一種快速檢測人所有23對染色體數目的試劑盒的制作方法

文檔序號:18145667發布日期:2019-07-10 11:47
一種快速檢測人所有23對染色體數目的試劑盒的制作方法

本發明涉及染色體的檢測,具體涉及一種快速檢測人所有23對染色體數目的試劑盒。



背景技術:

自然流產是指妊娠不足28周,胎兒體重不足1000g而自然終止者。其發病率約占臨床妊娠的10%~20%,其中80%為早期自然流產。導致自然流產的原因較多,如胚胎因素、母體因素、免疫功能異常和環境因素,其中胚胎染色體異常占50%以上,而在胚胎染色體異常中,胎兒染色體非整倍體異常占染色體異常胚胎的86%以上。不明原因的反復自然流產不僅給流產患者帶來了嚴重的身體創傷,而且對下一次妊娠結果的未知性,也使之飽受著無盡的焦慮。幫助流產患者找到病因,不僅可以避免不必要的檢查和治療,同時還可以有效地指導下一次妊娠,減輕精神壓力。

通過絨毛細胞培養和核型分析可以全面、直觀地判斷每條染色體數目和大的結構異常,客觀地反應胚胎的遺傳學信息,但流產組織多為陳舊標本,送檢時多已腐爛變質和污染,導致絨毛細胞培養失敗率高達10%~40%。因此,高成功率的分子診斷方法成為了流產物診斷的迫切需求。

近年來發展的染色體光譜核型分析(SKY)、CGH、單核苷酸多態性微陣列(SNP-array)等分子遺傳學技術實現了流產物全染色體異常的評估,但由于其檢測費用昂貴以及操作繁瑣,導致該類項目很難成為一種常規的篩查項目。MLPA技術用于染色體數目的檢測,大大降低了檢測成本和操作的難度,逐漸推動了該項目的檢測。但是,其也存在著一些缺點或不足,首先,MLPA技術需要PCR前處理,即探針連接步驟,該步驟決定了檢測結果的成功或失敗,而探針連接效率容易受DNA純度的影響,因此,在血液或羊水的檢測中往往比較穩定,而在流產物組織的檢測中,由于DNA純度往往較低,導致MLPA的連接效率不高,并最終可能產生無法判斷的結果。其次,MLPA的判斷較復雜,必須要有專門的軟件分析,無法得到直觀的檢測結果。

本申請發明人在之前的研究中,已開發出幾種常見染色體異常的重復序列分子標記(Rapid Diagnosis of Aneuploidy Using Segmental Duplication Quantitative Fluorescent PCR),并將其應用于21,18,13,X和Y染色體的數目檢測,但是,此研究僅是針對幾條常見染色體數目異常,而流產胎兒涉及人所有染色體的數目異常,因此,之前的檢測體系不能完全滿足臨床檢測的需要。

鑒于前期檢測方法學的不足,本發明人對該項目繼續研究,經過幾年的研究,通過大量的臨床篩選和驗證,開發出可用于檢測人所有23對染色體數目(22對常染色體和1對性染色體)異常的檢測體系。



技術實現要素:

本發明要解決的技術問題是提供一種快速檢測人所有23對染色體數目的試劑盒。該試劑盒可以在單個反應管中實現人22對常染色體,以及1對性染色體數目的快速檢測,且檢測結果準確、可靠、特異性強。

本發明所述的快速檢測人所有23對染色體數目的試劑盒,包括擴增檢測試劑,其特征在于:所述的擴增檢測引物由下述(1)-(16)所示的引物對組成:

(1)同時擴增22號染色體特異序列chr22-1與18號染色體特異序列chr18的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;

(2)同時擴增8號染色體特異序列chr8-1與17號染色體特異序列chr17的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;

(3)同時擴增14號染色體特異重復序列chr14與22號染色體特異重復序列chr22-2的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示;

(4)同時擴增21號染色體特異重復序列chr21-1與1號染色體特異重復序列chr1-1的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示;

(5)同時擴增16號染色體特異重復序列chr16與6號染色體特異重復序列chr6的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示;

(6)同時擴增21號染色體特異重復序列chr21-2與15號染色體特異重復序列chr15的引物對,其堿基序列分別如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示;

(7)同時擴增12號染色體特異重復序列chr12與20號染色體特異重復序列chr20的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示;

(8)同時擴增13號染色體特異重復序列chr13與5號染色體特異重復序列chr5的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示;

