一種檢測NF1基因外顯子基因突變的引物及方法、試劑盒與流程

文檔序號:18145641發布日期:2019-07-10 11:47
一種檢測NF1基因外顯子基因突變的引物及方法、試劑盒與流程

本發明屬于分子生物學領域,特別是涉及檢測NF1基因第9-10,15-29,32-36號全外顯子基因突變的引物、方法和試劑盒。



背景技術:

NF1基因位于染色體17q11.2,全長約350kb,包含58個組成型外顯子和3個可變剪接外顯子。研究表明,NF1基因突變與Ⅰ型神經纖維瘤病(Neurofibromatosis 1,NF-1)有一定關聯。NF-1是一種常見的常染色體顯性遺傳病,外顯率高,發病率約為1/3000。NF-1通常出現在兒童時期,出生時或之后不久便伴有明顯的體征狀態,患兒在兒童期后基本表現出全部臨床癥狀。NF-1的臨床表現極具多樣性,并且許多癥狀的顯現時間具有特征性。幾乎所有NF-1患者在出生時或出生后最初幾年均表現出多發性牛奶咖啡斑,3-5歲時通常出現腋窩或腹股溝區雀斑樣色素沉著。約50%的NF-1患者可見簇狀神經纖維瘤,多發生于皮下或體內,引起畸形,累及內臟組織器官及內分泌異常,神經纖維瘤隨著年齡的增長而增加。多數患者骨骼生長異常和骨密度不足,導致骨骼畸形,主要表現為脊柱側凸,脊柱發育不良,弓形小腿等癥狀。此外,NF-1患兒思維能力受損,智力下降,并存在特定的學習障礙。因此,檢測NF1基因外顯子基因突變對于研究Ⅰ型神經纖維瘤病(NF-1)具有重要意義,有助于臨床上結合癥狀表現來研究和判斷病情。

NF1基因的長度長,復雜程度高,尤其第9-10,15-29,32-36號外顯子區域在基因組上存在多個同源區域(假基因)。通過對NF1基因的分段blast比對,得到同源區域的分布如圖1所示??梢钥闯?,這些同源區域分布廣,很多區域在基因組上存在多個同源區域,基因序列與NF1基因序列高度相似,使用普通的探針捕獲測序方法、Sanger測序法,均無法區分NF1基因序列和同源區域基因序列,難以滿足研究需求。

目前用于NF1基因突變檢測的主要方法有多重連接探針擴增技術(Multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA),高通量測序技術(Next generation sequencing,NGS)等。MLPA方法主要檢測的是NF1基因的拷貝數變異,而NGS方法普遍使用商業化捕獲探針等,無法有效的區分同源區域突變,從而限制了NF1基因突變的檢出率,并存在假陽性檢出的風險。此外,無論是MLPA或是NGS,都需配備價格昂貴的大型儀器設備,實驗條件要求高,導致檢測成本提升。

因此,本領域亟需提供一種可以有效的檢測NF1基因全外顯子序列,尤其是存在同源基因序列的區域的基因突變問題的檢測方法,使檢測結果分析不受NF1基因的突變多樣性以及基因組其他同源區域突變的影響。



技術實現要素:

本發明所要解決的技術問題之一在于,提供一組用于檢測NF1基因外顯子基因突變的引物。

本發明所要解決的技術問題之二在于,提供一種用于檢測NF1基因外顯子基因突變的方法。

為解決上述技術問題,一方面,本發明提供一組用于檢測NF1基因外顯子基因突變的引物,所述引物為5對長片段PCR引物,分別為:

擴增覆蓋檢測NF1基因第9-10號全外顯子的對正、反向引物,其核苷酸序列為:

NF1-L1-F:TACTGACTCGGCAACATGTGTAA(如SEQ ID NO.1所示),

NF1-L1-R:GATCTTAAAGGTCCTGCAATGCC(如SEQ ID NO.2所示);

擴增覆蓋檢測NF1基因第15-26號全外顯子的正、反向引物,其核苷酸序列為:

NF1-L2-F:TCCAGAGCTTCACAGTTTCTGCT(如SEQ ID NO.3所示),

NF1-L2-R:CACCTATGGAGTGCATGAGACCA(如SEQ ID NO.4所示);

擴增覆蓋檢測NF1基因第25-30號全外顯子的正、反向引物,其核苷酸序列為:

NF1-L3-F:TCCTGATTCAAGCACCAGAGAC(如SEQ ID NO.5所示),

NF1-L3-R:TACTATCCCTCCAGGCAGAACA(如SEQ ID NO.6所示);

擴增覆蓋檢測NF1基因第28-29號全外顯子的正、反向引物,其核苷酸序列為:

NF1-L4-F:TAAAGAATCAGTTAAGGGCCGGG(如SEQ ID NO.7所示),

NF1-L4-R:CTCTTTTGTTGTCCCTGGGTTTC(如SEQ ID NO.8所示);

擴增覆蓋檢測NF1基因第32-36號全外顯子的正、反向引物,其核苷酸序列為:

NF1-L5-F:TCCTGAGGTGTCGATATTTTGGG(如SEQ ID NO.9所示),

NF1-L5-R:GCAGCTACTAGATACCGACCATC(如SEQ ID NO.10所示);

本發明還提供一組用于檢測NF1基因外顯子基因突變的引物,所述引物為18對巢式引物,分別為:

NF1-exon9-F:GTAAAACGACGGCCAGTAGCTTGTTTGGGAAGGACTGTT(如SEQ ID NO.11所示),

NF1-exon9-R:CAGGAAACAGCTATGACGGTTCATTTCAGGCCCTAATTGC(如SEQ ID NO.12所示);

NF1-exon10-F:GTAAAACGACGGCCAGTTCTTCTGGCAGCTGGATTTTACT(如SEQ ID NO.13所示),

NF1-exon10-R:CAGGAAACAGCTATGACCAAATGAAGCCAAAAAGAACAGCA(如SEQ ID NO.14所示);

NF1-exon15-F:GTAAAACGACGGCCAGTAGACTTTGTGGCAAGTGAGACA(如SEQ ID NO.15所示),

NF1-exon15-R:CAGGAAACAGCTATGACTGTTAGGGTGACAAAATTTAGCACT(如SEQ ID NO.16所示);

NF1-exon16-F:GTAAAACGACGGCCAGTTCTCTGCTGTGCATGTGGTTTA(如SEQ ID NO.17所示),

NF1-exon16-R:CAGGAAACAGCTATGACTGCTGATTTGCCAGTCATTGTC(如SEQ ID NO.18所示);

NF1-exon17-F:GTAAAACGACGGCCAGTAATCTCCTTCAAGTTGGGGCAT(如SEQ ID NO.19所示),

NF1-exon17-R:CAGGAAACAGCTATGACCAACTCTGGGGCAGGAACTATT(如SEQ ID NO.20所示);

NF1-exon18-F:GTAAAACGACGGCCAGTGTCTTCCACCCTTGACTCTCAG(如SEQ ID NO.21所示),

NF1-exon18-R:CAGGAAACAGCTATGACGTGCTTTGAGGCAGACTGAGTA(如SEQ ID NO.22所示);

NF1-exon19,20-F:GTAAAACGACGGCCAGTCAGGGCTCTAAGTGCAGTAACT(如SEQ ID NO.23所示),

NF1-exon19,20-R:CAGGAAACAGCTATGACCTACTGGTACTTGCGATGTGGT(如SEQ ID NO.24所示);

NF1-exon21-F:GTAAAACGACGGCCAGTAGGTTTAATTCATGCTTTGCACA(如SEQ ID NO.25所示),

NF1-exon21-R:CAGGAAACAGCTATGACAGTTCCTAAGAGGCAAGCTGAC(如SEQ ID NO.26所示);

NF1-exon22,23-F:GTAAAACGACGGCCAGTTCTGTCTTCTGGGCATTGATGG(如SEQ ID NO.27所示),

NF1-exon22,23-R:CAGGAAACAGCTATGACTCCTCCTTTCTACCAATAACCGC(如SEQ ID NO.28所示);

