可控自催化切割介導熒光恢復檢測hAAG的傳感器及方法與流程

文檔序號:18145639發布日期:2019-07-10 11:47
可控自催化切割介導熒光恢復檢測hAAG的傳感器及方法與流程

本公開屬于生物分析技術,涉及可控自催化切割介導熒光恢復檢測hAAG的傳感器及方法。



背景技術:

這里的陳述僅提供與本公開有關的背景信息,而不必然構成現有技術。

沃森-克里克堿基配對的DNA雙螺旋結構是生物體中重要的遺傳密碼。在現實中,由于雜環堿基(即A,T,G和C)含有大量的親核或氧化活性位點,因此容易與細胞外和內源性產生的親電子或活性氧反應產生大量DNA烷基化和氧化損傷(例如3-烷基腺嘌呤,7-烷基鳥嘌呤,1-N2-乙烯鳥嘌呤,1-N6-乙烯基腺嘌呤,次黃嘌呤等)。最近研究表明,烷基化和氧化損傷可通過阻礙聚合酶而抑制DNA復制或產生DNA突變,最終導致癌癥的發生。迄今為止,在人類細胞中,人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)是唯一能夠特異性識別和切除多種DNA烷基化和氧化損傷的糖基化酶,其功能的異常將導致烷基化DNA損傷修復機制的失靈,從而引發多種人類疾病(如慢性炎癥,克羅恩病和威爾森氏病)和癌癥(如結腸癌,肝癌,肺癌,子宮頸癌,膠質母細胞瘤,淋巴瘤,黑色素瘤和白血病)。

據本公開發明人所知,到目前為止,開發的用于hAAG測定的方法僅有基于放射磷(γ-32P)標記DNA底物的凝膠電泳法,基于辣根過氧化物酶偶聯的免疫球蛋白介導的免疫印跡分析法,以及基于修復反應分子信標介導的單分子計數法。但是,經本公開發明人研究,這些方法具有放射性污染,耗時耗力的操作,嚴格的反應條件、低準確性以及需要昂貴的抗體和精密的儀器等缺點。



技術實現要素:

為了解決現有技術的不足,本公開的目的是提供可控自催化切割介導熒光恢復檢測hAAG的傳感器及方法,可用于高效、靈敏地檢測人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)的活性。

為了實現上述目的,本公開的技術方案為:

一方面,一種基于可控自催化切割介導的熒光恢復檢測hAAG的傳感器,包括發夾探針1、發夾探針2、信號探針、人脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶(APE1)和T7核酸外切酶;

發夾探針1為5'-OH末端凸出的莖環結構的DNA,發夾探針1的5'-OH末端的莖修飾一個能夠被hAAG識別的2'-脫氧肌苷(I),2'-脫氧肌苷位于距離環3個堿基的位點處,發夾探針1含有觸發探針1,觸發探針1為2'-脫氧肌苷至3'末端的DNA序列,觸發探針1含有能夠和發夾探針2的第二DNA序列互補的第一DNA序列,第一DNA序列為2'-脫氧肌苷和與2'-脫氧肌苷配對的堿基位點之間的DNA序列;

發夾探針2為5'-OH末端凸出的莖環結構的DNA,發夾探針2由觸發探針2和第二DNA序列組成,第二DNA序列為5'-OH末端凸出的DNA序列,觸發探針2含有能夠與信號探針互補的第三DNA序列,第三DNA序列的一部分位于莖上,第三DNA序列的另一部分位于環上;

