芝麻節間長度基因Sidwf1及其SNP標記的制作方法

文檔序號:18167253發布日期:2019-07-13 09:42
芝麻節間長度基因Sidwf1及其SNP標記的制作方法

本發明屬于芝麻分子遺傳育種技術領域,具體涉及一個控制芝麻節間長度的基因Sidwf1及其SNP標記。



背景技術:

芝麻(Sesame indicum L., 2n=26)是優質特色油料作物,在食品加工中具有重要地位。世界芝麻年種植面積約為800萬公頃,年產量約450萬噸。印度、蘇丹、緬甸和中國是世界芝麻主產國。我國年種植芝麻約為53萬公頃,居世界第四位;平均單產為1182公斤/公頃,世界第一位;平均總產量為62萬噸,世界第三位(2003-2012,FAO數據)。芝麻屬于高桿作物,現有品種多為植株高大、單桿型,不適宜高密度種植,抗倒伏能力差。同時,芝麻植株莖稈過高,也在一定程度上加大了機械化收獲的難度。降低植株高度同時提高芝麻產量和機械化適應程度,是近20年來國內外芝麻育種研究工作的重點;選育適于機械化種植與收獲的高產穩產新品種已成為當前我國芝麻育種工作的重中之重。在此背景下,自2007年起,發明人積極開展了相關EMS誘變育種和種質創制工作,并于2009年成功創制出了短節間矮化突變體dw607。

該突變體(dw607)在田間表現為:植株單桿,一葉三花,蒴果四棱,節間長度極短,3.8-4.6cm;蒴果排列緊;密始蒴位20cm左右,不受密度影響,株高120-150厘米。在黃淮地區,該品種果節位20個以上,結蒴密。該特性受隱性單基因控制,能穩定遺傳,繁殖后代中矮化短節間植株達到98%以上。平均單株結蒴82個;平均蒴粒數61粒,千粒重3.84g,籽粒含油量52.62%,蛋白含量22.28%(2015年海南收獲種子)。品種對莖點枯病和枯萎病抗性高;適于密植和機械化管理與收獲。

進一步地,利用該突變體選育的短節密蒴型新品種豫芝Dw607,分別于2015年、2016年通過了河南省和安徽省芝麻新品種區試鑒定。2016年,河南省農業科學院分別在新疆精河和河南沈丘開展了豫芝Dw607高產示范和機械化收獲現場會,在我國首次應用了芝麻機械化收獲技術。目前,該品種已獲得新品種權保護(CNA013391E)。

但是需要說明的是,發明人雖然成功誘變培育獲得了具有短節間性狀的植物新品種,但對于該性狀的具體控制基因仍然是缺乏了解的。而如果可以針對性的獲得相應的節間長度調控基因,可為芝麻新品種培育、甚至其他植物新品種培育奠定良好的技術基礎,因此是具有十分重要的研究價值和應用價值的。



技術實現要素:

本申請中,發明人以現有誘變獲得的短節間突變體dw607為材料基礎,利用現有的芝麻群體作圖、芝麻基因組精細圖和重測序等技術,成功克隆了獲得了調節芝麻節間長短的節間長度基因Sidwf1(在芝麻基因組注釋中,該基因命名為SiGIB1D),并開發設計了針對該基因的SNP位點,可為進一步的芝麻新品種培育甚至其他作物新品種培育奠定一定技術基礎。

本申請所采取的技術方案詳述如下。

芝麻節間長度基因Sidwf1,該基因位于芝麻第4條染色體上,屬于隱性控制基因(相較于正常節間長度表型基因,突變位點位于第1057個堿基上),對矮化短節間性狀的解釋率為100%(即,該基因控制表現為矮化節間性狀);該基因長度為1638bp,包含2個外顯子和1個內含子,其堿基序列如SEQ ID1所示,具體為:

ATGGCGGGCAGTAATGAAGTAAATGTCAACGAATCAAAGGTAATCACGCATATTTTCTTCCTGGGTTCCTCAGAATTCTTGGTTTCTTTGTTTTGCGGTGTGGAATTAGGGTCTTCTCCGATGTGGGTTCCTGAATTTTCTTCGTTTCTTCTCTTAATTTTGGGGTTAATAGTGGGGTTTGTGATGGTTTTCCAAAGAAGATTTTATTTGGAGGAAAGAGTTGTGATTTATGGATAAAGATTGAGTCTTTTGCCTTTGATTTTGAGGGTTTGGGCAGCTGCTTCTCTCTCTCTATATACCTATTTTTGCTATTCGTTCTTTGCCCCCTTTGTTCTCCTCTTTGTTTTTTCTCGCCCAATACTGATTTAGCAGTCCCCATAAACCTGTTTTATGCTTGTTTGTTGGGTTATTTTTAGGTGGTTTCTCCACTTTTCCATTTCCCTTTCTTTTTATAGACTTTCATGTTTTTCTTTTCTTTTCGGCGTTTTCCTTTACAGCTGATTACCTTTACTGGATGTTGATGATACTGATTTGGGATGCATTTGATCAAATTTCATTCTCAATTTCGGTTTATTTTCTATTTTGTGCTGCAATTGATGGATAAGGAAACCATTGGTATATTGAAATTGACTGGCTGTCTTTATGCAGAGGGTGGTTCCACTTAATACATGGATCCTTATATCCAACTTCAAGCTTGCTTACAACATGCTTCGGCGGCCTGATGGTACATTTAATCGGGAATTGAACGAGTTTCTTGACCGGAAAGTGACTGCAAATGCTAATCCAGTAGATGGGGTTTACTCCTTTGATGTTGTAGATCGTGCCACGAGCCTGCTTAACCGGGTTTATTTGACCGCCCACGAGAATGAGCCTCAACGGGGGATCGTAGAAGTGGAAAAGCCCTTGAGTACCACTGAGATTGTGCCTGTGATTATATTCTTCCACGGTGGAAGCTTTGTTCATTCCTCAGCCAACAGTGCTATCTATGACACGCTCTGTCGTCGCCTCGTTAATACTTGCAAGGCAGCAGTTGTATCTGTGAATTATCGTCGATCGTCAGAGCACCGGTACCCGTGTGCGTATGATGATGGATGGACCGCTCTTAATTGGGTTAACTCGAGATCATGGCTTCAGAGTGGGAAGGATCAGAGAGTTCATATATATTTGGCAGGCGATAGTTCTGGTGGTAATATTGCGCATCATGTTGCTGTTCGAGCTGCGGAGGAGGGGGTCGAAGTATTGGGCAATATTCTTCTTCATCCTTTGTTTGGTGGGCAGGAGAGGACAGAATCTGAGAAAAAATTGGATGGGAAATACTTTGTAAGGATTCAAGATAGAGATTGGTACTGGAGAGCGTATTTACCAGAAGGAGAAGATAGGGACCATCCTGCGTGTAATGTGTTTGGCCCCAGGAGTAGAAGCCTCGAGGGACTAAAATTTCCAAAAAGCCTTGTTGTTGTGGCTGGATTAGATCTTCTTCAGGATTGGCAATTGCGTTATGTTGAAGGGCTAAAGAAATCAGGGCAAGAAGTGAAACTCCTTTATCTCGAAAAGGCAACAATTGGGTTCTATTTCTTGCCGAACAATGATCATTTCCAGTCCCTGATGGATGAGATGAAAAGCTTCATCCACCCTTAA。