NF1-exon24-F:GTAAAACGACGGCCAGTCATGTTGCTTGTTCCCTTCTGG(如SEQ ID NO.29所示),

NF1-exon24-R:CAGGAAACAGCTATGACGTCTCTGGTGCTTGAATCAGGA(如SEQ ID NO.30所示);

NF1-exon25-F:GTAAAACGACGGCCAGTAATCCATGGGTGGTTGAATCCA(如SEQ ID NO.31所示),

NF1-exon25-R:CAGGAAACAGCTATGACAGTGGTCCAAACAGCTTAGACA(如SEQ ID NO.32所示);

NF1-exon26,27-F:GTAAAACGACGGCCAGTCCCTGGCTGATTATCGCGAG(如SEQ ID NO.33所示),

NF1-exon26,27-R:CAGGAAACAGCTATGACGTGCCAACCACTTCCCTACA(如SEQ ID NO.34所示);

NF1-exon28,29-F:GTAAAACGACGGCCAGTGCGTAGGCCTCTCTTAATAGCTT(如SEQ ID NO.35所示),

NF1-exon28,29-R:CAGGAAACAGCTATGACAAATGCATGGAAAAAGGACAGGG(如SEQ ID NO.36所示);

NF1-exon32-F:GTAAAACGACGGCCAGTACCCATCTCATCCATGAGGTTTT(如SEQ ID NO.37所示),

NF1-exon32-R:CAGGAAACAGCTATGACAGGTAGTGTTTCTAACCTTCCCA(如SEQ ID NO.38所示);

NF1-exon33-F:GTAAAACGACGGCCAGTTGGGAAGGTTAGAAACACTACCT(如SEQ ID NO.39所示),

NF1-exon33-R:CAGGAAACAGCTATGACTCCTACTTCTTCCTTGTCCACAT(如SEQ ID NO.40所示);

NF1-exon34-F:GTAAAACGACGGCCAGTCAAGCCATGTTGGAAAGAGAGTG(如SEQ ID NO.41所示),

NF1-exon34-R:CAGGAAACAGCTATGACTCCTACGAATTGGCTGTTCTTCA(如SEQ ID NO.42所示);

NF1-exon35-F:GTAAAACGACGGCCAGTGTGGACTGTGAAGCTAAGGGTAA(如SEQ ID NO.43所示),

NF1-exon35-R:CAGGAAACAGCTATGACTGTTGTCTTCACTCCCTGGTAAG(如SEQ ID NO.44所示);

NF1-exon36-F:GTAAAACGACGGCCAGTAGCAAGGCCTTTTTCATCCATTC(如SEQ ID NO.45所示),

NF1-exon36-R:CAGGAAACAGCTATGACGCAGCTACTAGATACCGACCATC(如SEQ ID NO.46所示)。

本發明還提供一組用于檢測NF1基因外顯子基因突變的引物,包括:5對長片段PCR引物和18對巢式引物;

所述5對長片段PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~10所示;

所述18對巢式引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11~46所示。

進一步的,所述用于檢測NF1基因外顯子基因突變的引物,還包括:通用測序引物對M13,其核苷酸序列為:

M13F:GTAAAACGACGGCCAGT(如SEQ ID NO.47所示),

M13R:CAGGAAACAGCTATGAC(如SEQ ID NO.48所示)。

本發明還提供一種用于檢測NF1基因外顯子基因突變的試劑盒,該試劑盒包含前述的5對長片段PCR引物和18對巢式引物。

進一步的,所述試劑盒包含還包括通用測序引物對M13。

進一步的,所述試劑盒還包含用于所述5對長片段PCR引物擴增的長片段PCR反應體系;所述長片段PCR反應體系包括DNA聚合酶、緩沖液、dNTP混合物。

其中,所述DNA聚合酶優選KOD FX Neo聚合酶。

在一種具體實施方式中,所述長片段PCR反應體系中包括:終濃度為1X的PCR buffer for KOD FX Neo,終濃度為400μM的dNTP,終濃度為0.5U的KOD FX Neo聚合酶。