信號探針為單鏈DNA,信號探針兩端分別修飾熒光團和淬滅劑。

酶介導的循環信號擴增(CESA)是一種基于核酸酶,引入一個靶標能導致靶標依賴性核酸酶循環切割信號探針以輸出放大的信號,本公開選擇性地利用T7核酸外切酶來構建新的CESA系統,即基于可控自催化切割介導的熒光恢復,實現對hAAG活性的簡便、高靈敏和高特異的檢測。T7核酸外切酶(T7Exonuclease)是一種獨特的序列非依賴性核酸酶,它可以選擇性地催化單核苷酸從5'-磷?;?PO4)或5'-羥基(OH)末端或雙鏈DNA(dsDNA)的切口或缺口處起始消化,但不作用于單鏈DNA(ssDNA))。此外,T7核酸外切酶還可以沿5'到3'方向降解RNA/DNA雜交雙鏈上的RNA或DNA,但不能降解雙鏈或單鏈RNA。更重要的是,T7核酸外切酶可以高分辨率地區分單堿基錯配。

當在hAAG存在下,發夾探針1(HP1)在受損的2'-脫氧肌苷位點被特異性切割,從而導致發夾結構展開以產生DNA雙鏈體。構建在DNA雙鏈體中的觸發探針1(trigger 1)將通過粘性末端介導的鏈置換反應(TMSDR)與發夾探針2(HP2)部分雜交以誘導T7核酸外切酶催化HP2的第一次循環切割以釋放觸發探針2(trigger 2)。觸發探針2(trigger 2)的第三DNA序列與信號探針部分互補,進而誘導信號探針的第二次循環切割。通過兩步循環自催化切割過程,從熒光團-淬滅劑熒光共振能量轉移(FRET)對中釋放出大量的熒光分子,最終產生用于hAAG活性檢測的顯著增強的熒光信號,從而實現簡單、快速和靈敏的檢測。

另一方面,一種基于可控自催化切割介導的熒光恢復檢測hAAG的方法,提供上述傳感器;當hAAG存在時,hAAG與APE1在發夾探針1的2'-脫氧肌苷位點處特異性識別并切割發夾探針1,使得發夾探針1展開發夾結構,產生具有凸出的5'-OH和5'-dRP末端的dsDNA雙鏈體I,dsDNA雙鏈體I中突出的5'-dRP末端通過粘性末端介導的鏈置換反應,使觸發探針1的第一DNA序列與發夾探針2的第二DNA序列雜交,形成具有凹陷的5'-OH末端的dsDNA雙鏈體II,dsDNA雙鏈體II作為T7核酸外切酶的底物,在T7核酸外切酶的作用下,使發夾探針2中凹陷的5'-OH末端特異性水解,釋放觸發探針1并同時釋放出發夾探針2中的觸發探針2,釋放的觸發探針1與過量的發夾探針2雜交,誘導T7核酸外切酶催化發夾探針HP2的第一次循環切割以釋放多個觸發探針2,觸發探針2的第三DNA序列與信號探針雜交,形成具有凹陷的5'-OH末端的dsDNA雙鏈體III,dsDNA雙鏈體III作為T7核酸外切酶的底物,從凹陷的5'-OH末端對信號探針進行連續消化,從而釋放觸發探針2和熒光團,釋放的觸發探針2與游離的信號探針雜交以誘導T7核酸外切酶催化第二次循環切割信號探針,從而釋放出大量的熒光團,產生放大的熒光信號。

而當hAAG不存在情況下,不能識別發夾探針HP1中的2'-脫氧肌苷損傷位點,發夾探針HP1也不會被APE1切割。因此具有凸出的5'-OH末端的發夾探針HP1和HP2會阻礙T7核酸外切酶輔助的自催化再循環切割過程,無法產生增強的熒光信號。

第三方面,一種檢測hAAG的試劑盒,包括上述傳感器和緩沖溶液。

本公開的有益效果為:

1.本公開基于可控自催化切割介導的熒光恢復來高靈敏和高特異地檢測人類烷基腺嘌呤DNA糖基化酶活性,實現了熒光信號的兩步放大,具有超高的靈敏度和較高的分辨率,本公開的檢出限為4.9×10-6個單位每微升,靈敏度的檢測范圍為1×10-5~0.1個單位每微升的4個數量級,因此本公開可以高效、靈敏地檢測人類烷基腺嘌呤DNA糖基化酶的活性。

