探針的熒光報告基團為FAM,內標探針的熒光報告基團為HEX。在一些實施方式中,本發明的寡核苷酸組合中第一探針和第二探針上的熒光猝滅基團可互不干涉地選自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB-λ、Dabcyl-λ、TAMRA。優選地,第一探針、第二探針和內標探針的熒光猝滅基團為BHQ1。在第二方面,本發明還提供了一種寡核苷酸組合,其包括:第一上游引物:5’-TGGTGCGCTACGAGCATCA-3’(SEQIDNO:1),第一下游引物:5’-GGATGTCGGTGAAGGCCAC-3’(SEQIDNO:2),第一探針:5’-ACCGACGCGATACCGTTGAGGGG-3’(SEQIDNO:3),第二上游引物:5’-CCGCTGCTGACGGTCTATGT-3’(SEQIDNO:4),第二下游引物:5’-GCAAGACAAGCCTGGAACCAC-3’(SEQIDNO:5),和第二探針:5’-CTGCGTGACGAACTCAAACGGCTCT-3’(SEQIDNO:6);或者,第一上游引物:5’-CTGCTGCACATCGACATCAAGA-3’(SEQIDNO:10),第一下游引物:5’-CAACGGTATCGCGTCGGTT-3’(SEQIDNO:11),第一探針:5’-CTGGGACGTATCCAGCGCCCT-3’(SEQIDNO:12),第二上游引物:5’-CCGCTGCTGACGGTCTATGT-3’(SEQIDNO:4),第二下游引物:5’-CCGCTTGATGACCTTGATAGTG-3’(SEQIDNO:13),和第二探針:5’-CTGCGTGACGAACTCAAACGGCTCT-3’(SEQIDNO:6)。在優選的實施方式中,所述寡核苷酸組合還包括:內標上游引物:5’-GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT-3’(SEQIDNO:7),內標下游引物:5’-CCCATAACAGCATCAGGAGTG-3’(SEQIDNO:8),和內標探針:5’-CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC-3’(SEQIDNO:9);或者,內標上游引物:5’-GTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’(SEQIDNO:14),內標下游引物:5’-TCCATTGATGACAAGCTTCC-3’(SEQIDNO:15),和內標探針:5’-CACCAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGT-3’(SEQIDNO:16)。在第三方面,本發明提供了一種試劑盒,所述試劑盒包括如上所述的寡核苷酸組合。進一步地,所述試劑盒還包括提取DNA所需試劑,用于實時熒光PCR擴增的其他試劑,如Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶、PCR緩沖液等中的至少一種。第四方面,本發明還提供了上述試劑盒在檢測鮑特桿菌中的用途。在一個實施方式中,所述鮑特桿菌為選自百日咳鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌、霍氏鮑特桿菌和支氣管敗血鮑特桿菌中的一種或更多種。在第五方面,本發明提供了用于檢測鮑特桿菌的方法,所述方法包括以下步驟:1)提取待測樣品的DNA;2)使用上述本發明的寡核苷酸組合或試劑盒對步驟1)獲得的DNA進行熒光定量PCR檢測;3)分析結果。在本發明中,用于檢測樣品可以是呼吸道鼻咽拭子樣品、咽拭子、痰液樣品、肺泡灌洗液等,但不限于此。在一個具體地實施方式中,所述步驟3)中,采用Ct值作為判定標準。對于檢測通道Ct值≤38且內標通道為陽性(Ct值≤40)的樣品,報告為百日咳鮑特桿菌、支氣管敗血鮑特桿菌、霍氏鮑特桿菌和副百日咳鮑特桿菌中一種病菌或更多種細菌感染。在具體的實施方式中,所述步驟2)中的寡核苷酸組合具有如下濃度:0.1-1μM的第一上游引物、第一下游引物、第一探針、第二上游引物、第二下游引物和第二探針;0.1-0.5μM的內標引物;0.02-0.2μM的內標探針。優選的,所述步驟2)中的寡核苷酸組合具有如下濃度:0.5μM的第一上游引物、第一下游引物、第一探針、第二上游引物、第二下游引物和第二探針;0.25μM的內標引物;0.1μM的內標探針。進一步地,所述步驟2)中還包括以下組分和濃度:在具體的實施方式中,步驟2)中的熒光定量PCR反應如下所示:本發明的有益效果在于:僅用兩個引物和探針的組合就能夠同時檢測百日咳鮑特桿菌、支氣管敗血鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌、霍氏鮑特桿菌四種菌,其操作更方便,成本更低;于此同時,本發明靈敏度高、且不與非靶標菌的核酸發生交叉反應。除此之外,疑似鮑特桿菌感染者通常會有咳嗽,白細胞升高的癥狀,因此常常在檢測之前就接受了抗生素治療,而本發明的寡核苷酸組合不受樣品中抗生素的影響,能夠準確地進行檢測。