基于甲基化修飾的腫瘤標記物STAMP-EP7及其應用的制作方法

文檔序號:18145661發布日期:2019-07-10 11:47
基于甲基化修飾的腫瘤標記物STAMP-EP7及其應用的制作方法

本發明屬于疾病診斷標記物領域,更具體地,本發明涉及基于甲基化修飾的腫瘤標記物STAMP(Specific Tumor Aligned Methylation of Pan-cancer)及其應用。



背景技術:

腫瘤被認為是一種遺傳性疾病的觀念在本領域持續幾十年。人類幾次系統的大規模測序證實了癌組織中體細胞的突變數量明顯少于預期,這些結果暗示了癌癥并非簡單的遺傳性疾病。

為了實現腫瘤的診斷,近年來許多新型的腫瘤標記物被發現并用于臨床診斷。1980年之前,腫瘤標記物主要是一些激素、酶類、蛋白質等細胞分泌物,例如癌胚抗原(CEA)、甲胎抗原(AFP)等可以作為胃癌和肝癌等多種腫瘤的標記物,糖類抗原125(CA125)可以作為宮頸癌的標記物,前列腺特異性抗原(PSA)可作為前列腺癌標記物,目前這一類腫瘤標記物雖然臨床仍在用,但其敏感性與準確性已難以滿足臨床需求。

越來越多的證據表明,表觀遺傳調控的細小變化在腫瘤中的重要作用。表觀遺傳學是研究基因在不發生DNA序列改變的情況下,基因功能發生的可遺傳的變化,并最終導致了表型的變化的一門學科。表觀遺傳學主要包括DNA甲基化(DNA methylation),組蛋白修飾(histone modification),microRNA水平變化等生化過程。DNA甲基化是表觀遺傳學機制之一,其是指生物體內在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DMT)的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體,將甲基轉移到特定的堿基上的過程。在哺乳動物中DNA甲基化主要發生在5’-CpG-3’的C上,生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。

液體活檢技術是以血中循環腫瘤細胞或循環腫瘤DNA為檢測靶標對腫瘤進行診斷和預測的技術。該技術存在諸多不足:首先,敏感性與特異性不夠高,腫瘤本身有很大的異質性,包含多種亞型的細胞群,而臨床樣本尤其是血液樣本,腫瘤DNA所占比例非常小,現有的腫瘤標記物難以滿足臨床要求的敏感性,在臨床容易造成誤診;其次,一種標記物只針對一種或少數幾種腫瘤有較好效果,而血液中的DNA來源非常復雜,因此現有的腫瘤標記物無法應對復雜的腫瘤來源、轉移等問題。由于這些復雜情況的存在,使得很多DNA甲基化腫瘤標記物在應用于臨床時難以有統一的使用標準,嚴重影響標記物的敏感度以及準確性。

在本發明人的前期研究中,找到了一部分基于甲基化修飾的腫瘤標記物,但是,仍然有必要找到更多的新型腫瘤標志物,從而為腫瘤的診斷提供更多的途徑。



技術實現要素:

本發明的目的在于提供以DNA甲基化修飾作為腫瘤標記物,利用腫瘤中特異性位點異常高甲基化現象來檢測腫瘤的方法。

在本發明的第一方面,提供分離的多核苷酸,包括:(a)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸;(b)(a)的多核苷酸的片段,且其中存在至少1個修飾的CpG位點(如2~77個,更具體如3,5,10,15,20,25,30,40,50,60,70個);和/或(c)與上述(a)或(b)的多核苷酸或片段互補的核酸(如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的多核苷酸)。

在一個優選例中,所述修飾包括5-甲基化修飾、5-羥甲基化修飾、5-醛甲基化修飾或5-羧甲基化修飾。

在另一優選例中,(b)中,所述的多核苷酸的片段中存在:SEQ ID NO:1中第281~309位(包含017~020號甲基化位點)或第282~308位堿基(包含017~020號甲基化位點);