2.本公開利用DNA修復系統的高精確性和T7核酸外切酶對單堿基錯配的高分辨率,只有hAAG可以在2'-脫氧肌苷位點處特異性識別和切除發夾底物,從而誘導T7核酸外切酶輔助的自催化再循環熒光信號放大,較高的信噪比保證了本公開的高特異性。

3.本公開不需要繁瑣的洗滌、轉移、分離步驟,不涉及任何熱循環,大大簡化了檢測程序。

附圖說明

構成本公開的一部分的說明書附圖用來提供對本公開的進一步理解,本公開的示意性實施例及其說明用于解釋本公開,并不構成對本公開的不當限定。

圖1為本公開實施例1的原理圖;

圖2為實施例1原理驗證的表征圖,A為非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對在不同實驗條件下hAAG引導的發夾底物切割反應產物的分析圖,泳道M是DNA標記(DNA marker),泳道1為合成的發夾探針HP1的裂解產物,泳道2為合成的觸發探針1,泳道3為合成的發夾探針HP1,泳道4為在APE1+HP1存在下的反應產物,泳道5為在hAAG+APE1+HP1存在下的反應產物,B為用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對T7核酸外切酶輔助自催化再循環切割反應產物的分析圖,泳道M是DNA標記(DNA marker),泳道1為在hAAG不存在下的反應產物,泳道2為合成的觸發探針2,泳道3為在hAAG存在下的反應產物,該表征圖中采用SYBR Gold作為熒光指示劑,hAAG和APE1的濃度分別為0.1個單位每微升和0.3個單位每微升;

圖3為實施例1的靈敏度表征圖,A為不同濃度(0、1×10-5U/μL、5×10-5U/μL、2.5×10-4U/μL、5×10-4U/μL、2.5×10-3U/μL、5×10-3U/μL、2.5×10-2U/μL、1×10-1U/μL)的hAAG的熒光光譜的變化曲線,B為熒光強度隨hAAG濃度從1×10-5U/μL到0.1U/μL的變化曲線,圖B插圖為在1×10-5U/μL到0.1U/μL的范圍內,熒光強度與hAAG濃度的對數之間的線性關系,誤差棒表示三次獨立實驗的標準偏差。

圖4為實施例1的特異性實驗表征圖,在對照(僅反應緩沖液),0.1g/L BSA,0.1g/L IgG,0.1U/μLhOGG1和0.1U/μLhAAG存在下的熒光強度的變化柱狀圖,誤差棒表示三次獨立實驗的標準偏差。

具體實施方式

應該指出,以下詳細說明都是示例性的,旨在對本公開提供進一步的說明。除非另有指明,本文使用的所有技術和科學術語具有與本公開所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同含義。

需要注意的是,這里所使用的術語僅是為了描述具體實施方式,而非意圖限制根據本公開的示例性實施方式。如在這里所使用的,除非上下文另外明確指出,否則單數形式也意圖包括復數形式,此外,還應當理解的是,當在本說明書中使用術語“包含”和/或“包括”時,其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

本公開提出了可控自催化切割介導熒光恢復檢測hAAG的傳感器及方法,可用于高效、靈敏地檢測人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)的活性。

本公開的一種典型實施方式,提供了一種基于可控自催化切割介導的熒光恢復檢測hAAG的傳感器,包括發夾探針1、發夾探針2、信號探針、人脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶(APE1)和T7核酸外切酶;

發夾探針1為5'-OH末端凸出的莖環結構的DNA,發夾探針1的5'-OH末端的莖修飾一個能夠被hAAG識別的2'-脫氧肌苷(I),2'-脫氧肌苷位于距離環3個堿基的位點處,發夾探針1含有觸發探針1,觸發探針1為2'-脫氧肌苷至3'末端的DNA序列,觸發探針1含有能夠和發夾探針2的第二DNA序列互補的第一DNA序列,第一DNA序列為2'-脫氧肌苷和與2'-脫氧肌苷配對的堿基位點之間的DNA序列;

