葉酸代謝相關基因突變位點的檢測方法與流程

文檔序號:18145648發布日期:2019-07-10 11:47
本發明涉及生物醫學領域,特別涉及一種葉酸代謝相關基因突變位點的檢測方法。
背景技術
:基因組學研究表明,葉酸在體內的吸收效果與MCM6基因的表型密切相關。因此,檢測相關基因的變異情況,能有效幫助人們合理飲食,保證營養平衡。目前市場上的相關核酸質譜檢測技術均是采用單向單堿基延伸技術來進行的。而單向單堿基延伸難以對變異位點進行精確確定。本發明旨在通過雙向單堿基延伸的技術,對葉酸代謝相關基因進行變異檢查,從而為個體臨床用藥提供安全指導。技術實現要素:本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術中的不足,提供一種葉酸代謝相關基因突變位點的檢測方法和檢測試劑盒。本發明采用的技術方案是:一種葉酸代謝相關基因突變位點的檢測方法,通過設計的目標位點特異性引物組的單管多重PCR擴增反應得到目標片段,然后再利用單堿基延伸技術對所述目標位點特異性引物組進行雙向延伸,得到等待檢測基因位點,最后通過核酸質譜分析等待檢測基因位點精確測定目標DNA序列;其中,所述單堿基延伸技術是采用單堿基延伸引物組對所述目標片段進行雙向延伸。優選地,所述目標位點特異性引物組包括:用于擴增葉酸代謝相關基因MTHFR-1片段的特異性引物,該特異性引物的正向引物序列如SEQIDNos.1所示,該特異性引物的反向引物序列如SEQIDNo.2所示;用于擴增葉酸代謝相關MTHFR-2片段的特異性引物,該特異性引物的正向引物序列如SEQIDNo.3所示,該特異性引物的反向引物序列如SEQIDNo.4所示;用于擴增葉酸代謝相關MTRR-3片段的特異性引物,該特異性引物的正向引物序列如SEQIDNo.5所示,該特異性引物的反向引物序列如SEQIDNo.6所示。優選地,所述單堿基延伸引物組包括:用于擴增葉酸代謝相關基因MCM6-1片段的單堿基延伸引物,該單堿基延伸引物的序列如SEQIDNo.7所示;用于擴增葉酸代謝相關MCM6-2片段的單堿基延伸引物,單堿基延伸引物的序列如SEQIDNo.8所示;用于擴增葉酸代謝相關MTRR-3片段的單堿基延伸引物,單堿基延伸引物的序列如SEQIDNo.9所示。優選地,所述單管多重PCR擴增的反應程序為:95℃2分鐘,95℃30秒,56℃20秒,72℃60秒,45循環,72℃5分鐘,4℃保存。本發明的有益效果是:通過設計的目標位點特異性引物的單管多重PCR擴增反應得到目標片段,然后再利用單堿基延技術,通過雙向延伸,得到待檢基因位點,最后通過核酸質譜分析精確測定目標DNA序列。本發明旨在通過雙向單堿基延伸的技術,對葉酸代謝相關基因進行變異檢查,從而為個體臨床用藥提供安全指導。具體實施方式下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明,以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。應當理解,本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術語并不排除一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。本發明的一種葉酸代謝相關基因突變位點的檢測方法,包括以下步驟:1)提取樣本DNA1,將離心管中的樣品10000rpm離心2min,去除上清液,留沉淀備用。2、向上述離心管中加入350μlBufferMC(MCL緩沖液)L和20μlProteinaseK(蛋白酶K),震蕩混勻,65℃水浴20min,間或混勻。3、水浴完成之后向離心管中加入350μlBufferMA和25μlSanMagBeads(吸附性磁珠),振蕩或者顛倒混勻,室溫靜置3min,間或混勻。4、將離心管置于磁力架上30s,待SanMagBeads完全吸至管壁之后,吸棄上清,從磁力架上取出離心管。5、向離心管中加入700μl70%乙醇,吸打或者點振混勻,將離心管置于磁力架上30s,吸棄上清,從磁力架上取出離心管。6、重復步驟5一次,室溫開蓋干燥10min至管內無液體殘留。7、向離心管中加入50μlTEBuffer(TE緩沖液)(pH8.0),間或混勻。8、取出離心管并置于磁力架上30s,待SanMagBeads完全吸至管壁上之后,小心吸取上清至新的離心管,即獲得基因組DNA。涉及到主要試劑耗材:DNA抽提試劑盒(上面用到的所有試劑都是這個試劑盒里面的)(OrderNO.B518766)、移液器(步驟2、3、4、5、6、7、8)、槍頭(步驟2、3、4、5、6、7、8)、小型離心機(步驟1)、磁力架(步驟4、5、8),渦旋震蕩器(步驟2、3、5、6、7)。2)設計出特異性引物NCBI網站上查詢并下載該基因序列信息,在待測的位點的上下游選取20nt的特異性序列作為擴增引物。