所述芝麻節間長度基因Sidwf1所對應的短節間矮化表型cDNA,該cDNA序列長度為1029bp,可編碼343個氨基酸;需要注意的是,與野生型(wt)基因(即,正常的長節間性狀基因)相比, Sidwf1基因僅在cDNA序列的第448位堿基發生突變,核苷酸由C(wt)突變為T(矮化突變體);堿基序列如SEQ ID NO.2所示,具體為:

ATGGCGGGCAGTAATGAAGTAAATGTCAACGAATCAAAGAGGGTGGTTCCACTTAATACATGGATCCTTATATCCAACTTCAAGCTTGCTTACAACATGCTTCGGCGGCCTGATGGTACATTTAATCGGGAATTGAACGAGTTTCTTGACCGGAAAGTGACTGCAAATGCTAATCCAGTAGATGGGGTTTACTCCTTTGATGTTGTAGATCGTGCCACGAGCCTGCTTAACCGGGTTTATTTGACCGCCCACGAGAATGAGCCTCAACGGGGGATCGTAGAAGTGGAAAAGCCCTTGAGTACCACTGAGATTGTGCCTGTGATTATATTCTTCCACGGTGGAAGCTTTGTTCATTCCTCAGCCAACAGTGCTATCTATGACACGCTCTGTCGTCGCCTCGTTAATACTTGCAAGGCAGCAGTTGTATCTGTGAATTATCGTCGATCGTCAGAGCACCGGTACCCGTGTGCGTATGATGATGGATGGACCGCTCTTAATTGGGTTAACTCGAGATCATGGCTTCAGAGTGGGAAGGATCAGAGAGTTCATATATATTTGGCAGGCGATAGTTCTGGTGGTAATATTGCGCATCATGTTGCTGTTCGAGCTGCGGAGGAGGGGGTCGAAGTATTGGGCAATATTCTTCTTCATCCTTTGTTTGGTGGGCAGGAGAGGACAGAATCTGAGAAAAAATTGGATGGGAAATACTTTGTAAGGATTCAAGATAGAGATTGGTACTGGAGAGCGTATTTACCAGAAGGAGAAGATAGGGACCATCCTGCGTGTAATGTGTTTGGCCCCAGGAGTAGAAGCCTCGAGGGACTAAAATTTCCAAAAAGCCTTGTTGTTGTGGCTGGATTAGATCTTCTTCAGGATTGGCAATTGCGTTATGTTGAAGGGCTAAAGAAATCAGGGCAAGAAGTGAAACTCCTTTATCTCGAAAAGGCAACAATTGGGTTCTATTTCTTGCCGAACAATGATCATTTCCAGTCCCTGATGGATGAGATGAAAAGCTTCATCCACCCTTAA。

所述芝麻節間長度基因Sidwf1的等位基因SiDWF1,該基因所對應植株表型為正常型(或者說是長節間表型),堿基序列如SEQ ID NO.3所示,具體為:

ATGGCGGGCAGTAATGAAGTAAATGTCAACGAATCAAAGGTAATCACGCATATTTTCTTCCTGGGTTCCTCAGAATTCTTGGTTTCTTTGTTTTGCGGTGTGGAATTAGGGTCTTCTCCGATGTGGGTTCCTGAATTTTCTTCGTTTCTTCTCTTAATTTTGGGGTTAATAGTGGGGTTTGTGATGGTTTTCCAAAGAAGATTTTATTTGGAGGAAAGAGTTGTGATTTATGGATAAAGATTGAGTCTTTTGCCTTTGATTTTGAGGGTTTGGGCAGCTGCTTCTCTCTCTCTATATACCTATTTTTGCTATTCGTTCTTTGCCCCCTTTGTTCTCCTCTTTGTTTTTTCTCGCCCAATACTGATTTAGCAGTCCCCATAAACCTGTTTTATGCTTGTTTGTTGGGTTATTTTTAGGTGGTTTCTCCACTTTTCCATTTCCCTTTCTTTTTATAGACTTTCATGTTTTTCTTTTCTTTTCGGCGTTTTCCTTTACAGCTGATTACCTTTACTGGATGTTGATGATACTGATTTGGGATGCATTTGATCAAATTTCATTCTCAATTTCGGTTTATTTTCTATTTTGTGCTGCAATTGATGGATAAGGAAACCATTGGTATATTGAAATTGACTGGCTGTCTTTATGCAGAGGGTGGTTCCACTTAATACATGGATCCTTATATCCAACTTCAAGCTTGCTTACAACATGCTTCGGCGGCCTGATGGTACATTTAATCGGGAATTGAACGAGTTTCTTGACCGGAAAGTGACTGCAAATGCTAATCCAGTAGATGGGGTTTACTCCTTTGATGTTGTAGATCGTGCCACGAGCCTGCTTAACCGGGTTTATTTGACCGCCCACGAGAATGAGCCTCAACGGGGGATCGTAGAAGTGGAAAAGCCCTTGAGTACCACTGAGATTGTGCCTGTGATTATATTCTTCCACGGTGGAAGCTTTGTTCATTCCTCAGCCAACAGTGCTATCTATGACACGCTCTGTCGTCGCCTCGTTAATACTTGCAAGGCAGCAGTTGTATCTGTGAATTATCGTCGATCGCCAGAGCACCGGTACCCGTGTGCGTATGATGATGGATGGACCGCTCTTAATTGGGTTAACTCGAGATCATGGCTTCAGAGTGGGAAGGATCAGAGAGTTCATATATATTTGGCAGGCGATAGTTCTGGTGGTAATATTGCGCATCATGTTGCTGTTCGAGCTGCGGAGGAGGGGGTCGAAGTATTGGGCAATATTCTTCTTCATCCTTTGTTTGGTGGGCAGGAGAGGACAGAATCTGAGAAAAAATTGGATGGGAAATACTTTGTAAGGATTCAAGATAGAGATTGGTACTGGAGAGCGTATTTACCAGAAGGAGAAGATAGGGACCATCCTGCGTGTAATGTGTTTGGCCCCAGGAGTAGAAGCCTCGAGGGACTAAAATTTCCAAAAAGCCTTGTTGTTGTGGCTGGATTAGATCTTCTTCAGGATTGGCAATTGCGTTATGTTGAAGGGCTAAAGAAATCAGGGCAAGAAGTGAAACTCCTTTATCTCGAAAAGGCAACAATTGGGTTCTATTTCTTGCCGAACAATGATCATTTCCAGTCCCTGATGGATGAGATGAAAAGCTTCATCCACCCTTAA。

所述芝麻節間長度基因Sidwf1的等位基因SiDWF1所對應的正常型(或者說是正常節間表型)cDNA,與突變株(矮化短節間表型)基因序列的唯一不同點在于,正常型基因的cDNA序列中,第448位核苷酸為C;堿基序列如SEQ ID NO.4所示,具體為:

ATGGCGGGCAGTAATGAAGTAAATGTCAACGAATCAAAGAGGGTGGTTCCACTTAATACATGGATCCTTATATCCAACTTCAAGCTTGCTTACAACATGCTTCGGCGGCCTGATGGTACATTTAATCGGGAATTGAACGAGTTTCTTGACCGGAAAGTGACTGCAAATGCTAATCCAGTAGATGGGGTTTACTCCTTTGATGTTGTAGATCGTGCCACGAGCCTGCTTAACCGGGTTTATTTGACCGCCCACGAGAATGAGCCTCAACGGGGGATCGTAGAAGTGGAAAAGCCCTTGAGTACCACTGAGATTGTGCCTGTGATTATATTCTTCCACGGTGGAAGCTTTGTTCATTCCTCAGCCAACAGTGCTATCTATGACACGCTCTGTCGTCGCCTCGTTAATACTTGCAAGGCAGCAGTTGTATCTGTGAATTATCGTCGATCGCCAGAGCACCGGTACCCGTGTGCGTATGATGATGGATGGACCGCTCTTAATTGGGTTAACTCGAGATCATGGCTTCAGAGTGGGAAGGATCAGAGAGTTCATATATATTTGGCAGGCGATAGTTCTGGTGGTAATATTGCGCATCATGTTGCTGTTCGAGCTGCGGAGGAGGGGGTCGAAGTATTGGGCAATATTCTTCTTCATCCTTTGTTTGGTGGGCAGGAGAGGACAGAATCTGAGAAAAAATTGGATGGGAAATACTTTGTAAGGATTCAAGATAGAGATTGGTACTGGAGAGCGTATTTACCAGAAGGAGAAGATAGGGACCATCCTGCGTGTAATGTGTTTGGCCCCAGGAGTAGAAGCCTCGAGGGACTAAAATTTCCAAAAAGCCTTGTTGTTGTGGCTGGATTAGATCTTCTTCAGGATTGGCAATTGCGTTATGTTGAAGGGCTAAAGAAATCAGGGCAAGAAGTGAAACTCCTTTATCTCGAAAAGGCAACAATTGGGTTCTATTTCTTGCCGAACAATGATCATTTCCAGTCCCTGATGGATGAGATGAAAAGCTTCATCCACCCTTAA。

PCR擴增獲得所述芝麻節間長度基因Sidwf1或其等位基因SiDWF1的PCR引物對,具體為:

正向引物DWF1 Primer F:5'- GGGGTGGGGTGAAAGACAA -3';

反向引物DWF1 Primer R:5'- TCGCCAACACAAATGACAGG -3'。

利用所述PCR引物對制備獲得芝麻節間長度基因Sidwf1或其等位基因SiDWF1的PCR擴增方法,包括如下步驟:

(1)提取短節密蒴型新品種豫芝Dw607(新品種權CNA013391E)或正常節間表型的芝麻基因組DNA;

(2)以步驟(1)中所提取的基因組DNA為模板,以所述PCR引物對進行PCR擴增。

對芝麻節間長度基因Sidwf1及其等位基因SiDWF1檢測用SNP引物組,具體為:

SiSNPdwf1 F1:5'- GTATCTGTGAATTATCGTCGATAGC -3';

SiSNPdwf1 F2:5'- ATAATGTATCTGTGAATTATCGTCGATAGT -3';

SiSNPdwf1 R:5' –CTCTCTGATCCTTCCCACTCTG -3';