附圖說明圖1為使用表1中的寡核苷酸組合擴增待測樣品的結果;圖2為檢測結果為陽性的樣品的序列比對圖;圖3為使用表1中的寡核苷酸組合擴增樣品的靈敏度結果;圖4為使用表1中的寡核苷酸組合擴增樣品的特異性結果;圖5為使用表1中的寡核苷酸組合的抗干擾實驗對照圖(無干擾物添加);圖6為使用表1中的寡核苷酸組合的抗干擾實驗圖(添加干擾物);圖7為使用表9中的一部分寡核苷酸代替表1中的寡核苷酸的對照實驗結果;圖8為使用表2中的寡核苷酸組合擴增待測樣品的結果;圖9為使用表2中的寡核苷酸組合擴增樣品的特異性結果;圖10為使用表2中的寡核苷酸組合擴增樣品的靈敏度結果;圖11為使用表2中的寡核苷酸組合的抗干擾實驗圖(添加干擾物);圖12為使用表2中的寡核苷酸組合的抗干擾實驗對照圖(無干擾物添加)。具體實施方式下文將結合具體實施方式和實施例,具體闡述本發明,本發明的優點和各種效果將由此更加清楚地呈現。本領域技術人員應理解,這些具體實施方式和實施例是用于說明本發明,而非限制本發明。實施例1、本發明所使用的引物及探針針對百日咳鮑特桿菌、支氣管敗血鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌和霍氏鮑特桿菌的特異基因序列(重復插入序列IS481與IS1001)設計引物和熒光探針,引物和探針的具體序列如下表1和表2所示。表1表2其中,F和R為擴增引物的正向和反向引物對,IC-F和IC-R為內標引物對,P為檢測探針。實施例2、檢測過程1、試劑準備:1.1、取出試劑盒中的各組分,室溫放置,待其溫度平衡至室溫,混勻后備用;1.2、根據待測樣品、陰性對照、陽性對照、定量參考品的數量,按比例(PCR反應液38μL/人份+酶混合液2μL/人份)取相應量的PCR反應液、酶混合液,充分混勻成PCR混合液,2000rpm離心10秒,4℃避光待用。2、樣品、質控品、定量參考品處理與加樣(在樣品處理區進行)2.1、樣品、質控品預處理2.1.1、待測樣品:往樣品收集管中加入1ml無菌生理鹽水,充分振蕩混勻,然后把全部液體(樣品洗脫液)倒入1.5ml滅菌離心管中(棉拭子靠離心管壁擠干后丟棄),瞬時離心后吸取20~50μl至另一1.5ml滅菌離心管中,加入20~50μl核酸釋放劑,充分混勻后作為待測樣品備用。2.1.2、陰性對照、陽性對照分別取20~50μl與20~50μl核酸釋放劑混勻待用。2.2、加樣(陰性對照、陽性對照與待測樣品同步處理)2.2.1、每個PCR反應管中加入上述處理后的待測樣品、陰性對照、陽性對照各4~10μl。2.2.2、室溫靜置10分鐘,各待測樣品、陰性對照、陽性對照、定量參考品的反應管中分別加入40μl上述已配制好的PCR-mix。3、熒光PCR反應(在熒光定量PCR擴增儀上進行)1)將PCR反應管放入擴增儀樣品槽,按對應順序設置待測樣品名稱及定量參考品濃度。2)熒光檢測通道選擇:選擇FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)檢測檢測百日咳鮑特桿菌、支氣管敗血鮑特桿菌、霍氏鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌DNA;選擇HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)檢測內標;參比熒光(PassiveReference)設置為ROX。3)熒光定量PCR反應條件為:實施例3、實驗結果分析PCR擴增反應結束后,儀器自動保存結果,實驗一共測試了24個樣品,其中有14個樣品呈陽性,使用表1中所示的引物擴增的實驗結果如圖1所示,使用表2中所示的引物擴增的實驗結果如圖8所示。為了驗證結果的準確性,將陽性樣品送去測序,測序最終得到14條序列的測序結果均為陽性,與本發明檢測方法檢測的陽性結果一致,而測序結果如圖2所示(其中,第一條為參比序列,后十四條為陽性樣品的測序結果),可以看出所有檢測呈陽性的樣品,其測序結果均為陽性,而檢測呈陰性的樣品,測序結果也表明為陰性??梢岳脙x器自帶的軟件進行自動分析(也可以手動調節基線的開始值、結束值以及閾值線值進行分析),然后記錄樣品Ct值和定值結果。擴增曲線與閾值線的交點,稱為Ct(即cyclethreshold,指PCR反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數值);對于測定通道FAMCt值≤38的樣品,報告為百日咳鮑特桿菌、支氣管敗血鮑特桿菌、霍氏鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌中一種病菌或多種細菌感染;對于測定通道FAMCt值>38或無顯示同時,內標檢測為陽性(Ct值≤40),報告為鮑特桿菌DNA陰性。若內標Ct值>38或無顯示,則該樣品的檢測結果無效,應查找并排除原因,并對此樣品進行重復試驗。對于測定Ct值>38的樣品,同時,內標檢測為陽性(Ct值≤40),報告為低于檢測下限。若內標Ct值>40或無顯示,則該樣品的檢測結果無效,應查找并排除原因,并對此樣品進行重復試驗。并且每次實驗應滿足如下質量控制中的要求,實驗結果才可靠。