在一種具體實施方式中,所述長片段PCR反應體系中,5對長片段PCR引物NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3、NF1-L4、NF1-L5的正、反向引物濃度比均為1:1。

在一種具體實施方式中,所述長片段PCR反應體系中,NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3的正、反向引物終濃度均為0.15μM,NF1-L4、NF1-L5的正、反向引物終濃度均為0.3μM。

在一種具體的實施方式中,所述長片段PCR反應體系采用ddH20補齊至25μl。

進一步的,該試劑盒還包括用于所述18對巢式引物的巢式PCR反應體系;所述巢式PCR反應體系中的DNA聚合酶反應體系優選為DreamTaq Hot Start Green PCR Master Mix(2X)。

在一種具體實施方式中,所述巢式PCR反應體系中,18對巢式引物的正、反向引物的濃度比均為1:1。

在一種具體實施方式中,所述巢式PCR反應體系中,18對巢式引物的正、反向引物的終濃度均為0.2μM。

在一種具體的實施方式中,所述巢式PCR反應體系采用ddH20補齊至25μl。

為解決上述技術問題,另一方面,本發明還提供一種用于檢測NF1基因外顯子基因突變的方法,包括步驟:

(1)利用5對長片段PCR引物對DNA樣本分別進行擴增,獲得覆蓋檢測NF1基因第9-10,15-29,32-36號全外顯子的擴增產物;所述5對長片段PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~10所示;

(2)利用18對巢式PCR引物分別對步驟(1)中獲得的擴增產物進一步擴增,獲得包含檢測NF1基因第9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,32,33,34,35,36號外顯子的擴增產物;所述18對巢式PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11~46所示;

(3)將步驟(2)獲得的擴增產物分別進行正向或反向測序,獲得所述擴增產物的基因序列;

(4)將步驟(3)獲得的基因序列與野生型NF1基因序列進行比較,確定突變位點是否存在。

具體的,所述步驟(1)是在長片段PCR反應體系中進行擴增。長片段PCR反應體系包括DNA聚合酶,緩沖液,dNTP混合物。其中,DNA聚合酶優選Toyobo的KOD FX Neo聚合酶。

在一種具體實施方式中,所述長片段PCR反應體系中包括:終濃度為1X的PCR buffer for KOD FX Neo,終濃度為400μM的dNTP,終濃度為0.5U的KOD FX Neo聚合酶。

在一種具體實施方式中,所述長片段PCR反應體系中,5對長片段PCR引物NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3、NF1-L4、NF1-L5的正、反向引物濃度比均為1:1。

在一種具體實施方式中,所述長片段PCR反應體系中,NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3的正、反向引物終濃度均為0.15μM,NF1-L4、NF1-L5的正、反向引物終濃度均為0.3μM。

在一種具體的實施方式中,所述長片段PCR反應體系采用ddH20補齊至25μl。

在一種具體實施方式中,所述長片段PCR反應體系的反應條件中,NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3擴增的退火延伸的時間為約1min/kb(片段長度),NF1-L4、NF1-L5擴增的退火延伸的時間為約30s/kb(片段長度)。

在一種具體實施方式中,長片段PCR產物電泳檢測采用0.7%的瓊脂糖凝膠,電泳條件120V,40min。

具體的,所述步驟(2)中,先將步驟(1)得到的擴增產物稀釋后作為模板,再進行巢式PCR。在一種具體實施方式中,將長片段擴增產物稀釋1000~10000倍;優選的,將長片段擴增產物稀釋5000倍。使用25ng的DNA作為模板,進行長片段PCR時,反應體系中基因組的拷貝數約為300拷貝/μl,NF1基因中不同外顯子對應的同源區域數不同,其中exon22的同源區域最多,可達10個,即約3000拷貝/μl,但長片段PCR產物取1μl經過5000倍稀釋后,在巢式PCR反應體系中添加的該同源區域的拷貝數只有約0.6拷貝,其他外顯子對應的同源區域拷貝數更低,可基本忽略所有同源區域擴增的可能性。

在一種具體實施方式中,所述步驟(2)中,巢式PCR擴增的反應條件為95℃預變性3min,然后進行30個循環,每個循環為95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,隨后72℃延伸10min,最后置于4℃直至使用。