SEQ ID NO:1中第1~389位堿基(包含001~025號甲基化位點);或

SEQ ID NO:1中第418~970位堿基(包含026~077號甲基化位點)。

在本發明的第二方面,提供分離的多核苷酸,其由所述的多核苷酸轉變而來,對應于前述第一方面的序列,其修飾的CpG位點的胞嘧啶C不變,非修飾的胞嘧啶轉為T或U。

在一個優選例中,其由對應于前述第一方面的多核苷酸經過亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽處理轉變而來。在另一優選例中,所述的多核苷酸包括:(d)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的多核苷酸;(e)上述(d)的多核苷酸的片段,且其中存在至少1個修飾的CpG位點(如2~77個,更具體如3,5,10,15,20,25,30,40,50,60,70個)。

在另一優選例中,(e)中,所述的多核苷酸的片段中存在:SEQ ID NO:2中第281~309位(包含017~020號甲基化位點)或第282~308位堿基(包含017~020號甲基化位點);SEQ ID NO:2中第1~389位堿基(包含001~025號甲基化位點);SEQ ID NO:2中第418~970位堿基(包含026~077號甲基化位點);SEQ ID NO:4中第662~690位(對應于017~020號甲基化位點)或第663~689位堿基(對應于017~020號甲基化位點);SEQ ID NO:4中第582~970位堿基(對應于001~025號甲基化位點);SEQ ID NO:4中第1~553位堿基(對應于026~077號甲基化位點)。

在本發明的第三方面,提供前述第一方面或第二方面所述的多核苷酸的用途,用于制備腫瘤的檢測試劑或試劑盒。

在一個優選例中,所述腫瘤包括(但不限于):血液系統腫瘤如白血病,淋巴瘤,多發性骨髓瘤;婦科及生殖系統腫瘤如乳腺癌,卵巢癌,宮頸癌,外陰癌,睪丸癌,前列腺癌,陰莖癌;消化系統腫瘤如食道癌(食管癌),胃癌,結直腸癌,肝癌,胰腺癌,膽管及膽囊癌;呼吸系統腫瘤如肺癌,胸膜瘤;神經系統腫瘤如膠質瘤,神經母細胞瘤,腦膜瘤;頭頸部腫瘤如口腔癌,舌癌,喉癌,鼻咽癌;泌尿系統腫瘤如腎癌,膀胱癌,皮膚及其他系統如皮膚癌、黑色素瘤、骨肉瘤,脂肪肉瘤,甲狀腺癌。

在另一優選例中,所述腫瘤的樣本包括但不限于:組織樣本、石蠟包埋樣本、血液樣本、胸腔積液樣本以及肺泡灌洗液樣本、腹水及灌洗液樣本、膽汁樣本、糞便樣本、尿液樣本、唾液樣本、痰液樣本、腦脊液樣本、細胞涂片樣本、宮頸刮片或刷片樣本、組織及細胞活檢樣本。

在本發明的第四方面,提供一種制備腫瘤檢測試劑的方法,所述方法包括:提供前述第一方面或第二方面所述的多核苷酸,以所述多核苷酸的全長或片段作為靶序列,設計特異性檢測該靶序列的CpG位點修飾情況的檢測試劑;其中,所述的靶序列中存在至少1個(如2~77個,更具體如3,5,10,15,20,25,30,40,50,60,70個)修飾的CpG位點;較佳地,所述的檢測試劑包括(但不限于):引物,探針。

在本發明的第五方面,提供試劑或組合的試劑,其特異性檢測靶序列的CpG位點修飾情況,所述的靶序列是前述第一方面或第二方面任一所述的多核苷酸的全長或片段,其中存在至少1個(如2~77個,更具體如3,5,10,15,20,25,30,40,50,60,70個)修飾的CpG位點。

在一個優選例中,所述的試劑或組合的試劑針對包含所述靶序列的基因序列(基于所述基因序列而設計),所述的基因序列包括基因Panel或基因群組。

在另一優選例中,所述的檢測試劑包括:引物,探針。

在另一優選例中,所述的引物為:SEQ ID NO:3和4所示的引物;SEQ ID NO:7和8所示的引物;或SEQ ID NO:9和10所示的引物。

在本發明的第六方面,提供本發明的第五方面所述的試劑或組合的試劑的用途,用于制備檢測腫瘤的試劑盒;較佳地,所述的腫瘤包括(但不限于):血液系統腫瘤如白血病,淋巴瘤,多發性骨髓瘤;婦科及生殖系統腫瘤如乳腺癌,卵巢癌,宮頸癌,外陰癌,睪丸癌,前列腺癌,陰莖癌;消化系統腫瘤如食道癌(食管癌),胃癌,結直腸癌,肝癌,胰腺癌,膽管及膽囊癌;呼吸系統腫瘤如肺癌,胸膜瘤;神經系統腫瘤如膠質瘤,神經母細胞瘤,腦膜瘤;頭頸部腫瘤如口腔癌,舌癌,喉癌,鼻咽癌;泌尿系統腫瘤如腎癌,膀胱癌,皮膚及其他系統如皮膚癌、黑色素瘤、骨肉瘤,脂肪肉瘤,甲狀腺癌。