發夾探針2為5'-OH末端凸出的莖環結構的DNA,發夾探針2由觸發探針2和第二DNA序列組成,第二DNA序列為5'-OH末端凸出的DNA序列,觸發探針2含有能夠與信號探針互補的第三DNA序列,第三DNA序列的一部分位于莖上,第三DNA序列的另一部分位于環上;

信號探針為單鏈DNA,信號探針兩端分別修飾熒光團和淬滅劑。

當在hAAG存在下,發夾探針1(HP1)在受損的2'-脫氧肌苷位點被特異性切割,從而導致發夾結構展開以產生DNA雙鏈體。構建在DNA雙鏈體中的觸發探針1(trigger 1)將通過粘性末端介導的鏈置換反應(TMSDR)與發夾探針2(HP2)部分雜交以誘導T7核酸外切酶催化HP2的第一次循環切割以釋放觸發探針2(trigger 2)。觸發探針2(trigger 2)的第三DNA序列與信號探針部分互補,進而誘導信號探針的第二次循環切割。通過兩步循環自催化切割過程,從熒光團-淬滅劑熒光共振能量轉移(FRET)對中釋放出大量的熒光分子,最終產生用于hAAG活性檢測的顯著增強的熒光信號。從而實現簡單、快速和靈敏的檢測。

該實施方式的一種或多種實施例中,所述熒光團和淬滅劑分別修飾在信號探針的5'末端和3'末端。

該實施方式的一種或多種實施例中,所述熒光團為FAM,所述淬滅劑為BHQ1。

該實施方式的一種或多種實施例中,發夾探針1的序列為:5'-GTA GTG AGG TAG GTT GTA TIG TTG GGT TGA ACT ATA CAA CCT ACC-3'(其中下劃線堿基I為2'-脫氧肌苷)

發夾探針2的序列為:5'-TGT ATA GTT CAA CCC GGG ACC TAA GAG CAT TCT ACA CCT CTT AGG TCC CTG C-3'

信號探針的序列為:5'-AAG AGG TGT A-3'。

本公開的另一種實施方式,提供了一種基于可控自催化切割介導的熒光恢復檢測hAAG的方法,提供上述傳感器;當hAAG存在時,hAAG與APE1在發夾探針1的2'-脫氧肌苷位點處特異性識別并切割發夾探針1,使得發夾探針1展開發夾結構,產生具有凸出的5'-OH和5'-dRP末端的dsDNA雙鏈體I,dsDNA雙鏈體I中突出的5'-dRP末端通過粘性末端介導的鏈置換反應,使觸發探針1的第一DNA序列與發夾探針2的第二DNA序列雜交,形成具有凹陷的5'-OH末端的dsDNA雙鏈體II,dsDNA雙鏈體II作為T7核酸外切酶的底物,在T7核酸外切酶的作用下,使發夾探針2中凹陷的5'-OH末端特異性水解,釋放觸發探針1并同時釋放出發夾探針2中的觸發探針2,釋放的觸發探針1與過量的發夾探針2雜交,誘導T7核酸外切酶催化發夾探針HP2的第一次循環切割以釋放多個觸發探針2,觸發探針2的第三DNA序列與信號探針雜交,形成具有凹陷的5'-OH末端的dsDNA雙鏈體III,dsDNA雙鏈體III作為T7核酸外切酶的底物,從凹陷的5'-OH末端對信號探針進行連續消化,從而釋放觸發探針2和熒光團,釋放的觸發探針2與游離的信號探針雜交以誘導T7核酸外切酶催化第二次循環切割信號探針,從而釋放出大量的熒光團,產生放大的熒光信號。