其中SiSNPdwf1 F1與SiSNPdwf1 R組合的擴增產物用來檢測判定是否含有芝麻節間長度基因Sidwf1的等位基因(正常表型(wt));SiSNPdwf1 F2與SiSNPdwf1 R組合后的擴增產物用來檢測判定是否含有芝麻節間長度基因Sidwf1(矮化突變表型)。

對于所設計的SNP引物組,需要解釋的是,為區分被檢測基因組DNA不同SNP等位位點,設計過程中著重考慮了如下兩點情況:

(1)為適應等位基因檢測需要,需將SNP引物對設計成3條,并需在特異引物的3’末端第3位的堿基引入錯配以增加擴增產物的特異性;而引入錯配的原則為:引物3’端-3位錯配堿基與3’末端的SNP錯配堿基形成穩定性互補的錯配結構,即強錯配型(C/T或G/A)與弱錯配型(C/A或G/T)搭配,中等錯配型(A/A、C/C、G/G或T/T)與中等錯配型搭配;

(2)在含有SNP位點的2個正向或反向引物中,將其中1條引物序列的5’端隨機增加5個堿基,其主要目的是為了不同位點的PCR產物在后續凝膠電泳圖譜區分能夠較為便捷地區分開來。

利用所述SNP引物組的芝麻節間長度檢測判定方法,包括如下步驟:

(1)提取待測芝麻種質的基因組DNA;

(2)以步驟(1)中所提取的基因組DNA為模板,采用三重引物PCR擴增方法或者分別利用SiSNPdwf1 F1與SiSNPdwf1 R組合、SiSNPdwf1 F2與SiSNPdwf1 R組合進行常規PCR擴增;

(3)對步驟(2)中PCR擴增產物進行電泳或者進一步進行測序,結合電泳結果和/或測序結果進行判定,具體判定標準為:

如果擴增產物條帶長度僅有121bp一種結果,表明待鑒定種子資源為為顯性純合型,表型為株高和節間正常的wt型;

如果擴增產物條帶長度僅有126bp一種結果,表明待鑒定種子資源為隱性純合型,表型為株高矮化的短節間表型;

如果擴增產物條帶產物有121bp和126bp兩種結果,表明待鑒定種子資源屬于雜合型,表型為株高和節間正常表型。

所述芝麻節間長度基因Sidwf1在植物育種的應用,用于培育矮節間作物新品種。

在現有矮化短節間品種基礎上,為確定短節間突變體dw607(dwf1)型和野生型(wt型)的基因序列差異,克隆獲得其控制芝麻節間長度的基因,發明人利用已構建的dw607(dw1型)×15N41(wt型)的F6群體,參考芝麻群體作圖、芝麻基因組精細圖和重測序等技術,最終成功克隆了芝麻節間長度基因Sidwf1,在芝麻基因組注釋中,該基因命名為SiGIB1D?;谠摶虻目寺『瓦M一步研究,可為下一步探明芝麻株型生長發育調控機理、選育短節密蒴型芝麻新品種、甚至可為其他作物新品種培育奠定堅實基礎??傮w上,本發明創新點主要體現在以下幾個方面:

(1)本發明對短節間型芝麻突變體dw607開展了基因定位,克隆提供了一個芝麻短節間基因Sidwf1,開發了其SNP標記SiSNPdwf1,同時提供了一種鑒定種質資源中是否含有該基因及標記位點的PCR鑒定方法,該方法可以較為便捷和快速地初步確定待測芝麻品種的株型及節間長度類型,為新品種培育提供參考;

(2)本發明所涉及的短節間基因對芝麻產量、品質及芝麻生產發展等具有重要影響,并對開展芝麻等農作物植株生長發育機理研究以及矮化抗倒伏芝麻新品種篩選、培育適于機械化生產的芝麻新品種具有重要意義;因此,開展該性狀基因克隆和SNP標記的開發必將在芝麻分子輔助育種中得到較好地應用;

(3)本發明所提供的芝麻短節間基因Sidwf1及SNP標記SiSNPdwf1的檢測方法,技術成熟,檢測結果穩定性好,對提高芝麻育種工作效率、提升我國芝麻遺傳育種研究技術水平具有重要意義。

總之,本申請所涉及的基因Sidwf1為隱性控制基因,突變位點位于第1057個堿基上,對芝麻矮化短節間性狀的解釋率為100%。通過對該基因及其等位基因SiDWF1/Sidwf1的深入研究,以及利用特定的SNP分子標記SiSNPdwf1,可為芝麻等農作物株高及節間長度等性狀調控發育機理研究提供理論基礎,同時也可為芝麻的分子輔助育種技術發展、矮化抗倒伏芝麻新品種篩選及新品種培育提供了材料基礎,因此具有較好的科研價值和經濟應用價值。

附圖說明

圖1為本發明涉及的dwf1型短節間芝麻突變體dw607(左側)及正常株親本豫芝11號(右側)田間對照;

圖2 為本發明的芝麻矮化短節間基因候選SNP位點在芝麻雜交群體關聯分析上的定位;

圖3為本發明芝麻短節間基因Sidwf1的基因結構示意圖,方框中為外顯子,黑色橫線為內含子;箭頭指示的彩色視圖下的紅色堿基為Sidwf1基因與正常等位基因SiDWF1的核苷酸序列差異位點;

圖4為本發明的芝麻矮化短節間SNP標記SiSNPdwf1的引物對SiSNPdwf1 F1、SiSNPdwf1 F2和反向引物對SiSNPdwf1 R在部分芝麻種質中的PCR擴增結果;

泳道M為DL 2000 marker,顯示的條帶從上到下分別為250bp和100bp;

泳道1-10為dw607與豫芝11的F2-3群體材料(短節間矮化型),僅含Sidwf1等位位點1(即dwf1型);