在本發明的第七方面,提供一種檢測試劑盒,其包括:容器,以及位于容器中的前面所述的試劑或試劑組合;較佳地,每一種試劑位于一個獨立的容器中。

在一個優選例中,所述的試劑盒中還包括:亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽,DNA純化試劑,DNA提取試劑,PCR擴增試劑和/或使用說明書(標明檢測操作步驟和結果判定標準)。

在本發明的第八方面,提供一種體外檢測樣品的甲基化譜式的方法,包括:(i)提供樣品,提取核酸;(ii)檢測(i)的核酸中靶序列的CpG位點修飾情況,所述的靶序列是前述第一方面所述的多核苷酸或由其轉變而來的前述第二方面所述的多核苷酸。

在一個優選例中,步驟(3)中,分析的方法包括:焦磷酸測序法、重亞硫酸鹽轉化測序法、甲基化芯片法、qPCR法、數字PCR法、二代測序法、三代測序法、全基因組甲基化測序法、DNA富集檢測法、簡化亞硫酸氫鹽測序技術、HPLC法、MassArray、甲基化特異PCR(MSP)、或它們的組合以及SEQ ID NO:1所示序列中部分或全部甲基化位點的組合基因群組體外檢測方法及體內示蹤檢測方法。并且,其它其他甲基化檢測方法及未來新開發的甲基化檢測方法也可被應用于本發明中。

在另一優選例中,步驟(ii)包括:(1)對(i)的產物進行處理,使其中未發生修飾的胞嘧啶轉化為尿嘧啶;較佳地,所述修飾包括5-甲基化修飾、5-羥甲基化修飾、5-醛甲基化修飾或5-羧甲基化修飾;較佳地,利用亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽處理步驟(i)所述的核酸;(2)分析經(1)處理的核酸中所述的靶序列的修飾情況。

在另一優選例中,所述的甲基化譜式異常是指該多核苷酸CpG中的C發生高度甲基化。

在另一優選例中,所述的甲基化譜式的方法不以直接獲得疾病的診斷結果為目的,或不是診斷性的方法。

在本發明的第九方面,提供一種腫瘤診斷試劑盒,包括利用本發明的第一方面或第二方面所示序列設計的引物對以及包含該序列的基因Panel或基因群組,通過DNA甲基化狀態檢測獲取正常細胞和腫瘤細胞的特征。

本發明的其它方面由于本文的公開內容,對本領域的技術人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、SEQ ID NO:1區域中001-025甲基化位點肺癌細胞與正常肺細胞甲基化水平BSP驗證。圖中深色方框表示呈現甲基化。

圖2、SEQ ID NO:1區域中026~077甲基化位點肺癌細胞與正常肺細胞甲基化水平BSP驗證。圖中深色方框表示呈現甲基化。

圖3、針對白血病臨床樣本,STAMP-EP7在肺癌組織以及癌組織中的甲基化值比較。

圖4、針對乳腺癌臨床樣本,STAMP-EP7在癌旁樣本以及癌組織樣本中的甲基化值比較。

圖5、針對直腸癌臨床樣本,STAMP-EP7在癌旁樣本以及癌組織樣本中的甲基化值比較。

圖6、針對食管癌臨床樣本,STAMP-EP7在癌旁樣本以及癌組織樣本中的甲基化值比較。

圖7、針對肝癌臨床樣本,STAMP-EP7在癌旁樣本以及癌組織樣本中的甲基化值比較。

圖8、針對肺癌臨床樣本,STAMP-EP7在癌旁樣本以及癌組織樣本中的甲基化值比較。

圖9、針對胰腺癌臨床樣本,STAMP-EP7在癌旁樣本以及癌組織樣本中的甲基化值比較。

具體實施方式

本發明人致力于腫瘤標志物的研究,經過廣泛的研究篩選,提供一種通用型的DNA甲基化腫瘤標志物STAMP(Specific Tumor Aligned Methylation of Pan-cancer),在正常的組織中STAMP處于低甲基化狀態,在腫瘤組織中STAMP呈高甲基化狀態,可用于臨床腫瘤的檢測,以及用于作為設計腫瘤診斷試劑的基礎。