而當hAAG不存在情況下,不能識別發夾探針HP1中的2'-脫氧肌苷損傷位點,發夾探針HP1也不會被APE1切割。因此具有凸出的5'-OH末端的發夾探針HP1和HP2會阻礙T7核酸外切酶輔助的自催化再循環切割過程,無法產生增強的熒光信號。

該實施方式的一種或多種實施例中,其步驟為:

(1)將發夾探針1加入至含有hAAG、10×ThermoPol反應緩沖液、APE1、10×NEBuffer4的第一溶液中加熱孵育;

(2)將步驟(1)的物料添加至含有發夾探針2、信號探針、T7核酸外切酶、10×NEBuffer4的第二溶液中進行孵育;

(3)對步驟(2)孵育后的物料進行熒光檢測。

該系列實施例中,步驟(1)中孵育條件:溫度為37±0.5℃,時間為60~90min。

該系列實施例中,步驟(1)的第一溶液中,APE1的濃度為0.3個單位每微升;每20微升第一溶液含有2微升10×ThermoPol反應緩沖液、2微升10×NEBuffer 4。

該系列實施例中,步驟(1)中,發夾探針1的溶液與第一溶液的體積比為1:9.5~10.5,發夾探針1的溶液中發夾探針1的濃度為1微摩爾每升。

該系列實施例中,步驟(2)中孵育條件:溫度為25±0.5℃,時間為50~60min。

該系列實施例中,步驟(2)的第二溶液中,發夾探針2的濃度為250納摩爾每升,信號探針的濃度為700納摩爾每升,T7核酸外切酶的濃度為15個單位每20微升,每20微升第二溶液含有2微升10×NEBuffer 4。

該系列實施例中,步驟(2)中,步驟(1)的物料與第二溶液的體積比為1:4.5~5.5。

該系列實施例中,步驟(3)中,檢測激發波長為491nm,發射波長為520nm。

為了使發夾探針1、2孵育成莖環結構,該實施方式的一種或多種實施例中,采用雜交緩沖液將單鏈發夾探針1和/或單鏈發夾探針2稀釋,再加熱至95℃孵育5min,然后冷卻至室溫,單鏈發夾探針1和/或單鏈發夾探針2形成莖環結構。