(9)同時擴增4號染色體特異重復序列chr4-1與9號染色體特異重復序列chr9的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示;

(10)同時擴增3號染色體特異重復序列chr3與4號染色體特異重復序列chr4-2的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示;

(11)同時擴增10號染色體特異重復序列chr10與19號染色體特異重復序列chr19的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示;

(12)同時擴增2號染色體特異重復序列chr2與11號染色體特異重復序列chr11的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示;

(13)同時擴增8號染色體特異重復序列chr8-2與7號染色體特異重復序列chr7的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示;

(14)同時擴增4號染色體特異重復序列chr4-3與X染色體特異重復序列chrX-1的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示;

(15)同時擴增Y號染色體特異重復序列chrY-1與X染色體特異重復序列chrX-2的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示;

(16)同時擴增1號染色體特異重復序列chr1-2與Y染色體特異重復序列chrY-2的引物對,它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示。

本發明技術方案中,各組引物的正向引物和反向引物中,至少有一個的5’端經過熒光標記??刹捎矛F有常規的熒光標記對各組引物的正向引物和/或反向引物進行熒光標記,如FAM、HEX、TAMRA、ROX、NED或VIC等。具體的,本發明所述試劑盒采用NED熒光標記SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23以及SEQ ID NO:25;采用FAM熒光標記SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29以及SEQ ID NO:31。

本發明所述技術方案中,每一對引物均可以同時擴增不同兩條染色體上的不同片段大小的特異序列,因此,本發明所述試劑盒可以實現在單個反應管中實現人1號、2號、3號、3號、4號、5號、6號、7號、8號、9號、10號、11號、12號、13號、14號、15號、16號、17號、18號、19號、20號、21號、22號、X染色體和Y染色體的數目進行檢測。此外,本發明所述技術方案中的每對引物均可單獨使用,也可以任意兩對以上組合使用,以實現不同的檢測需求。

本發明技術方案中,所涉及的各重復序列及其公開擴增引物如下述表1所示:

表1:

上述表1中的“序列編號”是指在本試劑盒或反應體系中給予的序列編號,同時,也是其在毛細管電泳中的片段大小排列順序;“序列所在染色體”是指擴增的序列具體位于其所在的兩條染色體;“擴增序列的名稱”是本試劑盒給予的檢測序列位點的名字或代碼;“擴增引物”是指本試劑盒中擴增對應重復序列所用到引物的名稱。

本發明試劑盒用于檢測染色體數目的原理如下:通過在染色體間特異重復序列(兩個相似序列)的兩端完全相同的DNA序列部位設計一對共同的擴增引物,避免了不同引物擴增不同序列產生的相互干擾或其它條件的干擾,從而保證了兩個序列(即為一個重復序列)擴增效率的一致性;再根據擴增產物的熒光信號的高度計算重復序列間的峰值比例,即通過定量重復序列間的熒光比值判斷兩條染色體之間拷貝數的變化。對于常染色體,正常樣本的重復序列的相對定量比值為2:2,即比值為1;而三體樣本的比值為3:2,即比值為1.5;對于性染色體的判斷,利用常染色體與X染色體進行比較,X染色體與Y染色體進行比較,以判斷性染色體的數目。

對于染色體數目的計算主要是根據兩個相似序列間的擴增產物熒光值的比例來計算,具體如下:

引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2用于擴增相似序列chr22-1與chr18,而擴增產物chr22-1與chr18間的相對量可以計算出22號和18號染色體的數目;

引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4用于擴增相似序列chr8-1與chr17,而擴增產物chr8-1與chr17間的相對量可以計算出8號和17號染色體的數目;

引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6用于擴增相似序列chr14與chr22-2,而擴增產物chr14與chr22-2間的相對量可以計算出14號和22號染色體的數目;

引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8用于擴增相似序列chr21-1與chr1-1,而擴增產物chr21-1與chr1-1間的相對量可以計算出21號和1號染色體的數目;

引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10用于擴增相似序列chr16與chr6,而擴增產物chr16與chr6間的相對量可以計算出16號和6號染色體的數目;

引物SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12用于擴增相似序列chr21-2與chr15,而擴增產物chr21-2與chr15間的相對量可以計算出21號和15號染色體的數目;

引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14用于擴增相似序列chr12與chr20,而擴增產物chr12與chr20間的相對量可以計算出12號和20號染色體的數目;