術語

如本文所用,“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質,原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化的,但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開,則為分離純化的。

如本文所用,“樣本”或“樣品”包括從任何個體或分離的組織、細胞或體液(如血漿)中獲得的、適合于DNA甲基化狀態檢測的物質。例如,所示的樣本可以包括但不限于:組織樣本、石蠟包埋樣本、血液樣本、胸腔積液樣本以及肺泡灌洗液樣本、腹水及灌洗液樣本、膽汁樣本、糞便樣本、尿液樣本、唾液樣本、腦脊液樣本、細胞涂片樣本、宮頸刮片或刷片樣本、組織及細胞活檢樣本。

如本文所用,“高(度)甲基化”是指在一個基因序列中CpG存在高度甲基化、羥甲基化、醛甲基化或羧甲基化修飾。例如,以甲基化特異PCR(MSP)分析手段而言,以甲基化特異性引物所進行的PCR反應可獲得陽性的PCR結果即可認為該受試的DNA(基因)區處于高甲基化狀態。例如,以實時定量甲基化特異性PCR而言,高甲基化狀態的判定可根據其對照樣品的甲基化狀態的相對值分析統計學差異。

基因標志物

為了尋找對于診斷腫瘤有用的靶標,本發明人經過了廣泛而深入的研究,確定了STAMP-EP7這一靶標。STAMP-EP7基因序列區域的甲基化狀態在腫瘤組織和非腫瘤組織之間存在顯著的差異,只要檢測到STAMP-EP7基因序列區域存在異常高甲基化狀態,即可判定該受檢者屬于腫瘤高危人群。并且,STAMP-EP7呈現的這種在在腫瘤組織和非腫瘤組織之間存的顯著差異廣譜地存在于不同種類的腫瘤中,包括實體瘤以及非實體瘤。

因此,本發明提供了分離的多核苷酸,所述的多核苷酸,具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3(為SEQ ID NO:1的反向互補序列)所示的核苷酸序列,在腫瘤細胞內,該多核苷酸序列中多處5’-CpG-3’的堿基C位置上,生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。本發明也包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的多核苷酸的片段,且其中存在至少1個(如2~77個,更具體如3,5,10,15,20,25,30,40,50,60,70個)甲基化CpG位點。上述的多核苷酸或片段也可以應用于設計檢測試劑或檢測試劑盒。

在本發明的一些具體實施例中,所述的多核苷酸的片段例如是:包含SEQ ID NO:1中第281~309位堿基的片段(含有第017~020號CpG位點)。上述片段的反義鏈也是可用的。這些片段是本發明的較佳實施方式的舉例;根據本發明提供的信息,也可以選擇其它的片段。

此外,包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或序列片段的基因Panel或基因群組也被包含在本發明中。針對所述的基因Panel或基因群組,也可以通過DNA甲基化狀態檢測獲取正常細胞和腫瘤細胞的特征。

上述的多核苷酸可以作為基因組中人們分析甲基化狀態的關鍵區域,通過各種本領域已知的技術來分析它們的甲基化狀態。任何可用于分析甲基化狀態的技術均可被應用于本發明中。

上述的多核苷酸在經過亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽處理后,其中未發生甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶,而發生甲基化的胞嘧啶保持不變。

因此,本發明還提供了上述多核苷酸(包括其互補鏈(反義鏈))經過亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽處理后獲得的多核苷酸,包括:SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的多核苷酸。這些多核苷酸也可以應用于設計檢測試劑或檢測試劑盒。

本發明也包含上述多核苷酸或其反義鏈經過亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽處理后獲得的多核苷酸的片段,且其中存在至少1個甲基化CpG位點(如2~77個,更具體如3,5,10,15,20,25,30,40,50,60,70個)。反義鏈中各個CpG位點相應于正義鏈的編號是根據本發明所提供的內容易于獲得的。