本公開的第三種實施方式,提供了一種檢測hAAG的試劑盒,包括上述傳感器和緩沖溶液。

本公開設計了兩個發夾探針(即HP1和HP2),都具有突出的5'-OH末端,為了有效防止T7核酸外切酶的消化。在發夾探針HP1中,在莖上距離環3個堿基的位點處修飾一個2'-脫氧肌苷(I),該損傷位點可以被hAAG識別。信號探針是包含10nt的DNA序列,分別在5'和3'末端修飾熒光團(FAM)和淬滅劑(BHQ1),其中FAM的熒光通過熒光能量共振轉移(FRET)被BHQ1淬滅。T7核酸外切酶是該CESA系統的“核心”,負責自催化循環信號放大的運行。本公開主要包括兩個連續的反應步驟:(1)在hAAG和APE1存在下,特異性切割發夾探針HP1上的2'-脫氧肌苷位點,(2)T7核酸外切酶輔助的自催化循環信號放大。在hAAG存在下,它可以在2'-脫氧肌苷位點處特異性識別和切割發夾探針HP1,并展開發夾結構,同時產生具有凸出的5'-OH和5'-dRP(脫氧核糖磷酸)末端的dsDNA雙鏈體(I)。dsDNA雙鏈體(I)中突出的5'-dRP末端(即觸發探針1)將通過粘性末端介導的鏈置換反應(TMSDR)與發夾探針HP2莖部分雜交,形成具有凹陷的5'-OH末端的dsDNA雙鏈體(II)。這個新形成的dsDNA雙鏈體(II)可以作為T7核酸外切酶的底物,然后從HP2中凹陷的5'-OH末端特異性水解,釋放觸發探針1并同時釋放出HP2中的觸發探針2。由于信號探針與觸發探針2部分區域互補,釋放的觸發探針2將與信號探針雜交形成具有凹陷的5'-OH末端的dsDNA雙鏈體(III),其可以再次作為T7核酸外切酶的底物,然后從凹陷的5'-OH末端對信號探針進行連續消化,最終dsDNA雙鏈體(III)中的信號探針被選擇性降解以釋放FAM分子,同時觸發探針2保持完整而從dsDNA(III)中釋放。在自催化切割過程中,由于發夾探針HP1和HP2中的5'-OH末端保持凸出狀態,所以dsDNA雙鏈體中的觸發探針1和觸發探針2可免受T7核酸外切酶的切割。因此,釋放的觸發探針1可以與過量的發夾探針HP2部分雜交以誘導T7核酸外切酶催化發夾探針HP2的第一次循環切割以釋放多個觸發探針2,而釋放的觸發探針2可以與游離的信號探針雜交以誘導T7核酸外切酶催化第二次循環切割信號探針,釋放出大量的FAM分子。通過兩步循環自催化切割過程,最終大量的熒光團分子(即FAM)從信號探針中釋放出來,產生顯著放大的熒光信號。相反,在hAAG不存在情況下,發夾探針HP1不能被APE1在2'-脫氧肌苷位點處切割。因此具有凸出的5'-OH末端的發夾探針HP1和HP2可以阻礙T7核酸外切酶輔助的自催化再循環切割過程,導致無法檢測到增強的熒光信號。利用體內DNA修復機制的高精度,T7核酸外切酶催化單核苷酸水解的高特異,以及自催化再循環擴增反應的高效率,本公開的方法可用于簡便、有效地檢測hAAG活性。

為了使得本領域技術人員能夠更加清楚地了解本公開的技術方案,以下將結合具體的實施例詳細說明本公開的技術方案。

實施例1

DNA修復控制T7核酸外切酶輔助的自催化循環信號放大:在進行擴增反應之前,用1×Tris-EDTA緩沖溶液(10毫摩爾每升的三羥甲基氨基甲烷(Tris),1毫摩爾每升的乙二胺四乙酸(EDTA),pH 8.0)將所有合成的寡核苷酸溶解制備儲備溶液,保存在-20攝氏度,然后用雜交緩沖液(1.5毫摩爾每升的氯化鎂,10毫摩爾每升的三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl),pH 8.0)將發夾探針(即HP1和HP2)稀釋至1微摩爾每升,并在95攝氏度下孵育5分鐘,然后緩慢冷卻至室溫以形成發夾結構。hAAG活性的測定包括兩個連續的反應步驟。首先,將體積為2微升的HP1(1微摩爾每升)加入切除反應系統(20微升)中,包括hAAG,2微升10×ThermoPol反應緩沖液,0.3個單位每微升(U/μL)APE1,2微升10×NEBuffer 4,在37攝氏度溫育60分鐘。其次,將5微升上述切除產物加入到擴增反應系統(20微升)中,包括250納摩爾每升HP2,700納摩爾每升信號探針,15個單位的T7核酸外切酶,2微升10×NEBuffer 4,在25攝氏度下孵育50分鐘,在避光的條件下以進行T7核酸外切酶輔助的自催化再循環擴增反應。

熒光測量和凝膠電泳分析:首先用超純水將20微升擴增產物稀釋至60微升,然后在491nm的激發波長下,通過HitachiF-7000熒光分光光度計(東京,日本)在505-620nm的范圍內掃描熒光光譜,記錄520nm處的熒光強度以用于數據分析。為了分析切除產物和擴增產物,在室溫110V恒定電壓下,在1×TBE緩沖液(9納摩爾每升Tris-HCl,9毫摩爾每升硼酸,0.2毫摩爾每升EDTA,pH 7.9)中進行12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析,以SYBR Gold作為熒光指示劑,電泳時間為45分鐘,并用ChemiDoc MP成像系統(Hercules,California,U.S.A)分析。