設計原則是:包含待測位點的DNA片段長度100bp-300bp均可,避免發夾結構和重復序列。設計完成以后,在引物5'端加入一段固定序列ACGTTGGATG。3)設計出單堿基延伸引物,單堿基延伸引物的設計同樣是在該基因序列上設計,選擇待測堿基位點上游和下游緊臨的堿基,并根據質譜檢測范圍(4000道爾盾-9000道爾盾),設計引物長度,設計原則引物擴增的第一個堿基即為待測堿基,而且避免發夾結構和重復序列。4)核酸質譜分析,1、配制1μM(每個引物)PCR引物混合物,里面包含多重反應里每個SNP位點的forward(正向)和reverse(反向)引物。2、以2ml、管配制PCR混液,DNA樣本和對照不要加在其中。3、加入2ulDNA樣本,漩渦振蕩器混勻,貼上封口膜。4、將96孔板放上PCR儀進行以下熱循環:95℃2分鐘,95℃30秒,56℃30秒,72℃60秒,45個循環,72℃5分鐘,4℃保溫。5、將各個位點的延伸引物稀釋到100Um,計算在體系中的比例,配制iPLEX延伸引物混液。6、在1.5mL管中配制iPLEX延伸混液。7、每一個孔加入2μliPLEX延伸混液并混好。8、把板用膜封好,渦旋震蕩和離心(4000rpm5秒)。9、將96孔板放上PCR儀進行以下熱循環:10、在樣本板的每一個有樣本的孔里加入41ul水然后離心。11、將96孔板放入質譜儀,打開點樣程序,進行自動點樣操作。12、打開飛行質譜軟件,設置好參數,進行檢測。13、檢測介紹后,在軟件中自動生成結果,導出即可。涉及到主要試劑耗材:96孔PCR板的離心機(步驟3、8、10)、渦旋震蕩器(步驟3、8)、PCR儀(thermo)(步驟4、9)、MassARRAY質譜儀(agena)(步驟11、12、13)、PCR試劑盒(AgenaBioscience貨號:11327)(步驟2)、單堿基延伸試劑盒(AgenaBioscience貨號:10165)(步驟6)、移液器(步驟1、2、3、5、6、7、10)、槍頭(步驟1、2、3、5、6、7、10)、96孔板(步驟2、3、4、7、8、9、10、11)、封口膜(步驟3、8)。表1為特異性引物的序列表;表2為單堿基延伸引物序列表;表1.特異性引物序列表表2.單堿基延伸引物序列表擴增片段引物名稱序列號5'-3'MTHFR-1MTHFR-1-ESEQIDNo.7CTTATAAGGTGTCTGCGGGAGMTHFR-2MTHFR-2-ESEQIDNo.8GAGCTGACCAGTGAAGMTRR-3MTRR-3-2-ESEQIDNo.9CCCCGCCATCGCAGAAGAAAT序列表<110>杭州云鼎基因生物科技有限公司<120>維生素D代謝相關基因突變位點的檢測方法和檢測試劑盒<160>9<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>30<212>DNA<213>智人(Homosapiens)MTHFR-1的正向引物<400>1acgttggatgcacttgaaggagaaggtgtc30<210>2<211>30<212>DNA<213>智人(Homosapiens)MTHFR-1的反向引物<400>2acgttggatggtgcatgccttcacaaagcg30<210>3<211>30<212>DNA<213>智人(Homosapiens)MTHFR-2的正向引物<400>3acgttggatgtctacctgaagagcaagtcc30<210>4<211>30<212>DNA<213>智人(Homosapiens)MTHFR-2的反向引物<400>4acgttggatgtctcccgagaggtaaagaac30<210>5<211>30<212>DNA<213>智人(Homosapiens)MTRR-3的正向引物<400>5acgttggatgctatatgctacacagcaggg30<210>6<211>30<212>DNA<213>智人(Homosapiens)MTRR-3的反向引物<400>6acgttggatggaaaatccatgtaccacagc30<210>7<211>21<212>DNA<213>智人(Homosapiens)MTHFR-1的單堿基延伸引物<400>7cttataaggtgtctgcgggag21<210>8<211>16<212>DNA<213>智人(Homosapiens)MTHFR-2的單堿基延伸引物<400>8gagctgaccagtgaag16<210>9<211>21<212>DNA<213>智人(Homosapiens)MTRR-3的單堿基延伸引物<400>9ccccgccatcgcagaagaaat21當前第1頁1 2 3 
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