一種用于膿毒癥標志物的lncRNA及其應用的制作方法

文檔序號:18145647發布日期:2019-07-10 11:47
一種用于膿毒癥標志物的lncRNA及其應用的制作方法
本發明屬于生物醫學領域,涉及一種非編碼RNA及其應用,尤其涉及一種用于膿毒癥標志物的lncRNA及其應用。
背景技術
:膿毒癥是一種典型的復雜疾病,是表現病人對感染反應的嚴重臨床狀態。膿毒癥具有高發病率、高死亡率和高治療費用的現狀。早期診斷是降低膿毒癥病死率的最佳策率。臨床現行的膿毒癥診斷標準仍主要依賴臨床癥狀,而系統性炎癥的臨床癥狀可能與非感染臨界情況(如創傷、燒傷、胰腺炎、自身免疫病和移植排斥反應)部分重疊,微生物培養也因前期或伴隨的抗生素療法而時常顯示為陰性,導致大量的診斷延誤。隨著轉錄組學和基因組學技術的不斷發展,非編碼RNA(non-codingRNAs,ncRNAs)成為研究熱點。眾多研究證實,ncRNAs在細胞分化和成長中起到重要的調控角色。長鏈非編碼RNAs(longnon-codingRNAs,lncRNAs)是一類轉錄本長度超過200nt,不編碼蛋白質的開放性閱讀框。近年來研究發現,lncRNA可以在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平上調控基因的表達,與人類疾病的發生發展與治療均存在密切關系,多數lncRNA的研究主要集中在腫瘤或神經性疾病等領域,鮮有與膿毒癥有關的lncRNA的報道。CN109022570A公開了LOC105372511可作為膿毒癥的診斷標志物。研究表明LOC105372511在膿毒癥患者的血液中含量比正常人顯著升高。因此LOC105372511可以作為診斷膿毒癥的分子標志物。CN109112212A公開了膿毒癥診斷相關分子。本發明通過測序篩選在膿毒癥患者和健康對照人群中存在差異表達的分子,研究表明LINC01871在膿毒癥患者血液中的含量比健康人低。據此可將LINC01871作為診斷膿毒癥的生物標志物。CN109022571A公開了LOC105369645在制備診斷產品中的應用。該診斷產品可用于膿毒癥的診斷。通過檢測LOC105369645的水平可以判斷受試者將來患有膿毒癥的風險或者確診膿毒癥的狀態。CN109055535A公開了LOC101927627作為診斷膿毒癥的分子標志物的用途。研究表明LOC101927627在膿毒癥患者血液中和在健康對照人群中的表達存在顯著差異,據此認為LOC101927627可以作為診斷膿毒癥的分子標志物。因此,提供一種用于膿毒癥標志物的lncRNA輔助臨床診斷膿毒癥、研究發病機制具有重要意義。技術實現要素:針對現有技術的不足及實際的需求,本發明提供一種用于膿毒癥標志物的lncRNA及其應用,通過檢測lncRNAENST00000490593.1在樣本中的表達,進一步豐富了膿毒癥發病機制的研究,對膿毒癥早期診斷具有重要意義。為達此目的,本發明采用以下技術方案:第一方面,本發明提供一種用于膿毒癥標志物的lncRNA,所述lncRNA為lncRNAENST00000490593.1,其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。lncRNAENST00000490593.1的具體序列如SEQIDNO.1所示:CAGCACTTGGGATGTGCACCAACAGTTCTTATGGGGGCCCGGCCTCCTCATCACTCCAGTTCTGGATGAAGTAAGTGTTCCCACAGAGATACACTAGAGATCTCTGCATCTGTATCTGCTGCCCTGCAAACTCCTCTCTGCTTCTTATTCCAAACTCACTTCTGACATCTGTGACTGAGTCAGCCTTGAAGAGAGTGTGCTAGGTTTTGAGAAGCTAGACATCTGGTAACTACACATTTTTCTTTCTAGAATTTCTTTTTTCTCTTGATCAAGTTCCCAACCAGTTTAGAAGCATCTACTGGAAACTCTAGAGTTACAAGTTATGTTAGGTTGTTCTTGCATTGCTATACAGAAATTCCTGACACTGAGTGATTTACAAAGAAAAGAGATTTCATTGGCTCACAGTTCTGAAAGCTTTACAAGAAGCATGATGCTGGTATCTGTGCAGCTTCTAGGGAGGCCTCAGGAAGCTTACAGTCATGGAGGAAGGTGAAGAGGAGCAGCGATGTCATATAGCAAAAGCAGGAACAAGACGGGGTGGGGGGAGTTGCCACACACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTCTCACTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCCCAGCTCACTGCAACCTCCAACTCCTGGGTTCACATGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGGTTACAGGCACCTGCCACCAAGCTCGGCTAATTTTGTATTTTTTGTAGAGACGGGGTTTCATGTTAGCCAGGCTGGTCTCAAACTGCTGACCTCAGATGATCCACCTGCCTCAGCCTCCAAAGTGCTGAGATTACAGGTGTGAGTCACCGCGCTTGGCCGCCACACACTTTTAAACAACCAAATCTTACAAGAATTCACTCACTATCACCAGGACAGAACCAAGGGAATGGTGTAAACCATTCATGAGAAATCTGCCCTCATCATCCAGTCAGCTCCCTCCAGGCCCCACCTCCAACACTGGGGATTACATTTCAACATGAGATTTGGGCAGACAAACATCCAAACTATATCAAGAGTGGTCCTATTTGTTGTTGGATTCTCATAGCAGATCCTGACTTGCTCCATGACGTAGAAACAGGATGGAGCAGTGACCCAACACTCACTCTAAAGTCAGGCTGATCGGGATGTGATTGTTGTCTCTGCCACTTTGAGCCTGTGTGATCAGGGGTGACTATTGTGCTGGCTTCTCATCTGCAGAGGGGTAATACTACTACTACTAAAAATAATGGTACCCACCATTTGGGAATGTTGGGAAAATTAAATGAGGTAATCATGTAAAGCTGGAATGTTTGTCACCACACATGTTTTATTATTATTTTATGATTATTATTATTCCTAATGTGGCTACGTTTGGGATTTCTCTCTGGGTTGCCAAGTTACAGTTTCTATTATTTGTATTAGAGGAGAAGCAGAAGAAAGGCATAATAGCAGGGCATTCCTGCCCTCTCTGTGTATGATTAAGAAATTCCCTAGAGAATAAAAAGAAATCCATTTTATTTCCCTCAGGGGACACTACATTTTTTTAATTTCAGGGTGCAGAGAAAGTGATGGCATATGTGCCTGATGCTGTCTGGTATGACTACGAGACTGTAAGTAGCTTTGACTTTTCTTCTACTCCTTAAGACTGTAGCTGCAGCTGCATAGACAAGCTACCTTTCTGGAGAGAGAAACATCCATCTACATGCTGAGGAGTAGTTTTTAGTGTTTTCTGTAATTTCATAGCAGAACCTGGGTAAAGTTAACCTAAACCGTTAACATCAGTCATGATGAAATGTGAAAAAATACCTTCATATACTTTATTTAGCAATAAGATAGGCTGACATAGTATCTCATAAATTAATATTGGAGGAACTGATGGA.本發明中,發明人通過實驗驗證表明,lncRNAENST00000490593.1與膿毒癥的發生相關,在膿毒癥患者中的表達量顯著上調,通過檢測所述lncRNA可以輔助判斷膿毒癥早期發生以及后期發展,為臨床診斷提供幫助。LncRNAENST00000490593.1的具體信息記錄于網站EnsemblGenomeBrowser(http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Summary?db=core;g=ENSG00000257335;r=7:141738346-141740241;t=ENST00000490593),是MGAM基因轉錄而來。第二方面,本發明提供一種分離的多核苷酸,所述的多核苷酸能被人細胞轉錄成第一方面所述的lncRNA。本發明中,提供一種分離的多核苷酸,所述多核苷酸能被人細胞轉錄成第一方面所述的lncRNA,所述多核苷酸的結構典型但不局限地為Seq正-X-Seq反,其中Seq正為在人細胞中轉錄成所述lncRNA的核苷酸序列,Seq反與Seq正互補配對,X為Seq反與Seq正之間的間隔序列,所述間隔序列不會與Seq反與Seq正互補,也不會形成自身互補配對,所述分離的多核苷酸轉入人細胞后形成莖環結構。第三方面,本發明提供一種載體,所述載體含有如第一方面所述的lncRNA,或第二方面所述的多核苷酸。第四方面,本發明提供一種如第一方面所述的lncRNA、第二方面所述的多核苷酸或第三方面所述的載體在制備膿毒癥篩選或診斷的藥物、芯片、試劑盒或高通量測序平臺中的應用。本發明中,根據lncRNAENST00000490593.1與膿毒癥的正相關關系,可以應用于各種診斷膿毒癥的產品中,例如為藥物、芯片、試劑盒或高通量測序平臺。優選地,所述應用為檢測樣本中第一方面所述的lncRNA的表達。本發明中,通過檢測lncRNAENST00000490593.1的表達量判斷對應樣本是否患有膿毒癥,若表達量顯著上調則判定結果為陽性。