檢測試劑及試劑盒

基于本發明的新發現,還提供了基于所述的多核苷酸序列設計的檢測試劑,用于體外檢測樣品中多核苷酸的甲基化譜式。本領域已知的確定基因組的序列、其變異及甲基化狀態的檢測方法和試劑均可被應用于本發明中。

因此,本發明提供了一種制備腫瘤檢測試劑的方法,包括:提供所述的多核苷酸,以所述多核苷酸的全長或片段作為靶序列,設計特異性檢測該靶序列的檢測試劑;其中,所述的靶序列中存在至少1個甲基化CpG位點。

本發明所述的檢測試劑包括但不限于:引物,探針,等等。

所述的試劑例如是引物對,在得知了多核苷酸的序列后,設計引物是本領域技術人員已知的,兩個引物在將被擴增的目標基因特定序列的兩側(包含CpG序列在內,與其中CpG互補為針對原為甲基化的基因區,而與其中TpG互補為針對原為去甲基化的基因區)。應理解,根據本發明的新發現,針對所述靶序列上的不同位置的CpG位點或其組合,本領域技術人員可以設計出多種引物或探針或其它類型的檢測試劑,這些均應被包含在本發明的技術方案中。在本發明的優選實施例中,所述的引物為:SEQ ID NO:5和6所示的引物,其可以獲得包含SEQ ID NO:1中001~025號CpG位點的擴增產物;或SEQ ID NO:7和8所示的引物,其可以獲得包含SEQ ID NO:1中026~077號CpG位點的擴增產物;或SEQ ID NO:9和10所示的引物,其可以獲得包含SEQ ID NO:1中017~020號CpG位點的擴增產物。

所述的試劑也可以是試劑組合(引物組合),包括多于一組的引物,從而可分別擴增上述的多條多核苷酸。

本發明還提供了體外檢測樣品中多核苷酸的甲基化譜式的試劑盒,該試劑盒包括:容器,以及位于容器中的上述引物對。

此外,所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、DNA純化、PCR擴增等所需的各種試劑。

此外,所述的試劑盒中還可包括使用說明書,其中標明檢測操作步驟和結果判定標準,以便于本領域技術人員應用。

檢測方法

測定多核苷酸的甲基化譜式可通過已有的技術(如甲基化特異性PCR(MSP)或實時定量甲基化特異性PCR,Methylight)來進行,或其它仍在發展中和將被開發出來的技術來進行。

檢測甲基化水平時也可使用定量甲基化特異性PCR(QMSP)的方法。這種方法是基于一種熒光PCR的持續性的光學監控,其較MSP方法更為敏感。其通量高并避免了用電泳方法對其結果進行分析。

其他可用的技術還有:焦磷酸測序法、重亞硫酸鹽轉化測序法、qPCR法、二代測序法、全基因組甲基化測序法、DNA富集檢測法、簡化亞硫酸氫鹽測序技術或HPLC法以及組合基因群組檢測法等該領域常規方法。應理解,在本發明的新揭示的基礎上,本領域公知的這些技術以及即將發展的一些技術,均可被應用于本發明中。

作為本發明的優選方式,還提供了一種體外檢測樣品中多核苷酸的甲基化譜式的方法。所述的方法基于的原理是:亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽可以將未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶,在后續的PCR擴增過程中轉變為胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變;因而,經過亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽處理多核苷酸后,甲基化的位點產生類似于一個C/T的多核苷酸多態性(SNP)?;谏鲜鲈韥龛b定檢測樣品中多核苷酸的甲基化譜式,可以有效區分出甲基化與非甲基化的胞嘧啶。

本發明所述的方法包括:包括:(a)提供樣品,提取基因組DNA;(b)利用亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽處理步驟(a)所述的基因組DNA,從而基因組DNA中未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶;(c)分析經步驟(b)處理的基因組DNA中是否存在甲基化譜式異常。

本發明的方法可用于:(i)對受試者樣品進行檢測,分析受試者是否患有腫瘤;(ii)區分腫瘤高危人群。所述的方法也可以是不以獲得直接的疾病診斷結果為目的的情形。

在本發明的優選實施例中,通過PCR擴增及焦磷酸測序法檢測DNA甲基化,本領域人員應理解,實際應用中并不限于該方法,其它DNA甲基化檢測方法亦可。在進行PCR擴增中,所應用的引物也不限于是實施例中所提供的。