引物SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16用于擴增相似序列chr13與chr5,而擴增產物chr13與chr5間的相對量可以計算出13號和5號染色體的數目;

引物SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18用于擴增相似序列chr4-1與chr9,而擴增產物chr4-1與chr9間的相對量可以計算出4號和9號染色體的數目;

引物SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20用于擴增相似序列chr3與chr4-2,而擴增產物chr3與chr4-2間的相對量可以計算出3號和4號染色體的數目;

引物SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22用于擴增相似序列chr10與chr19,而擴增產物chr10與chr19間的相對量可以計算出10號和19號染色體的數目;

引物SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24用于擴增相似序列chr2與chr11,而擴增產物chr2與chr11間的相對量可以計算出2號和11號染色體的數目;

引物SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26用于擴增相似序列chr8-2與chr7,而擴增產物chr8-2與chr7間的相對量可以計算出8號和7號染色體的數目;

引物SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28用于擴增相似序列chr4-3與chrX,而擴增產物chr4-3與chrX間的相對量可以計算出4號和X染色體的數目;

引物SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30用于擴增相似序列chrY-1與chrX-2,而擴增產物chrY-1與chrX-2間的相對量可以計算出Y和X染色體的數目;

引物SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32用于擴增相似序列chr1-2與chrY-2,而擴增產物chr1-2與chrY-2間的相對量可以計算出1號和Y染色體的數目。

進一步的,本發明提供的試劑盒中優選還包括有分子量內標,采用熒光染料標記分子量內標,包括75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500等14個片段長度,使用時加入電泳混合液與待測樣本一起電泳,用于檢測等位基因的片段長度。

本發明技術方案中所述的重復序列是指不同的兩條染色體上的兩個大部分堿基序列相同的兩個DNA序列,在一些文獻中,也稱為相似序列或同源基因或同源序列等。

本發明所述的試劑盒還包括一些現有試劑盒中常規且必須的組分,如陽性對照模板、陰性對照模板、緩沖液、酶液、dNTP、Mg2+等。

與現有技術相比,本發明所述試劑盒可實現單管快速檢測人所有23對染色體數目,具有快速、簡便、準確、可批量化、應用廣泛、成本低廉等諸多優點。本發明所述試劑盒可用于檢測人外周血、羊水、胚胎、臍血以及絨毛等細胞組織中所有染色體的數目變化情況。

附圖說明

圖1為質控品(正常男性樣本)的電泳結果;其中,(a)為正常男性性染色體的電泳結果,(b)為正常男性22對常染色體的電泳結果;

圖2為質控品(正常女性樣本)的電泳結果;其中,(a)為正常女性性染色體的電泳結果,(b)為正常女性22對常染色體的電泳結果;

圖3為16-三體綜合征流產物胎兒樣本的電泳結果;其中,(a)為正常女性性染色體的電泳結果,(b)為16號染色體三體的電泳結果;

圖4為20-三體綜合征流產物胎兒樣本的電泳結果;其中,(a)為正常女性性染色體的電泳結果,(b)為20號染色體的電泳結果;

圖5為22-三體綜合征流產物胎兒樣本的電泳結果;其中,(a)為正常女性性染色體的電泳結果,(b)為22號染色體三體的電泳結果;

圖6為47,XXY流產物胎兒樣本的電泳結果;其中,(a)為性染色體為XXY的電泳結果,(b)為常染色體正常的的電泳結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳述,以更好地理解本發明的內容,但本發明并不限于以下實施例。

實施例1:采用本發明所述試劑盒對正常男性標本、正常女性標本、以及通過染色體核型分析驗證的4例已知核型標本進行檢測。

1、試劑盒的組成:

1.1試劑盒用于擴增的引物

本發明所述的快速檢測人所有23對染色體數目的試劑盒,包括16對引物,即32條引物,具體為SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:32。

在32條引物中,采用NED熒光標記SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23以及SEQ ID NO:25;采用FAM熒光標記SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29以及SEQ ID NO:31;其余的引物未進行標記。