檢測所述lncRNAENST00000490593.1的表達量的方法例如可以是高通量測序、qPCR等方法。優選地,所述檢測樣本為血液。第五方面,本發明提供一種lncRNA芯片,所述lncRNA芯片包括固相載體以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針,所述寡核苷酸探針特異性地對應于第一方面中SEQIDNO.1所示的部分或全部序列。本發明中,根據lncRNAENST00000490593.1的核苷酸序列,設計適合的特異性探針,固定在固相載體上,形成寡核苷酸陣列。所述固相載體可采用基因芯片領域的常用材料,例如可以是尼龍膜、玻片或塑料片等。芯片的制備可采用本領域已知的生物芯片常規操作方法,本發明不做特殊限定。第六方面,本發明提供一種試劑盒,所述試劑盒包括針對如第一方面所述lncRNA的特異性引物對或探針。優選地,所述特異性引物對的序列如SEQIDNO.2-3所示。SEQIDNO.2:AAACATCCATCTACATGCTGAG.SEQIDNO.3:CTTTACCCAGGTTCTGCTATGA.優選地,所述特異性引物對適用于SYBRGreen、Taqman探針、分子信標、雙雜交探針或復合探針技術的檢測。與現有技術相比,本發明具有如下有益效果:(1)本發明提供lncRNAENST00000490593.1用于膿毒癥標志物的用途,通過基因芯片和qPCR雙重驗證,證實所述lncRNA在膿毒癥患者細胞內存在轉錄差異;(2)本發明提供一種lncRNAENST00000490593.1在制備診斷膿毒癥的產品中的應用,為膿毒癥發病機制的研究奠定基礎,同時輔助臨床診斷,提升患者預后;(3)本發明提供一種基因芯片,可進行高通量檢測lncRNAENST00000490593.1的表達譜,進一步豐富了膿毒癥發病機制的研究。附圖說明圖1為本發明實施例2中基因芯片檢測結果;圖2為本發明實施例3中qPCR檢測結果。具體實施方式為更進一步闡述本發明所采取的技術手段及其效果,以下通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案,但本發明并非局限在實施例范圍內。實施例1樣本RNA提取1、樣本采集遵循知情同意原則,并在倫理委員會同意的前提下,收集12例健康人血液和10例膿毒癥患者血液。2、RNA樣品制備分離單核細胞(MNCs)后使用RNAiso(TaKaRa,Dalian,China)試劑盒提取總RNA。具體為:細胞加入1mlRNA提取液,每管中加入200ul氯仿(相當于Trizol1/5體積)震蕩混勻15s,室溫靜置5min,4℃12000rpm離心15min。離心后可見管內液體分為3層,RNA全部溶解在上層水相中。用1ml移液槍小心吸取上層水相至新1.5mlEP管中,加等量異丙醇混勻,冰上靜置10min,再次4℃12000r/min離心10min,棄上清。每管加入1ml75%的乙醇,溫和震蕩,4℃8000r/min離心5min,盡量棄上清。將EP管倒置在吸水紙上室溫晾干,可見管內沉淀由白色轉為透明,加入DEPC水10-20ul,使之充分溶解,總RNA提取完畢。3、RNA樣品質檢樣品總RNA利用NanoDropND-2000(ThermoScientific)定量并經AgilentBioanalyzer2100(AgilentTechnologies)檢測RNA完整性。實施例2基因芯片檢測1、樣本RNA的逆轉錄和標記實施例1中RNA質檢合格后,RNA反轉錄成雙鏈cDNA,再進一步合成cRNA,接著對cRNA進行第二輪反轉錄合成cDNA,片段化并與生物素標記。2、雜交基因芯片采用歐易生物-AffymetrixHumanoelncRNAArray,按芯片使用說明書的步驟進行雜交,洗脫和染色后利用AffymetrixScanner3000(Affymetrix)掃描得到原始圖像。3、數據處理原始圖像采用AffymetrixGeneChipCommandConsole軟件(version4.0,Affymetrix)處理提取原始數據,接著利用ExpressionConsole軟件(version1.3.1,Affymetrix)對芯片進行genelevel和exonlevel的標準化,標準化算法為RMA。然后進行基因表達分析,分析使用的軟件為Genespring軟件(version13.1,AgilentTechnologies)。差異基因利用T檢驗的p值和倍數變化值進行篩選,篩選的標準為上調或者下調倍數變化值>=2.0且P值<=0.05?;蛐酒瑱z測結果如圖1所示,可知,ENST00000490593.1在膿毒癥患者中的表達水平顯著高于健康人。實施例3qPCR檢測1、RNA逆轉錄采用實施例1所得RNA樣本,通過紫外分光光度計檢測RNA濃度,測量樣品的OD260與OD280.