泳道11-20為dw607與豫芝11的F2-3群體材料(正常株型);其中泳道12、13、15、16、17、19和20含有Sidwf1的2個等位位點;泳道11、14、18僅含Sidwf1等位位點1(即dwf1型);

泳道21-40為20份種質資源(正常株型),僅含Sidwf1等位位點2(即wt型);

圖5為本發明的芝麻矮化短節間SNP標記SiSNPdwf1的引物對在鑒定芝麻種質節間長度類型中的PCR擴增結果;

泳道M為DL 2000 marker,顯示的條帶從上到下分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp;

泳道1-10為20份種質資源(正常株型),僅含Sidwf1等位位點2(即wt型);

泳道11-20為dw607與豫芝11的F2-3群體材料(正常株型);其中泳道22、27、和30只含有Sidwf1等位位點2(即wt型);

泳道21、23、24、25、26、28和29含有Sidwf1等位位點1和2,表現為正常型;

泳道31-40為dw607與豫芝11的F2-3群體材料(短節間矮化型),僅含Sidwf1等位位點1(即dwf1型)。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步的解釋說明。介紹具體實施例前,首先對本發明中所涉及芝麻種質資源及品種情況簡要說明如下。

現有技術中,芝麻品種豫芝11號是我國重要的芝麻育種優異親本材料;本申請中所采用的芝麻短節間新品種豫芝Dw607,是由河南省農業科學院芝麻研究中心從豫芝11號姊妹系誘變后代中選出的新品種;目前該品種已獲得國家新品種權保護((CNA013391E);其主要特征為:短節間、耐密植;平均節間長度為3.8-4.6 cm,每葉腋3花,單桿,蒴果四棱,白粒;

下述實施例中所涉及的芝麻資源15N41(主要特征為:節間長度正常,每葉腋單花,分枝,蒴果四棱,黑粒),來自于河南省農業科學院芝麻研究中心種質資源庫;實施例中所涉及的豫芝11等其他種質資源,也均來自于河南省農業科學院芝麻研究中心種質資源庫;而這些種質材料均可從河南省農業科學院芝麻研究中心種質資源庫這一公開渠道或者其他種質資源庫等渠道獲得。

實施例1

如前所述,在誘變培育獲得芝麻短節間新品種豫芝Dw607基礎上,為確定其對應的芝麻節間控制基因,發明人對該基因進行了詳細的定位分析,具體過程簡要介紹如下。

一、節間長度性狀遺傳背景分析

2012年,發明人首先選用短節間品系dw607與豫芝11號、15N41等節間正常型種質進行正反交組合配置(配置情況如下表1),并對F1后代進行節間長度性狀調查統計。

其中短節間突變體dw607和節間正常型親本豫芝11號的表型性狀對比如圖1所示。具體統計結果如下表1所示。

表1,芝麻種質材料配置情況及表型統計結果

表中:χ2(0.05, 1) = 3.84;“*”節間長度低于5.0cm的為短節間類型;節間長度高于5.0cm的為正常節間類型。

結果表明,F1均為正常株高和節間長度,說明該突變性狀受隱性核基因控制。隨后,對F2后代群體在成熟期開展了田間性狀調查。數據顯示,短節矮化突變體與野生型性狀的分離比符合1:3分離比,表明該突變性狀受1對隱性基因控制。進一步進行測交后代群體檢測的結果顯示,突變性狀后代分離比例符合1:1分離比,再次表明該突變性狀受1對隱性基因控制。

二、芝麻短節間型與正常型親本的F2遺傳群體構建

2013-2016年間,發明人進一步開展了矮化短節間突變體dw607與15N41的RIL群體構建。并于2016年將上述群體的F6種子采用營養缽點播,種植于河南省農業科學院芝麻研究中心三亞基地,確保株系數量大于600個。

三、節間長度相關基因Sidwf1定位

(1)F6群體親本及113個F6單株基因組重測序

在上述工作基礎上,發明人從F6群體中隨機挑選113個株系,采集113個株系單株和2個親本單株的幼嫩葉片,參照魏利斌等(2008)中的改良CTAB法提取各植株DNA(芝麻DNA和RNA同步提取方法,2008,分子植物育種),采用Illumina測序方法對115份材料進行基因組重測序,測序覆蓋度≥30×。

(2)參考豫芝11基因組數據(Zhang et al.,Ultra-dense SNP genetic map construction and identification of SiDt gene controlling the determinate growth habit in Sesamum indicum L,2016,Science Reports;Zhao et al.,Identification of sesame (Sesamum indicum L.) chromosomes using the BAC‐FISH system, 2018, Plant Biology;選用BWA(Burrows- Wheeler Aligner)軟件將各株系的測序數據進行比對拼接。

(3)在終花期,對F6群體113個株系及2個親本進行節間長度測定,判定長度類型。

結合上述群體數據,采用Tassele 5.0軟件,確定了與芝麻節間長度性狀緊密關聯的變體P值,結果參見圖2。

結果顯示,與目標性狀緊密連鎖的最小P值位于第4染色體。對上下游200kb的變體進行統計分析。進一步分析發現,此區間內共包含了58個SNP/InDel多態位點,P值范圍為9.08E-05 ~ 2.59E-15。

隨后用824份芝麻種質的變體數據庫進行變體篩選,結果顯示,剩余變體共有12個(圖2中彩色視圖下的綠點)。

隨后用dw607×豫芝11 F2-3 群體的兩個混合池變體數據對上述變體繼續進行篩選過濾。結果顯示,僅C9_6989486位點與短節間矮化性狀緊密連鎖(具體結果如下表2所示)。

表2,與短節間性狀緊密關聯的變體信息

。

實施例2

在實施例1定位基礎上,發明人進一步對所定位的節間長度基因進行了克隆和測序分析,具體過程簡要介紹如下。

根據上述實施例1中獲得的變體位點,利用豫芝11號基因組數據,分析確定了C9_6989486位點為目標SNP位點,將其所在的基因C9.scaffold2.572被命名為Sidwf1。序列分析發現,該基因在芝麻基因組(豫芝11號)被注釋為SiGIB1D基因。