本試劑盒中,一對引物可同時檢測兩條染色體的數目,其中,SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2用于檢測22號和18號染色體的數目;SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4用于檢測8號和17號染色體的數目;SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6用于檢測14號和22號染色體的數目;SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8用于檢測21號和1號染色體的數目;SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10用于檢測16號和6號染色體的數目;SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12用于檢測21號和15號染色體的數目;SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14用于檢測12號和20號染色體的數目;SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16用于檢測13號和5號染色體的數目;SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18用于檢測4號和9號染色體的數目;SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20用于檢測3號和4號染色體的數目;SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22用于檢測10號和19號染色體的數目;SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24用于檢測2號和11號染色體的數目;SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26用于檢測8號和7號染色體的數目;SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28用于檢測4號和X染色體的數目;SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30用于檢測Y號和X染色體的數目;SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32用于檢測1號和Y染色體的數目。

1.2其它組成成分:

Hotstar-Taq酶,緩沖液,dATP、dTTP、dCTP和dGTP以及Mg2+均購自天根生化科技(北京)有限公司。

2、PCR反應體系的配制:

按下述表2配制PCR反應體系:

表2:(mM表示mmol/L,μM表示μmol/L)

PCR反應體系為50uL。

3、樣本的來源及處理

樣本來源于經傳統染色體核型分析方法確定核型的DNA樣本,DNA樣本采用實驗室常規DNA提取方法進行提取,以雙蒸水稀釋至30ng/μL,并于-20℃保存備用。

4、PCR擴增程序:

PCR反應所用儀器為普通的PCR儀。PCR反應程序為:95℃預變性10min;95℃15sec,60℃30sec,72℃1min,30個循環;在72℃延伸30min;最后于15℃保溫備用。

5、毛細管電泳分析:將1uL PCR產物與23uL甲酰胺和1uL分子量標準品(Applied Biosystems)混合。該混合物在95℃下變性3分鐘,并放置在冰上,以防止重新退火,直到進一步分析。使用pop4凝膠(ABI)在ABI3130xl遺傳分析儀(Applied Biosystems)進行電泳分析。對PCR產物進行分離,采用GeneMapper ID軟件V3.2(Applied Biosystems)進行數據分析。分別統計SD-QF-PCR和染色體核型分析檢測結果,并進行比對分析。

6、結果檢測與分析:

對于22對常染色體的結果分析,當樣本為正常標本時,重復序列(相似序列)間的擴增量比值為2:2,即1:1的比值關系(檢測結果見圖1和圖2);而當目標染色體為三體時,其比值關系則為3:2,即為1.5:1的關系(檢測結果見圖3、圖4、圖5)。

對于性染色體,當樣本為正常男性標本時,4:X=2:1,Y:X=1:1,1:Y=2:1(檢測結果見圖1);當樣本為正常女性標本時,Y=0,4:X=2:2(檢測結果見圖2);當樣本為47,XXY樣本時,4:X=2:2,Y:X=2:1,1:Y=2:1的比值關系(檢測結果見圖6)。

實驗結果顯示,試劑盒的檢測體系能非常有效檢測出所舉例樣本染色體的數目,其它染色體的檢測方法和原理均與此相同,因此,本發明所述試劑盒能用于臨床標本的檢測。

SEQUENCE LISTING

<110> 孫雷

<120> 一種快速檢測人所有23對染色體數目的試劑盒

<130> 2019

<160> 32

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aggtaggttg acatcaatga aagaa 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cattgcagcc tcttccttgg 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagaaaccag gcaggaaaat gc 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actgagattc ctgtacaatt tcatc   25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

actcttggct taatttttcc ctcc 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tccacatatg tacaagcagc tc 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgggtcataa gaagggagta a 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggctggttgc caattttatt aga 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gttggaggag atcaagctca tta 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tagtagtaga gcaggctgac t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catagagagc tcctggtggg 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aaaagcaggt ctttggtggt g 21

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

agatacacca aactgttgat ggt 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcatacacct atttggtatc cagag 25

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccttgaaact tgggccacac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccatccagct ctggcagtta 20

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gattctaaga aattgtggta ggaaa 25

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctgcaaatga gctgtagcat 20

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tattttggag gatggaaagc ttgat 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cctcttgaat ctttctgttc ccatt 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gcttagaaag caacactact actat 25

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ctggccaaaa ggagacttgt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cttcttgggc acagctggat 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gaagcagaag caaaccctgc 20

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

acacttcccc taatctatcc ttca 24

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ctgtggccag tgtagttttg t 21

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gtatctgtgc ttcctgtgtc ta 22

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

agagagtgcc agttgatgag t 21

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

acagtctatc tcaaatgccc cc 22

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

aacttttcac atctggagct ttca 24

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gcatttagtc tagttaggag taacca 26

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

aaatagagtt catggccagg gt 22

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