在一種具體實施方式中,所述步驟(2)中,巢式PCR擴增結束后,對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠濃度為2%,電泳條件設置為120V,30min。然后通過凝膠成像系統檢測是否獲得目標片段產物。經確認后的巢式PCR產物再按照常規方法進行步驟(3)Sanger測序。

具體的,所述步驟(3)中,進行正向或反向測序是采用Sanger測序。

優選的,所述步驟(2)中,18對巢式PCR引物中還加入了通用測序引物對M13,其核苷酸序列為:M13F:GTAAAACGACGGCCAGT(如SEQ ID NO.47所示);M13R:CAGGAAACAGCTATGAC(如SEQ ID NO.48所示)。該通用測序引物對M13用于Sanger測序。在后續Sanger測試不需額外設計或提供測序引物,大大簡化了操作流程。

利用NF1基因中具有特異性的序列,本發明設計了5對長片段PCR引物對,覆蓋了大部分NF1基因的同源區域。長片段PCR所用引物序列、目標片段長度及覆蓋目標區域如表1所示。反應體系中根據引物對擴增的片段長度不同,引物的濃度有所變化,擴增片段小于10kb,引物濃度使用0.3μM(終濃度),當擴增10kb以上的長鏈片段時,將引物濃度設定為0.15μM(終濃度)可提高擴增產量。

表1:長片段PCR所有引物列表

本發明中,PCR擴增時巢式引物對會結合在長片段PCR產物內部,使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。本發明設計的18對巢式引物中NF1-exon19,20,NF1-exon22,23,NF1-exon26,27,NF1-exon28,29這4對引物可同時擴增獲得兩個相連的全外顯子,所有引物對都加入了sanger測序的通用測序引物M13,后續sanger測試不需額外設計或提供測序引物,大大簡化了操作流程。其中,巢氏PCR所有引物序列、目標片段長度、覆蓋目標區域及對應長片段引物名稱如表2所示。

表2:巢氏PCR所有引物列表

NF1基因長度長,復雜程度高,在基因組上存在多個同源區域,使用一般方法檢測突變時會受到這些區域的干擾。本發明所公開的引物覆蓋了NF1基因第9-10,15-29,32-36號外顯子區域,包括了NF1基因大部分存在同源基因的區域,該引物用于檢測NF1基因能夠解決檢測NF1基因該區域外顯子突變的問題,且不受NF1基因的突變多樣性以及基因組其他同源區域基因突變的影響,提供了一種可靠性高,方便快捷,成本低廉的方法。

本發明通過長片段PCR引物及巢式PCR引物組合使用,可有針對性的對待檢測的外顯子進行準確突變分析,方法簡便,準確度高,成本低廉,對實驗人員及儀器設備的要求較低,適合于各種對NF1基因外顯子的突變檢測。

附圖說明

圖1為NF1基因的同源區域分布圖。

圖2為NF1-L2長片段PCR結果。

圖3為NF1-L3長片段PCR結果。

圖4為NF1-L1,NF1-L4,NF1-L5長片段PCR結果。

圖5為樣本1中NF1基因突變檢測結果,樣本為Chr17:29554233(GRCh37/hg19)位點T突變為G。

圖6為樣本2中NF1基因突變檢測結果,樣本為Chr17:29557361(GRCh37/hg19)位點插入突變GAGAGATGACCTCTCATTTTGCC。

圖7為樣本3中NF1基因突變檢測結果,樣本為Chr17:29586108(GRCh37/hg19)位點T缺失突變。

具體實施方式

下面將對本發明的技術方案進行清楚、完整的描述,顯然,所描述的實施例是本發明的一部分實施例,而不是全部的實施例?;诒景l明中的實施例,本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例,都屬于本發明保護的范圍。

實施例1

使用人細胞系DNA作為模板。

1.長片段PCR

表1:長片段PCR所用引物列表

長片段PCR擴增試劑選用KOD FX Neo DNA聚合酶(Toyobo KFX-201)。引物濃度根據不同引物的擴增產物長度不同有所調整,一般情況下,引物濃度使用0.3μM(終濃度)。擴增10kb以上的長鏈片段時,將引物濃度設定為0.15μM(終濃度)可提高擴增產量。所述引物濃度引物對NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3使用0.15μM,NF1-L4、NF1-L5使用0.3μM。