隨后,根據基因組數據,利用Primer premier 5.0軟件設計了PCR擴增用引物對,以便擴增獲得該芝麻節間長度基因Sidwf1。

所設計的引物具體序列為:

SiDWF1 F:5'-GGGGTGGGGTGAAAGACAA-3;

SiDWF1 R:5'- TCGCCAACACAAATGACAGG-3'。

進一步地,以dw607的DNA為模板(提取方式參考實施例1),利用上述引物對進行PCR擴增。

PCR反應在PTC-100 (MJ research公司產品)熱循環儀上進行,反應程序參考設計為:94℃預變性3分鐘;之后94℃變性30秒,55℃復性30秒,72℃延伸1分鐘,循環30次;最后72℃延伸5分鐘;4℃保存。

回收擴增產物并進行測序(由天津基因芯片生物公司完成)。結果顯示,該基因Sidwf1的基因組全長序列為1638bp,共包含2個外顯子和1個內含子,序列如SEQ ID.1所示。

進一步地,利用上述引物對以正常節間表型的豫芝11號基因組DNA為模板進行了擴增,并對擴增產物進行了測序。正常節間表型的SiDWF1基因序列如SEQ ID.3所示。

將矮化節間Sidwf1基因及其正常節間表型的等位基因SiDWF1進行序列比對,示意圖如圖3所示。詳細對比分析可以看出:

在正常型和短節間矮化型種質基因組中,Sidwf1序列的差異僅在于基因序列第1057位堿基是否發生了C/T突變;當第1057位的堿基C就突變為了堿基T,導致編碼蛋白的第150個氨基酸序列由脯氨酸(P)突變為了絲氨酸(S) ,節間長度類型則由正常型突變為dwf1短節間型。

實施例3

在實施例2結果基礎上,為進一步確認Sidwf1基因即是調控芝麻節間長度類型的基因,發明人設計了SNP引物組,并選用了600份種質資源和1個組合F2群體進行了驗證。具體過程簡要介紹如下。

首先,所設計的SNP引物組具體如下:

正向引物SiSNPdwf1 F1序列:5'- GTATCTGTGAATTATCGTCGATAGC -3';

正向引物SiSNPdwf1 F2序列:5'- ATAATGTATCTGTGAATTATCGTCGATAGT -3';

反向引物SiSNPdwf1 R序列:5' –CTCTCTGATCCTTCCCACTCTG -3'。

需要解釋的是,為區分被檢測基因組DNA不同SNP等位位點,設計引物時至少需考慮如下兩個方面:

(1)將SNP引物對設計成3條,并需在特異引物的3’末端第3位的堿基引入錯配以增加擴增產物的特異性;引入錯配的原則為:引物3’端-3位錯配堿基與3’末端的SNP錯配堿基形成穩定性互補的錯配結構;即強錯配型(C/T或G/A)與弱錯配型(C/A或G/T)搭配,中等錯配型(A/A、C/C、G/G或T/T)與中等錯配型搭配;

(2)在含有SNP位點的2個正向或反向引物中,將其中1條引物序列的5’端隨機增加5個堿基,其主要目的是為了不同位點的PCR產物在后續凝膠電泳圖譜區分能夠較為便捷地區分開來。

然后,隨機從dw607與豫芝11號的F2-3群體中挑選600個單株,田間調查各單株的節間長度類型;同時采集600個單株和2個親本單株的幼嫩葉片,提取其基因組DNA(參考實施例1,采用改良CTAB法提?。?。

以所提取的基因組DNA為模板,分別利用上述SNP引物組中不同引物對組合(即,分別以引物對SiSNPdwf1 F1+SiSNPdwf1 R或者SiSNPdwf1 F2+SiSNPdwf1 R為引物對)進行PCR擴增;PCR擴增時,10 μL反應體系參考設置如下:

模板DNA (50ng/μL),1.0μL;

10×PCR Buffer (Mg2+),1.0μL;

Taqase酶 (5U/μL),0.2μL;

dNTP (10mmol/L),0.2μL;

Forward Primer 1 (10μM),0.5μL;

Forward specific Primer 2 (10μM),0.5μL;

Reverse Primer (10μM),1.0μL;

加入超純水5.6μL。

PCR反應在PTC-100 (MJ research公司產品)熱循環儀上進行,反應程序為:94℃預變性3分鐘,之后94℃變性30秒,55℃復性30秒,72℃延伸30秒,循環30次,最后72℃延伸5分鐘,4℃,保存。

對步驟(4)中PCR產物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,凝膠濃度為8~10%,凝膠大小180mm×120mm×2mm,電泳緩沖液為0.5×TBE,150V恒壓交流電電泳1.5~2小時。

電泳結束后,在凝膠加入濃度為0.1%的硝酸銀水溶液,置于水平搖床上滲透銀染10min;再加入2%氫氧化鈉和0.4%甲醛混合溶液,置于水平搖床中適度顯色;最后清水漂洗凝膠并記錄讀取數據。

部分電泳圖譜如圖4所示。分析可以看出,表現為短節間的植株,其擴增結果為126bp條帶;節間長度正常的親本擴增結果為121bp條帶;雜合型植株擴增出121bp和126bp條帶,性狀表現為正常型。

綜上,我們可以認為該Sidwf1基因是引起芝麻節間長度發生突變的基因,該基因可用于芝麻等作物株高及節間長度性狀調控機理研究。

實施例4

在實施例3基礎上,以鑒定是否為短節間型優異材料為例,發明人進行了進一步的實驗驗證。具體過程簡要介紹如下。

為快速鑒定出短節間型育種材料,首先從dw607與豫芝11的雜交后代中隨機挑選樣本100份,從種質資源庫中隨機選取樣本100份進行培育(對于樣品材料分別于花期調查確定株高及節間長度類型)。

