基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒的制作方法

文檔序號:18145660發布日期:2019-07-10 11:47
基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒的制作方法

本發明涉及一種腫瘤診斷試劑盒,具體涉及一種基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒。



背景技術:

Von Hippel-Lindau(VHL)疾病(OMIM 193300)是一種常染色體顯性遺傳綜合征,具有在各種器官系統中發展各種良性和惡性腫瘤的可能。其遺傳是由位于染色體上的VHL基因中的種系突變引起的,表現出顯著的表型變異性、年齡依賴性外顯率以及家族間變異。VHL 特征性腫瘤包括:中樞神經系統(CNS)和視網膜血管母細胞瘤(HBs)、透明細胞腎癌、神經內分泌腫瘤、胰腺囊腫、嗜鉻細胞瘤等。大多數患有VHL的患者會感染CNS-HBs,發病率介于34.3%至 72%之間。

VHL疾病發生在世界各地的各個個民族。兩性均受到同等影響,患病率為1:30,000~1:50,000(近似發生率為1:36,000),其中, 80%的基因變異發生在復制父母的基因以生育嬰兒的過程中,20%的新突變發生在以前并沒有VHL改動的過程中。這種“從頭突變”大約發生了4,400,000例,很少患者可能有體細胞鑲嵌現象,這使得診斷更加困難。

VHL基因中的種系突變或畸變已被確定為導致該疾病的根本原因。VHL突變數據庫中列出了超過1500種不同的種系突變 (http://www.umd.be:2020/)。除了導致VHL 2c型的突變外,VHL基因的所有突變似乎易于發生特征性HBs。然而,目前還不清楚未知的修飾基因和環境的影響?;蛐?表型相關性的研究表明,通過錯義、無義/缺失以及移碼的等位基因失活導致了VHL-HBs腫瘤的發生。

然而,我們發現了這樣一個案例:一個家族中有三名HBs患者,他們具有VHL疾病的臨床表型,但該疾病并不是由于VHL基因突變引起的,而是由于發生了體細胞高甲基化介導的等位基因VHL失活造成的,也就是說,這樣的血管母細胞瘤是一種血管母細胞瘤的新亞型,即基因印記亞型血管母細胞瘤,與先前VHL基因突變型的最大的區別,該亞型不遵守孟德爾遺傳規律。

及時確定HBs患者及其高危人群是否是基因印記亞型血管母細胞瘤,對于病人的預后和治療意義至關重要,因為該亞型有一定的可逆轉性和使用目前的某些藥物可治療性(屬于基因表觀修飾范疇)。但是,現有技術中還無法實現對基因印記亞型血管母細胞瘤的診斷。



技術實現要素:

本發明是為了解決上述問題而進行的,目的在于提供一種基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒。

本發明提供了一種基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒,具有這樣的特征,包括:用于在甲基化特異性PCR中對VHL啟動子進行擴增的引物組,該引物組包括第一引物、第二引物、第三引物以及第四引物,其中,所述第一引物的序列如SEQ NO:1和SEQ NO:2所示,所述第二引物的序列如SEQ NO:3和SEQ NO:4所示,所述第三引物的序列如SEQ NO:5和SEQ NO:6所示,所述第四引物的序列如SEQ NO:7和SEQ NO:8所示。

在本發明提供的基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒中,還可以具有這樣的特征,還包括:用于對所述基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理的試劑。

在本發明提供的基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒中,還可以具有這樣的特征,還包括:PCR緩沖液、三磷酸脫氧核苷酸以及 Taq DNA聚合酶。

發明的作用與效果

根據本發明所涉及的基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒,因為包括引物組,該引物組包括第一引物、第二引物、第三引物以及第四引物,通過該引物組能夠在甲基化特異性PCR中對受試者基因組 DNA中的VHL啟動子進行擴增,通過對擴增后的VHL啟動子進行甲基化序列分析能夠診斷出受試者是否患有基因印記亞型血管母細胞瘤。

附圖說明

圖1是本發明的實施例三中VHL基因的四個特定基因座;

圖2是本發明的實施例三中采用基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒對基因印記亞型血管母細胞瘤患者進行檢測的檢測結果圖。

具體實施方式

為了使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解,以下實施例結合附圖對本發明基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒作具體闡述。

以下實施例中所使用的QIAamp DNA mini Kit(Qiagen Inc, Chatsworth,CA)、Wizard基因組DNA純化試劑盒(Promega,Madison, WI,U.S.A.)均為市售試劑盒。

<實施例一>

本實施例提供了一種基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒,該試劑盒包括:用于對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理的試劑、用于在甲基化特異性PCR中對VHL啟動子進行擴增的引物組、PCR緩沖液以及三磷酸脫氧核苷酸以及Taq DNA聚合酶。

其中,用于對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理的試劑包括:2M NaOH、3M亞硫酸氫鈉以及10mM氫醌。這三種試劑分別盛放在不同的容器中。