發夾探針1的序列為:5'-GTA GTG AGG TAG GTT GTA TIG TTG GGT TGA ACT ATA CAA CCT ACC-3'(其中,堿基I為2'-脫氧肌苷),SEQ ID NO.1

發夾探針2的序列為:5'-TGT ATA GTT CAA CCC GGG ACC TAA GAG CAT TCT ACA CCT CTT AGG TCC CTG C-3',SEQ ID NO.2

信號探針的序列為:5'-AAG AGG TGT A-3'(其中5'和3'末端分別修飾了熒光團FAM和淬滅劑BHQ1),SEQ ID NO.3

切割片段的序列為:5'-GTA GTG AGG TAG GTT GTA T-3',SEQ ID NO.4

觸發探針1的序列為:5'-GTT GGG TTG A AC TAT ACA ACC TAC C-3',SEQ ID NO.5

實驗原理如圖1所示,該實施例設計了兩個發夾探針(即HP1和HP2)并且兩者都有突出的5'-OH末端,在發夾探針HP1中,在莖上距離環3個堿基的位點處修飾一個2'-脫氧肌苷(I)損傷位點,該損傷位點可以被hAAG的識別。在hAAG存在下,它將在2'-脫氧肌苷(I)位點處特異性識別和切割發夾探針HP1,導致發夾結構展開,同時產生具有凸出的5'-OH和5'-dRP末端的dsDNA雙鏈體(I)(形成的dsDNA雙鏈體(I)中具有突出的5'-dRP末端一條鏈將部分與發夾探針HP2上的部分區域互補)。通過粘性末端介導的鏈置換反應(TMSDR),形成具有凹陷的5'-OH末端的dsDNA雙鏈體(II)。這種新形成的dsDNA雙鏈體(II)可以作為T7核酸外切酶的底物,然后從HP2中凹陷的5'-OH末端特異性水解,釋放觸發探針1并同時釋放出HP2中的觸發探針2。由于信號探針與觸發探針2部分區域互補,釋放的觸發探針2將與信號探針雜交形成具有凹陷的5'-OH末端的dsDNA雙鏈體(III),其可以再次作為T7核酸外切酶的底物,然后從凹陷的5'-OH末端連續消化信號探針,最終dsDNA雙鏈體(III)中的信號探針被選擇性降解以釋放FAM分子,同時觸發探針2保持完整而從dsDNA(III)中釋放。通過兩步循環自催化裂解過程,最終從信號探針中釋放出大量的熒光分子(即FAM),產生顯著放大的熒光信號。相反,在hAAG不存在情況下,不能識別發夾探針HP1中的2'-脫氧肌苷損傷位點,發夾探針HP1也不會被APE1切割。因此具有凸出的5'-OH末端的發夾探針HP1和HP2會阻礙T7核酸外切酶輔助的自催化再循環切割過程,無法產生增強的熒光信號。