PCR反應體系:

所述的長片段PCR擴增的反應條件為94℃預變性2min,然后進行30個循環,每個循環為94℃變性15s,退火/延伸68℃,時間根據不同引物的擴增產物長度不同有所調整,當擴增產物片段長度>10kb時,退火延伸的時間為約1min/kb(片段長度),當擴增產物片段長度<10kb時,退火延伸的時間為約30s/kb(片段長度),優化后方案為NF1-L1為12min,NF1-L2為12min,NF1-L3為17min,NF1-L4為2min30s,NF1-L5為5min,然后置于4℃直至使用。

擴增結束后,對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠濃度為0.7%,電泳條件設置為120V,40min。然后通過凝膠成像系統檢測是否獲得目標片段產物。附圖2,附圖3,附圖4為長片段PCR產物電泳檢測結果。

2.巢式PCR

表2:巢氏PCR所有引物列表

為了避免原始基因組的NF1序列同源區域對巢式PCR的影響,將長片段擴增產物稀釋5000倍,取1μl作為巢式PCR模板。巢式PCR使用DreamTaq Hot Start Green PCR Master Mix(2X)(Thermo fisher K9021)。

反應體系:

所述的巢式PCR擴增的反應條件為95℃預變性3min,然后進行30個循環,每個循環為95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,隨后72℃延伸10min,最后置于4℃直至使用。

擴增結束后,對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠濃度為2%,電泳條件設置為120V,30min。然后通過凝膠成像系統檢測是否獲得目標片段產物。

經確認后的巢式PCR產物按照常規方法進行Sanger測序,檢測相關區域是否存在基因突變。

實施例2

使用本發明方法檢測三例血液DNA樣本NF1基因突變。這三例樣本經過高通量測序分析顯示NF1或其同源區域存在突變。樣本1疑似Chr17:29554233(GRCh37/hg19),T突變為G,該位點位于NF1內含子18-19的末2位。樣本2疑似Chr17:29557361(GRCh37/hg19),插入突變GAGAGATGACCTCTCATTTTGCC,該位點位于NF1外顯子23。樣本3疑似Chr17:29586108(GRCh37/hg19),T缺失,該位點位于NF1外顯子33。

由于高通量測序獲得讀長較短,常用于外顯子測序的只有雙端150bp讀長,不能準確分辨同源區域,因此高通量檢測到的位于同源區域的突變位點仍需另外一種方案進行確定。

采用本發明的方法,樣本1選用長片段NF1-L2及巢氏引物NF1-exon19,20,樣本2選用長片段NF1-L2及巢氏引物NF1-exon22,23,樣本3選用NF1-L5及巢氏引物NF1-exon33。

附圖5為樣本1Sanger測序結果,如圖中箭頭所示位置,顯示該樣本存在T>G雜合突變,與NGS結果一致,證實該突變確實存在。

附圖6為樣本2Sanger測序結果,如圖中箭頭所示位置,顯示該樣本存在插入GGAGAGATGACCTCTCATTTTGCC雜合突變,插入位點后Sanger測序結果出現疊峰,該結果與NGS結果一致,證實該突變確實存在。

附圖7為樣本3Sanger測序結果,如圖中箭頭所示位置,顯示該樣本存在缺失T雜合突變,缺失位點后Sanger測序結果出現疊峰,該結果與NGS結果一致,證實該突變確實存在。

采用本發明的方法能夠解決現有方法針對NF1基因的外顯子測序不能準確分辨同源區域的缺陷。本發明的檢測結果可靠性高,不受NF1基因的突變多樣性以及基因組其他同源區域基因突變的影響。

綜上所述,上述各實施例僅為本發明的較佳實施例而已,并不用以限定本發明的保護范圍,凡在本發明的精神和原則之內,所做的任何修改、等同替換、改進等,皆應包含在本發明的保護范圍內。