質量控制:1)陰性對照:FAM檢測通道無熒光信號增長,且無明顯S型擴增曲線;2)陽性對照:FAM、HEX檢測通道有明顯S型擴增曲線,且檢測Ct值小于35;3)以上要求需在同一次實驗中同時滿足,否則,本次實驗無效,需重新進行。實施例4、靈敏度檢測及分析選取上述實施例3中檢測為陽性的9個樣品DNA,分別將其稀釋至100、200、400、4000、40000拷貝/mL,每個梯度取5μL作為擴增模板,使用實施例1中表1所述的寡核苷酸組合按照如實施例2所述進行擴增并再進行檢測,每個梯度進行三批次的實驗,結果如表3-1所示,并對400拷貝/mL重復檢測20次,驗證本試劑盒的最低檢測限如圖3所示;表2所述的寡核苷酸組合按照如實施例2所述進行擴增并再進行檢測,每個梯度進行三批次的實驗,結果如表3-2所示,并對400拷貝/mL重復檢測20次,驗證本試劑盒的最低檢測限結果如圖9所示。結果表明本發明的方法靈敏度高,檢測濃度可低至400拷貝/mL。表3-1濃度(拷貝/mL)三批次檢出情況檢出率4.00E+049/9100%4.00E+039/9100%4.00E+029/9100%2.00E+023/933.33%1.00E+024/944.44%表3-2濃度(拷貝/mL)三批次檢出情況檢出率4.00E+049/9100%4.00E+039/9100%4.00E+029/9100%2.00E+024/944.44%1.00E+022/922.22%實施例5、特異性檢測及分析選取呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體的DNA為模板,采用實施例1的表1和表2的寡核苷酸組合,按照如實施例3所示的擴增過程對選取的DNA分別進行擴增,并再進行檢測,結果如圖4和圖10所示,采用實施例1的寡核苷酸組合并不能擴增出條帶,證明實施例1的寡核苷酸組合能特異性的擴增出對應的分枝桿菌。實施例6、抗生素干擾檢測在樣品中加入如下表4所示濃度的阿奇霉素、青霉素鈉、克拉霉素、鹽酸頭孢甲肟、紅霉素、復方磺胺甲噁唑片,再使用實施例1中表1所述的寡核苷酸組合進行擴增檢測,其結果如表6和圖6所示,同時將沒有加入上述藥物的同樣的樣品在同樣的條件下進行擴增檢測,以用于比較,其結果如表5和圖5所示,實驗結果表明擴增曲線和Ct值兩者均無顯著差別,表明上述藥品不能對本發明的寡核苷酸組合造成影響。表4編號干擾物質濃度1阿奇霉素50mg/L2青霉素鈉250mg/L3克拉霉素40μg/mL4鹽酸頭孢甲肟250mg/L5紅霉素40μg/mL6復方磺胺甲噁唑片250mg/L試劑在同一臺儀器對對照樣品進行檢測,重復檢測24次,統計檢測結果Ct值,計算95%置信區間(Mean±1.96SD),檢測結果統計如下表5所示:表5、無添加干擾物質樣品檢測結果使用同一臺SLAN96P儀器上對干擾樣品進行檢測,每個樣品重復檢測3次,統計平均值,計算與對照樣品的Ct值差值,檢測結果統計如下表6所示:表6在樣品中加入如上述表4所示濃度的阿奇霉素、青霉素鈉、克拉霉素、鹽酸頭孢甲肟、紅霉素、復方磺胺甲噁唑片,再使用實施例1中表2所述的寡核苷酸組合進行擴增檢測,其結果如表8和圖11所示,同時將沒有加入上述藥物的同樣的樣品在同樣的條件下進行擴增檢測,以用于比較,其結果如表7和圖12所示,實驗結果表明擴增曲線和Ct值兩者均無顯著差別,表明上述藥品不能對本發明的寡核苷酸組合造成影響。試劑在同一臺儀器對對照樣品進行檢測,重復檢測24次,統計檢測結果Ct值,計算95%置信區間(Mean±1.96SD),檢測結果統計如下表7所示:表7、無添加干擾物質樣品檢測結果使用同一臺ABI7500儀器上對干擾樣品進行檢測,每個樣品重復檢測3次,統計平均值,計算與對照樣品的Ct值差值,檢測結果統計如下表8所示:表8對比例1實際上,為了同時實現對百日咳鮑特桿菌、支氣管敗血鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌和霍氏鮑特桿菌四種鮑特桿菌的有效檢測,在本發明的研發過程中設計了大量的引物和探針,表9示例性地列出了其中的一部分。表9引物或探針序列(5'→3')IS481-F3(SEQIDNO:17)ATGCCCGATTGACCTTCCTIS481-R3(SEQIDNO:18)AGCGGCCCAGCCATTTIS481-P3(SEQIDNO:19)CGTCGACTCGAAATGGTCCAGCAIS481-F4(SEQIDNO:20)GCCATGAGCTGGGCATCAIS481-R4(SEQIDNO:21)GGCATCGGCTCGGTGTTIS481-P4(SEQIDNO:22)CACCGCTTTACCCGACCTTACCGIS481-F5(SEQIDNO:23)GGCATCAAGCACCGCTTTACIS481-R5(SEQIDNO:24)GGCTCGGTGTTGGGAGTTCTIS481-P5(SEQIDNO:25)CGACCTTACCGCCCACAGACCAAIS1001-F3(SEQIDNO:4)CCGCTGCTGACGGTCTATGTIS1001-R3(SEQIDNO:26)GTGGTTCCAGGCTTGTCTTGCIS1001-F4(SEQIDNO:4)CCGCTGCTGACGGTCTATGTIS1001-R4(SEQIDNO:27)CGGCTATTCCGCTTTGCTIS1001-F5(SEQIDNO:28)GCGGAGATCGTCTATGACTTGTTIS1001-R5(SEQIDNO:26)GTGGTTCCAGGCTTGTCTTGC這些引物和探針中采用了與實施例1類似的設計思路。