由于基因組DNA經過重亞硫酸鹽處理后,非甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶,在后續的PCR過程中又轉換為胸腺嘧啶,會降低基因組的序列復雜度,使得PCR擴增出特異目標片段的難度增大。因此優選地可采用巢式PCR擴增,設計外圍與內圍兩對引物,進行兩輪PCR擴增反應,以第一輪的擴增產物作為第二輪擴增的模板,可以有效提高擴增的效率與特異性。然而應理解,本發明中可用的檢測方法并不限于此。

經過針對臨床樣本的研究驗證,本發明的方法用于診斷臨床腫瘤時,準確性非常高。本發明可應用于腫瘤輔助診斷、療效判定、預后監測等等領域,具有很高的臨床應用價值。

下面結合具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著,分子克隆實驗指南,第三版,科學出版社,2002中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1、針對STAMP-EP7檢測的核酸序列

本發明人經過廣泛的研究,獲得一種腫瘤標記物STAMP-EP7,其序列如下Seq ID NO:1(chr14:60951977-60952946,Human/hg19)所示,其中下劃線標示堿基為甲基化CpG位點,下劃線下面的數字表該位點的編號。

上述SEQ ID NO:1序列經重亞硫酸鹽處理后序列如下SEQ ID NO:2(其中Y代表C或U):

上述SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的反向互補序列如下SEQ ID NO:3:

上述SEQ ID NO:3序列經重亞硫酸鹽處理后序列如下SEQ ID NO:4(其中Y代表C或U):

實施例2、STAMP-EP7CpG位點在腫瘤細胞與非腫瘤細胞的甲基化差異—亞硫酸氫鹽處理后測序法(BSP-Bisulfite Sequencing PCR)

該亞硫酸氫鹽處理后測序法步驟如下:

1、提取肺癌細胞系A549與正常肺細胞系MRC5基因組DNA;

2、分別用重亞硫酸鹽處理提取的肺癌細胞系A549與正常肺細胞系MRC5基因組DNA,作為后續PCR擴增的模板;

3、根據SEQ ID NO:1的序列設計擴增引物(SEQ ID NO:5~8),常規方法設計引物進行擴增。

4、PCR擴增之后,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR片段特異性,切膠回收目的片段,連接插入T載體,轉化感受態大腸桿菌,涂菌板,第二天挑克隆測序,每個片段挑取大于10個克隆進行Sanger測序;

表1、BSP引物

圖1是SEQ ID NO:1區域中001~025甲基化位點肺癌細胞與正常肺細胞甲基化水平BSP驗證。結果顯示,肺癌細胞STAMP-EP7甲基化水平顯著高于正常肺細胞。

圖2是SEQ ID NO:1區域中026~077甲基化位點肺癌細胞與正常肺細胞甲基化水平BSP驗證。結果顯示,肺癌細胞STAMP-EP7甲基化水平顯著高于正常肺細胞。

實施例3、STAMP-EP7CpG位點在腫瘤細胞與非腫瘤細胞的甲基化差異—焦磷酸測序法(pyrosequencing)

該焦磷酸測序法步驟如下:

1.獲取臨床樣本:從臨床獲取癌旁/非癌-癌組織樣本,癌旁/非癌樣本作為對照組,癌組織樣本作為腫瘤檢測實驗組;

2.DNA提?。悍謩e提取實驗組和對照組DNA;本實驗用酚氯仿抽提法,但不限于該方法;

3.重亞硫酸鹽處理:以重亞硫酸鹽處理提取的DNA樣本,嚴格按照步驟操作;本實驗中用ZYMO Research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit,貨號D5006,但不限于該試劑盒;

4.引物設計:根據STAMP-EP7序列SEQ ID NO:1特點,設計PCR擴增引物與焦磷酸測序引物,檢測017~020號CpG位點的甲基化值,作為STAMP-EP7甲基化值的代表,PCR引物擴增序列、焦磷酸測序引物序列、焦磷酸測序上機檢測序列如SEQ ID NO 9~12所示,檢測位點列于表2;

5.PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳:以重亞硫酸鹽處理后的樣本作為PCR的模板,進行PCR擴增,擴增后的產物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增的特異性;