序列表

<110> 明碼(上海)生物科技有限公司

<120> 一種檢測NF1基因外顯子基因突變的引物及方法、試劑盒

<130> CPC-NP-19-101330

<160> 48

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 1

tactgactcg gcaacatgtg taa 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 2

gatcttaaag gtcctgcaat gcc 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 3

tccagagctt cacagtttct gct 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 4

cacctatgga gtgcatgaga cca 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 5

tcctgattca agcaccagag ac 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 6

tactatccct ccaggcagaa ca 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 7

taaagaatca gttaagggcc ggg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 8

ctcttttgtt gtccctgggt ttc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 9

tcctgaggtg tcgatatttt ggg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 10

gcagctacta gataccgacc atc 23

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 11

gtaaaacgac ggccagtagc ttgtttggga aggactgtt 39

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 12

caggaaacag ctatgacggt tcatttcagg ccctaattgc 40

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 13

gtaaaacgac ggccagttct tctggcagct ggattttact 40

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 14

caggaaacag ctatgaccaa atgaagccaa aaagaacagc a 41

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 15

gtaaaacgac ggccagtaga ctttgtggca agtgagaca 39

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物()

<400> 16

caggaaacag ctatgactgt tagggtgaca aaatttagca ct 42

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagttct ctgctgtgca tgtggttta 39

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物()

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caggaaacag ctatgactgc tgatttgcca gtcattgtc 39

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagtaat ctccttcaag ttggggcat 39

<210> 20

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<212> DNA

<213> 引物()

<400> 20

caggaaacag ctatgaccaa ctctggggca ggaactatt 39

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<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagtgtc ttccaccctt gactctcag 39

<210> 22

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<212> DNA

<213> 引物()

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caggaaacag ctatgacgtg ctttgaggca gactgagta 39

<210> 23

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<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagtcag ggctctaagt gcagtaact 39

<210> 24

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<212> DNA

<213> 引物()

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caggaaacag ctatgaccta ctggtacttg cgatgtggt 39

<210> 25

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<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagtagg tttaattcat gctttgcaca 40

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<212> DNA

<213> 引物()

<400> 26

caggaaacag ctatgacagt tcctaagagg caagctgac 39

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagttct gtcttctggg cattgatgg 39

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<211> 40

<212> DNA

<213> 引物()

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caggaaacag ctatgactcc tcctttctac caataaccgc 40

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<211> 39

<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagtcat gttgcttgtt cccttctgg 39

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<212> DNA

<213> 引物()

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caggaaacag ctatgacgtc tctggtgctt gaatcagga 39

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<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagtaat ccatgggtgg ttgaatcca 39

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<212> DNA

<213> 引物()

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caggaaacag ctatgacagt ggtccaaaca gcttagaca 39

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<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagtccc tggctgatta tcgcgag 37

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<212> DNA

<213> 引物()

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caggaaacag ctatgacgtg ccaaccactt ccctaca 37

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<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagtgcg taggcctctc ttaatagctt 40

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<212> DNA

<213> 引物()

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caggaaacag ctatgacaaa tgcatggaaa aaggacaggg 40

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<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagtacc catctcatcc atgaggtttt 40

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<212> DNA

<213> 引物()

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caggaaacag ctatgacagg tagtgtttct aaccttccca 40

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<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagttgg gaaggttaga aacactacct 40

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<212> DNA

<213> 引物()

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caggaaacag ctatgactcc tacttcttcc ttgtccacat 40

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<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagtcaa gccatgttgg aaagagagtg 40

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<212> DNA

<213> 引物()

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caggaaacag ctatgactcc tacgaattgg ctgttcttca 40

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<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagtgtg gactgtgaag ctaagggtaa 40

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<212> DNA

<213> 引物()

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caggaaacag ctatgactgt tgtcttcact ccctggtaag 40

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<212> DNA

<213> 引物()

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gtaaaacgac ggccagtagc aaggcctttt tcatccattc 40

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<212> DNA

<213> 引物()

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caggaaacag ctatgacgca gctactagat accgaccatc 40

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caggaaacag ctatgac 17

再多了解一些
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