但上述表9中的引物替換表1和2中的一部分引物之后效果卻并不理想,出現了漏檢、靈敏度不高、曲線不好等問題。例如,如圖7所示,一共8個陽性樣品,使用上述表9中的IS481-F3/R3/P3、IS1001-F3/R3引物替換表1或2中的相應引物之后,僅能檢測出5個陽性樣品。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式,其描述較為具體和詳細,但并不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是,對于本領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明構思的前提下,還可以做出若干變形和改進,這些都屬于本發明的保護范圍。因此,本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。SEQUENCELISTING<110>湖南圣湘生物科技有限公司<120>用于檢測致病鮑特桿菌的寡核苷酸組合、方法及試劑盒<160>28<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1tggtgcgctacgagcatca19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2ggatgtcggtgaaggccac19<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3accgacgcgataccgttgagggg23<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4ccgctgctgacggtctatgt20<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5gcaagacaagcctggaaccac21<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>6ctgcgtgacgaactcaaacggctct25<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>7gactctctctgcctattggtctatt25<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>8cccataacagcatcaggagtg21<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>9cagatccccaaaggactcaaagaacc26<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>10ctgctgcacatcgacatcaaga22<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>11caacggtatcgcgtcggtt19<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12ctgggacgtatccagcgccct21<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>13ccgcttgatgaccttgatagtg22<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14gtcaacggatttggtcgtat20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15tccattgatgacaagcttcc20<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>16caccagggctgcttttaactctggtaaagt30<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>17atgcccgattgaccttcct19<210>18<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>18agcggcccagccattt16<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>19cgtcgactcgaaatggtccagca23<210>20<211>18<21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再多了解一些
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