對200個單株個體提取基因組DNA,利用實施例3中所設計的SNP引物組進行PCR檢測,從而評價SNP標記的可靠性。

需要解釋的是,PCR擴增過程中,以正向引物1和反向引物擴增的PCR產物大小為121bp;以正向引物2和反向引物擴增的PCR產物大小為126bp。

對PCR擴增產物進行電泳,部分電泳圖譜如圖5所示。

從前述SiSNPdwf1位點篩選過程我們可以知曉,理論上具有SiSNPdwf1等位位點1(條帶大小121bp,即本申請SiSNPdwf1位點)的植株應該表現為節間長度正常;具有SiSNPdwf1等位位點2(條帶大小126bp,即SiSNPdwf1位點中的堿基C變為T時位點)的植株應該表現為短節間。具有SiSNPdwf1等位位點1、2(條帶大小121bp和126bp,)的植株為雜合體,應該表現為節間長度正常。

檢測結果顯示,在有SiSNPdwf1等位位點1(條帶大小121bp)的植株中,均為正常型,可靠度為100%;在僅有SiSNPdwf1等位位點2(條帶大小126bp)的植株中,均為短節間,可靠度為100%。在有SiSNPdwf1等位位點1和2(條帶大小為121bp、126bp)的雜合植株中,表型均為節間長度正常,可靠度100%。

綜上,我們可以認為該SNP標記即為芝麻短節間基因SNP位點標記,可以用于預測芝麻品種的株高和節間長度類型,用于芝麻分子標記輔助育種和矮化短節間型芝麻新品種的選育。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省農業科學院芝麻研究中心