引物組包括第一引物、第二引物、第三引物以及第四引物。

第一引物包括第一上游引物和第一下游引物,其中,第一上游引物的序列如SEQ NO:1所示,第一下游引物的序列如SEQ NO:2所示。

第二引物包括第二上游引物和第二下游引物,其中,第二上游引物的序列如SEQ NO:3所示,第二下游引物的序列如SEQ NO:4所示。

第三引物包括第三上游引物和第三下游引物,其中,第三上游引物的序列如SEQ NO:5所示,第三下游引物的序列如SEQ NO:6所示。

第四引物包括第四上游引物和第四下游引物,其中,第四上游引物的序列如SEQ NO:7所示,第四下游引物的序列如SEQ NO:8所示。

上述引物的濃度均為0.8mM。

PCR緩沖液為1×PCR緩沖液(購自New England Biolabs)。

三磷酸脫氧核苷酸的濃度為2.5mM。

Taq DNA聚合酶的濃度為2.5U。

<實施例二>

本實施例提供了一種利用實施例一中的基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒對人的組織或血液進行基因印記亞型血管母細胞瘤診斷的方法。

該方法包括以下步驟:

步驟一、基因組DNA提取。

使用QIAamp DNA mini Kit(Qiagen Inc,Chatsworth,CA)提取受試者組織或外周血的基因組DNA,然后使用Wizard基因組DNA 純化試劑盒(Promega,Madison,WI,U.S.A.)對進行基因組DNA純化。

步驟二、亞硫酸氫鹽處理。

取純化后的基因組DNA 1μg,用2MNaOH變性,然后在3M亞硫酸氫鈉和10mM氫醌中于55℃溫育17小時,然后使用EpiTect Bisulfite試劑盒(Axygen)對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理得到修飾DNA。

步驟三、甲基化特異性PCR。

PCR體系包括:1×PCR緩沖液(New England Biolabs)、三磷酸脫氧核苷酸(各2.5mM)、引物組(各0.8mM)、50ng修飾DNA 以及2.5U Taq DNA聚合酶(New England Biolabs)。

PCR循環條件為:每次循環95℃120s,60℃15s,72℃30s,共進行25次循環。

步驟四、測序。

將每個PCR加載(20μL)到含有溴化乙錠的3%瓊脂糖凝膠上,并在UV照射下顯現。從凝膠上切下未甲基化和甲基化的產物,使用 QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化,并在Applied Biosystems Prism 377DNA測序系統上測序。

步驟五、結果判定。

根據測序結果,判斷VHL啟動子的甲基化CpG位置是包括如圖 1所示的VHL基因的四個特定基因座,如果判斷結果為是,則表明該受試者患有基因印記亞型血管母細胞瘤。

<實施例三>

本實施例為采用實施例一中基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒并按照實施例二中的診斷方法對三組受試者的組織或血液進行基因印記亞型血管母細胞瘤診斷實驗。

三組受試者包括:實驗組、陽性對照組以及陰性對照組。

其中,實驗組包括三名已確診的因印記亞型血管母細胞瘤患者,這三名患者都沒有VHL基因突變且都患有血管母細胞瘤。陽性對照組包括三名已確診的VHL基因突變的血管母細胞瘤患者。陰性對照組包括三名身體健康的志愿者。

在本實施例中,分別采集三組受試者的5mL血液作為實驗樣本進行實驗。

以上所有受試者的樣本采集均經復旦大學華山醫院倫理委員會同意,并與受試者簽署知情同意書。

實驗結果如下:

圖2是本發明的實施例三中采用基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒對基因印記亞型血管母細胞瘤患者進行檢測的檢測結果圖。

如圖2所示,圖2(A)為實驗組三名受試者的VHL啟動子的甲基化CpG位置示意圖;圖2(B)為實驗組三名受試者的VHL啟動子的甲基化CpG位置與VHL基因的四個特定基因座進行比對的對比圖。由圖2(A)可以看出,三名受試者有四個共享的甲基化CpG位置(見methylated sites together);由圖2(B)可以看出,該四個共享的甲基化CpG位置分別對應VHL基因的四個特定基因座。即,實驗組三名受試者的VHL啟動子的甲基化CpG位置都包括VHL基因的四個特定基因座,因此診斷結果為因印記亞型血管母細胞瘤患者。

陽性對照組以及陰性對照組均不同時具有上述四個共享的甲基化CpG位置(見methylated sites together),即僅具有上述四個共享的甲基化CpG位置中的零個或一個或兩個或三個。

實施例的作用與效果

根據實施例一所涉及的基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒,因為包括引物組,該引物組包括第一引物、第二引物、第三引物以及第四引物,通過該引物組能夠在甲基化特異性PCR中對受試者基因組DNA中的VHL啟動子進行擴增,通過對擴增后的VHL啟動子進行甲基化序列分析能夠診斷出受試者是否患有基因印記亞型血管母細胞瘤,具有良好的臨床應用前景和廣泛的商業前景。

上述實施方式為本發明的優選案例,并不用來限制本發明的保護范圍。

序列表

<110> 復旦大學附屬華山醫院

<120> 基因印記亞型血管母細胞瘤診斷試劑盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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