以OD260/OD280的比值確定RNA的完整度及純度,并根據OD260的值,計算RNA含量,并適當稀釋調整總RNA濃度約1ug/ul。隨后進行反轉錄得到cDNA,使用oligo-Dt和鼠乳腺瘤病毒反轉錄酶進行RNA反轉錄,Fermentas反轉錄試劑盒(Promega公司),Oligo-dT(金維智公司);1)建立A體系,將體系A加入200ul離心管中混勻,掌上離心機離心,放至梯度PCR儀中,設定70℃溫育5min,轉入4℃10min,體系A的組成見表1;表1組分體積Oligo-dT8ulDEPC水2ul總RNA2ul總體積12ul2)建立B體系,將體系B加入體系A中,充分混勻,離心后重新放入梯度PCR儀中,設定37℃溫育60min,95℃5min,轉為4℃,即得到cDNA,B體系的組成見表2。表2組分體積RNA反轉錄緩沖液5uldNTP混合物1.3ulDEPC水5ulRNAsin核糖核酸酶抑制劑0.7ulRNA反轉錄酶1ul總體積13ul2、qPCR反應引物設計后使用SYBRGreenmastermix進行qPCR實驗,采用管家基因β-actin作為內參基因,引物具體序列如SEQIDNO.2-5所示。ENST00000490593.1的引物序列為:正向引物(SEQIDNO.2):5’-AAACATCCATCTACATGCTGAG-3’;反向引物(SEQIDNO.3):5’-CTTTACCCAGGTTCTGCTATGA-3’.管家基因β-actin的引物序列為:正向引物(SEQIDNO.4):5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’;反向引物(SEQIDNO.5):5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’.反應程序:按照表3配置反應體系,按上述反應體系加樣,每個樣品做三個復孔,然后將樣品置于熒光定量儀上,根據設定好的程序進行反應,反應條件為:95℃,10min;95℃,15s,60℃,15s,72℃,30s,72℃收集熒光,共40個循環;循環結束后做相應的溶解曲線。運用LightCyler480自帶的軟件進行實時數據收集和定量分析。表3反應體系組分體積SYBRGreenmasterMix10ul正向引物1ul反向引物1ul去離子水7ulcDNA1ul總體積20ul3、統計學分析基因表達水平以β-actin進行標準化,使用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。使用Mann–WhitneyUtest對膿毒癥組與健康對照組之間基因表達量進行比較。統計分析使用GraphPadPrism軟件(GraphPadSoftwareInc.)。雙側P值小于0.05認為具有統計顯著性,結果見圖2。由圖2可知,ENST00000490593.1在膿毒癥患者中的表達水平顯著高于健康人,差異具有統計學意義(P<0.01),與芯片結果一致。實施例4試劑盒的組裝RNA提取液:苯酚,異硫氰酸胍,β-巰基乙醇,8-羥基喹啉;RNA反轉錄酶:莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶(M-MLV);正向引物(SEQIDNO.2):5’-AAACATCCATCTACATGCTGAG-3’;反向引物(SEQIDNO.3):5’-CTTTACCCAGGTTCTGCTATGA-3’.將RNA提取液、RNA反轉錄酶、RNA反轉錄緩沖液、Oligo-dT、SYBRGreenmasterMix、引物(正向和反向)、去離子水、陽性對照、陰性對照以及說明書包裝進試劑盒。綜上,本發明提供一種用于膿毒癥標志物的lncRNA,并首次發現lncRNAENST00000490593.1與膿毒癥的關系,豐富了膿毒癥發病機制的研究,為臨床診斷提供一定依據。申請人聲明,本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細方法,但本發明并不局限于上述詳細方法,即不意味著本發明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬
技術領域