<120> 芝麻節間長度基因Sidwf1及其SNP標記

<130> none

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1638

<212> DNA

<213> Sesame indicum

<400> 1

atggcgggca gtaatgaagt aaatgtcaac gaatcaaagg taatcacgca tattttcttc 60

ctgggttcct cagaattctt ggtttctttg ttttgcggtg tggaattagg gtcttctccg 120

atgtgggttc ctgaattttc ttcgtttctt ctcttaattt tggggttaat agtggggttt 180

gtgatggttt tccaaagaag attttatttg gaggaaagag ttgtgattta tggataaaga 240

ttgagtcttt tgcctttgat tttgagggtt tgggcagctg cttctctctc tctatatacc 300

tatttttgct attcgttctt tgcccccttt gttctcctct ttgttttttc tcgcccaata 360

ctgatttagc agtccccata aacctgtttt atgcttgttt gttgggttat ttttaggtgg 420

tttctccact tttccatttc cctttctttt tatagacttt catgtttttc ttttcttttc 480

ggcgttttcc tttacagctg attaccttta ctggatgttg atgatactga tttgggatgc 540

atttgatcaa atttcattct caatttcggt ttattttcta ttttgtgctg caattgatgg 600

ataaggaaac cattggtata ttgaaattga ctggctgtct ttatgcagag ggtggttcca 660

cttaatacat ggatccttat atccaacttc aagcttgctt acaacatgct tcggcggcct 720

gatggtacat ttaatcggga attgaacgag tttcttgacc ggaaagtgac tgcaaatgct 780

aatccagtag atggggttta ctcctttgat gttgtagatc gtgccacgag cctgcttaac 840

cgggtttatt tgaccgccca cgagaatgag cctcaacggg ggatcgtaga agtggaaaag 900

cccttgagta ccactgagat tgtgcctgtg attatattct tccacggtgg aagctttgtt 960

cattcctcag ccaacagtgc tatctatgac acgctctgtc gtcgcctcgt taatacttgc 1020

aaggcagcag ttgtatctgt gaattatcgt cgatcgtcag agcaccggta cccgtgtgcg 1080

tatgatgatg gatggaccgc tcttaattgg gttaactcga gatcatggct tcagagtggg 1140

aaggatcaga gagttcatat atatttggca ggcgatagtt ctggtggtaa tattgcgcat 1200

catgttgctg ttcgagctgc ggaggagggg gtcgaagtat tgggcaatat tcttcttcat 1260

cctttgtttg gtgggcagga gaggacagaa tctgagaaaa aattggatgg gaaatacttt 1320

gtaaggattc aagatagaga ttggtactgg agagcgtatt taccagaagg agaagatagg 1380

gaccatcctg cgtgtaatgt gtttggcccc aggagtagaa gcctcgaggg actaaaattt 1440

ccaaaaagcc ttgttgttgt ggctggatta gatcttcttc aggattggca attgcgttat 1500

gttgaagggc taaagaaatc agggcaagaa gtgaaactcc tttatctcga aaaggcaaca 1560

attgggttct atttcttgcc gaacaatgat catttccagt ccctgatgga tgagatgaaa 1620

agcttcatcc acccttaa 1638

<210> 2

<211> 1029

<212> DNA

<213> Sesame indicum

<400> 2

atggcgggca gtaatgaagt aaatgtcaac gaatcaaaga gggtggttcc acttaataca 60

tggatcctta tatccaactt caagcttgct tacaacatgc ttcggcggcc tgatggtaca 120

tttaatcggg aattgaacga gtttcttgac cggaaagtga ctgcaaatgc taatccagta 180

gatggggttt actcctttga tgttgtagat cgtgccacga gcctgcttaa ccgggtttat 240

ttgaccgccc acgagaatga gcctcaacgg gggatcgtag aagtggaaaa gcccttgagt 300

accactgaga ttgtgcctgt gattatattc ttccacggtg gaagctttgt tcattcctca 360

gccaacagtg ctatctatga cacgctctgt cgtcgcctcg ttaatacttg caaggcagca 420

gttgtatctg tgaattatcg tcgatcgtca gagcaccggt acccgtgtgc gtatgatgat 480

ggatggaccg ctcttaattg ggttaactcg agatcatggc ttcagagtgg gaaggatcag 540

agagttcata tatatttggc aggcgatagt tctggtggta atattgcgca tcatgttgct 600

gttcgagctg cggaggaggg ggtcgaagta ttgggcaata ttcttcttca tcctttgttt 660

ggtgggcagg agaggacaga atctgagaaa aaattggatg ggaaatactt tgtaaggatt 720

caagatagag attggtactg gagagcgtat ttaccagaag gagaagatag ggaccatcct 780

gcgtgtaatg tgtttggccc caggagtaga agcctcgagg gactaaaatt tccaaaaagc 840

cttgttgttg tggctggatt agatcttctt caggattggc aattgcgtta tgttgaaggg 900

ctaaagaaat cagggcaaga agtgaaactc ctttatctcg aaaaggcaac aattgggttc 960

tatttcttgc cgaacaatga tcatttccag tccctgatgg atgagatgaa aagcttcatc 1020

cacccttaa 1029

<210> 3

<211> 1638

<212> DNA

<213> Sesame indicum

<400> 3

atggcgggca gtaatgaagt aaatgtcaac gaatcaaagg taatcacgca tattttcttc 60

ctgggttcct cagaattctt ggtttctttg ttttgcggtg tggaattagg gtcttctccg 120

atgtgggttc ctgaattttc ttcgtttctt ctcttaattt tggggttaat agtggggttt 180

gtgatggttt tccaaagaag attttatttg gaggaaagag ttgtgattta tggataaaga 240

ttgagtcttt tgcctttgat tttgagggtt tgggcagctg cttctctctc tctatatacc 300

tatttttgct attcgttctt tgcccccttt gttctcctct ttgttttttc tcgcccaata 360

ctgatttagc agtccccata aacctgtttt atgcttgttt gttgggttat ttttaggtgg 420

tttctccact tttccatttc cctttctttt tatagacttt catgtttttc ttttcttttc 480

ggcgttttcc tttacagctg attaccttta ctggatgttg atgatactga tttgggatgc 540

atttgatcaa atttcattct caatttcggt ttattttcta ttttgtgctg caattgatgg 600

ataaggaaac cattggtata ttgaaattga ctggctgtct ttatgcagag ggtggttcca 660

cttaatacat ggatccttat atccaacttc aagcttgctt acaacatgct tcggcggcct 720

gatggtacat ttaatcggga attgaacgag tttcttgacc ggaaagtgac tgcaaatgct 780

aatccagtag atggggttta ctcctttgat gttgtagatc gtgccacgag cctgcttaac 840

cgggtttatt tgaccgccca cgagaatgag cctcaacggg ggatcgtaga agtggaaaag 900

cccttgagta ccactgagat tgtgcctgtg attatattct tccacggtgg aagctttgtt 960

cattcctcag ccaacagtgc tatctatgac acgctctgtc gtcgcctcgt taatacttgc 1020

aaggcagcag ttgtatctgt gaattatcgt cgatcgccag agcaccggta cccgtgtgcg 1080

tatgatgatg gatggaccgc tcttaattgg gttaactcga gatcatggct tcagagtggg 1140

aaggatcaga gagttcatat atatttggca ggcgatagtt ctggtggtaa tattgcgcat 1200

catgttgctg ttcgagctgc ggaggagggg gtcgaagtat tgggcaatat tcttcttcat 1260

cctttgtttg gtgggcagga gaggacagaa tctgagaaaa aattggatgg gaaatacttt 1320

gtaaggattc aagatagaga ttggtactgg agagcgtatt taccagaagg agaagatagg 1380

gaccatcctg cgtgtaatgt gtttggcccc aggagtagaa gcctcgaggg actaaaattt 1440

ccaaaaagcc ttgttgttgt ggctggatta gatcttcttc aggattggca attgcgttat 1500

gttgaagggc taaagaaatc agggcaagaa gtgaaactcc tttatctcga aaaggcaaca 1560

attgggttct atttcttgcc gaacaatgat catttccagt ccctgatgga tgagatgaaa 1620

agcttcatcc acccttaa 1638

<210> 4

<211> 1029

<212> DNA

<213> Sesame indicum

<400> 4

atggcgggca gtaatgaagt aaatgtcaac gaatcaaaga gggtggttcc acttaataca 60

tggatcctta tatccaactt caagcttgct tacaacatgc ttcggcggcc tgatggtaca 120

tttaatcggg aattgaacga gtttcttgac cggaaagtga ctgcaaatgc taatccagta 180

gatggggttt actcctttga tgttgtagat cgtgccacga gcctgcttaa ccgggtttat 240

ttgaccgccc acgagaatga gcctcaacgg gggatcgtag aagtggaaaa gcccttgagt 300

accactgaga ttgtgcctgt gattatattc ttccacggtg gaagctttgt tcattcctca 360

gccaacagtg ctatctatga cacgctctgt cgtcgcctcg ttaatacttg caaggcagca 420

gttgtatctg tgaattatcg tcgatcgcca gagcaccggt acccgtgtgc gtatgatgat 480

ggatggaccg ctcttaattg ggttaactcg agatcatggc ttcagagtgg gaaggatcag 540

agagttcata tatatttggc aggcgatagt tctggtggta atattgcgca tcatgttgct 600

gttcgagctg cggaggaggg ggtcgaagta ttgggcaata ttcttcttca tcctttgttt 660

ggtgggcagg agaggacaga atctgagaaa aaattggatg ggaaatactt tgtaaggatt 720

caagatagag attggtactg gagagcgtat ttaccagaag gagaagatag ggaccatcct 780

gcgtgtaatg tgtttggccc caggagtaga agcctcgagg gactaaaatt tccaaaaagc 840

cttgttgttg tggctggatt agatcttctt caggattggc aattgcgtta tgttgaaggg 900

ctaaagaaat cagggcaaga agtgaaactc ctttatctcg aaaaggcaac aattgggttc 960

tatttcttgc cgaacaatga tcatttccag tccctgatgg atgagatgaa aagcttcatc 1020

cacccttaa 1029

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