原理的實驗驗證

為了驗證本公開的可行性,本實施例選用非變性凝膠電泳來分析產物。如圖2A所示,在APE1+HP1存在的情況下,僅觀察到與單獨發夾探針HP1(45nt)(圖2A,泳道3)同一位置的一條帶(圖2A,泳道4),這表明無hAAG不能誘導發夾探針HP1的切割。在hAAG+APE1+HP1存在的情況下,檢測到19nt和25nt的特征帶(圖2A,泳道5),這正是19nt裂解產物(圖2A,泳道1)和25nt觸發探針1(圖2A,泳道2)的大小,證明hAAG可以特異性地切除2'-脫氧肌苷并誘導APE1介導的HP1切割以產生兩個短DNA片段(即19nt裂解產物和25nt觸發探針1)。此外,為了研究T7核酸外切酶輔助的自催化再循環切割過程,取5μL上述切割產物(圖2A,泳道4和5)加入到含有HP2,信號探針和T7核酸外切酶的20μL擴增反應系統中,進行自催化循環切割反應。在反應終止后,進一步使用非變性凝膠電泳來分析反應產物。如圖2B所示,在不存在hAAG的情況下,僅檢測到HP2的條帶(52nt),這意味著沒有發生切割反應(圖2B,泳道1)。在存在hAAG的情況下,另一個特征帶(25nt)被觀察到(圖2B,泳道3),它們與合成的觸發探針1(25nt)的大小完全一致(圖2B,泳道2)。實驗結果表明25nt觸發探針1(即hAAG和APE1催化的HP1的裂解產物)可以通過TMSDR與HP2部分雜交以啟動T7核酸外切酶催化的HP2再循環切割以釋放大量的觸發探針2(25nt,圖2B,泳道3)。因此,上述凝膠電泳實驗(圖2A和圖2B)清楚地證明了hAAG和APE1可以催化發夾探針HP1在2'-脫氧肌苷位點處的切割以產生25nt觸發探針1,其可以成功誘導隨后的T7核酸外切酶輔助的自催化再循環HP2切割,釋放觸發探針1。更重要的是,在APE1+HP1(圖2A,泳道4),hAAG+APE1+HP1(圖2A,泳道5)和hAAG+APE1+T7核酸外切酶+HP1+HP2(圖2B,泳道3)存在的情況下,沒有顯示額外的條帶,證明DNA修復控制的T7核酸外切酶輔助自催化再循環擴增的高特異性,無非特異性DNA片段產生。高特異性可歸因于這三個因素:(1)體內DNA修復機制的高準確性,(2)hAAG催化的2'-脫氧肌苷切除的高特異性,和(3)T7核酸外切酶催化的單堿基錯配的高分辨率。

靈敏度實驗

在最佳實驗條件下,評估本公開檢測人類烷基腺嘌呤DNA糖基化酶活性的靈敏度,本實施例對其進行不同濃度的分析測定,結果如圖3所示。隨著hAAG濃度從1×10-5U/μL增加到0.1U/μL,熒光強度相應增強,這表明熒光信號的增強高度依賴于hAAG的濃度。熒光強度與hAAG濃度的對數在一定濃度范圍內呈現出良好的線性關系,線性回歸方程式為F=5137.9+901.8log10C,相關系數為0.9942,其中F代表熒光強度,C代表hAAG濃度(U/μL),計算出檢測限低至4.9×10-6U/μL。

特異性實驗

為了證實本公開的良好選擇性,本實施例對非特異性蛋白質(例如牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白G(IgG)),8-氧鳥嘌呤-DNA糖基化酶(hOGG1))和hAAG的熒光強度進行了比較。如圖4所示,在BSA、IgG和hOGG1以及反應緩沖液存在下僅觀察到微弱的熒光信號。只有在hAAG存在情況下,可以檢測到高的熒光信號。實驗結果表明,只有hAAG可以在2'-脫氧肌苷位點特異性識別和切除發夾底物(即發夾探針HP1),以誘導T7核酸外切酶輔助的自催化再循環信號放大。因此,本公開可以抵抗其他蛋白的干擾,具有很好的特異性。

以上所述僅為本公開的優選實施例而已,并不用于限制本公開,對于本領域的技術人員來說,本公開可以有各種更改和變化。凡在本公開的精神和原則之內,所作的任何修改、等同替換、改進等,均應包含在本公開的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東師范大學

<120> 可控自催化切割介導熒光恢復檢測hAAG的傳感器及方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtagtgaggt aggttgtati gttgggttga actatacaac ctacc 45

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgtatagttc aacccgggac ctaagagcat tctacacctc ttaggtccct gc 52

<210> 3

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagaggtgta 10

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtagtgaggt aggttgtat 19

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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