6.焦磷酸測序:通過QIAGEN公司的Pyro Mark Q96ID焦磷酸測序儀進行檢測,嚴格按照說明書步驟進行操作;

7.STAMP-EP7甲基化值計算:焦磷酸測序可以獨立檢測出目標區域內單個CpG位點的甲基化情況,計算所有CpG位點甲基化平均值作為STAMP-EP7在該樣本中的甲基化值;

8.結果分析:比較癌旁/非癌對照組與腫瘤實驗組STAMP-EP7甲基化值。

表2、Pyro引物

實施例4、STAMP-EP7:白血病臨床樣本驗證-焦磷酸測序法

從臨床獲取8例非白血病骨髓涂片樣本作為對照組,獲取8例白血病骨髓涂片樣本作為實驗組,按照實施例3的焦磷酸檢驗步驟,比較對照組與實驗組STAMP-EP7甲基化水平。

結果如圖3,顯示在白血病臨床樣本中,STAMP-EP7在實驗組中甲基化值顯著高于非癌組織。

實施例5、STAMP-EP7:乳腺癌臨床樣本驗證-焦磷酸測序法

從臨床獲取5例乳腺癌癌旁樣本作為對照組,獲取5例乳腺癌組織樣本作為實驗組,按照實施例3的焦磷酸檢驗步驟,比較對照組與實驗組STAMP-EP7甲基化水平。

結果如圖4,顯示在乳腺癌臨床樣本中,STAMP-EP7在實驗組中甲基化值顯著高于癌旁組織。

實施例6、STAMP-EP7:直腸癌臨床樣本驗證-焦磷酸測序法

從臨床獲取8例結直腸癌癌旁樣本作為對照組,獲取8例結直腸癌樣本作為實驗組,按照實施例3的焦磷酸檢驗步驟,分析STAMP-EP7甲基化水平。

結果如圖5,顯示在結直腸癌臨床樣本中,STAMP-EP7在實驗組中甲基化值顯著高于癌旁組織。

實施例7、STAMP-EP7:食管癌臨床樣本驗證-焦磷酸測序法

從臨床獲取10例食管癌癌旁樣本作為對照組,獲取10例食管癌樣本作為實驗組,按照實施例3的焦磷酸檢驗步驟,分析STAMP-EP7甲基化水平。

結果如圖6,顯示在食管癌臨床樣本中,STAMP-EP7在實驗組中甲基化值顯著高于癌旁組織。

實施例8、STAMP-EP7:肝癌臨床樣本驗證-焦磷酸測序法

從臨床獲取8例肝癌癌旁樣本作為對照組,獲取8例肝癌樣本作為實驗組,按照實施例3的焦磷酸檢驗步驟,分析STAMP-EP7甲基化水平。

結果如圖7,顯示在肝癌臨床樣本中,STAMP-EP7在實驗組中甲基化值顯著高于癌旁組織。

實施例9、STAMP-EP7:肺癌臨床樣本驗證-焦磷酸測序法

從臨床獲取4例肺癌癌旁樣本作為對照組,獲取4例肺癌樣本作為實驗組,按照實施例3的焦磷酸檢驗步驟,分析STAMP-EP7甲基化水平。

結果如圖8,顯示在肺癌臨床樣本中,STAMP-EP7在實驗組中甲基化值顯著高于癌旁組織。

實施例10、STAMP-EP7:胰腺癌臨床樣本驗證-焦磷酸測序法

臨床獲取4例胰腺癌癌旁樣本作為對照組,獲取4例胰腺癌樣本作為實驗組,按照實施例3的焦磷酸檢驗步驟,分析STAMP-EP7甲基化水平。

結果如圖9,顯示在胰腺癌臨床樣本中,STAMP-EP7在實驗組中甲基化值顯著高于癌旁組織。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解,在閱讀了本發明的上述講授內容之后,本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

序列表

<110> 上海奕譜生物科技有限公司

<120> 基于甲基化修飾的腫瘤標記物STAMP-EP7及其應用

<130> 192646

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 970

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

cgggccaagc ccaacgagcg cttcagaaat cgttgttgag tcggggcacg acttgaagtt 60

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<210> 2

<211> 970

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(970)

<223> y代表c或u

<400> 2

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<211> 970

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(970)

<223> y代表c或u

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<212> DNA

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