的技術人員應該明了,對本發明的任何改進,對本發明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等,均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。SEQUENCELISTING<110>方芳<120>一種用于膿毒癥標志物的lncRNA及其應用<130>2019<160>5<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1896<212>DNA<213>人工合成序列<400>1cagcacttgggatgtgcaccaacagttcttatgggggcccggcctcctcatcactccagt60tctggatgaagtaagtgttcccacagagatacactagagatctctgcatctgtatctgct120gccctgcaaactcctctctgcttcttattccaaactcacttctgacatctgtgactgagt180cagccttgaagagagtgtgctaggttttgagaagctagacatctggtaactacacatttt240tctttctagaatttcttttttctcttgatcaagttcccaaccagtttagaagcatctact300ggaaactctagagttacaagttatgttaggttgttcttgcattgctatacagaaattcct360gacactgagtgatttacaaagaaaagagatttcattggctcacagttctgaaagctttac420aagaagcatgatgctggtatctgtgcagcttctagggaggcctcaggaagcttacagtca480tggaggaaggtgaagaggagcagcgatgtcatatagcaaaagcaggaacaagacggggtg540gggggagttgccacacacttttttttttttttttttttgagatggagtctcactctgtca600cccaggctggagtgcagtggcacaatcccagctcactgcaacctccaactcctgggttca660catgattctcctgcctcagcctcctgagtagctggggttacaggcacctgccaccaagct720cggctaattttgtattttttgtagagacggggtttcatgttagccaggctggtctcaaac780tgctgacctcagatgatccacctgcctcagcctccaaagtgctgagattacaggtgtgag840tcaccgcgcttggccgccacacacttttaaacaaccaaatcttacaagaattcactcact900atcaccaggacagaaccaagggaatggtgtaaaccattcatgagaaatctgccctcatca960tccagtcagctccctccaggccccacctccaacactggggattacatttcaacatgagat1020ttgggcagacaaacatccaaactatatcaagagtggtcctatttgttgttggattctcat1080agcagatcctgacttgctccatgacgtagaaacaggatggagcagtgacccaacactcac1140tctaaagtcaggctgatcgggatgtgattgttgtctctgccactttgagcctgtgtgatc1200aggggtgactattgtgctggcttctcatctgcagaggggtaatactactactactaaaaa1260taatggtacccaccatttgggaatgttgggaaaattaaatgaggtaatcatgtaaagctg1320gaatgtttgtcaccacacatgttttattattattttatgattattattattcctaatgtg1380gctacgtttgggatttctctctgggttgccaagttacagtttctattatttgtattagag1440gagaagcagaagaaaggcataatagcagggcattcctgccctctctgtgtatgattaaga1500aattccctagagaataaaaagaaatccattttatttccctcaggggacactacatttttt1560taatttcagggtgcagagaaagtgatggcatatgtgcctgatgctgtctggtatgactac1620gagactgtaagtagctttgacttttcttctactccttaagactgtagctgcagctgcata1680gacaagctacctttctggagagagaaacatccatctacatgctgaggagtagtttttagt1740gttttctgtaatttcatagcagaacctgggtaaagttaacctaaaccgttaacatcagtc1800atgatgaaatgtgaaaaaataccttcatatactttatttagcaataagataggctgacat1860agtatctcataaattaatattggaggaactgatgga1896<210>2<211>22<212>DNA<213>人工合成序列<400>2aaacatccatctacatgctgag22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工合成序列<400>3ctttacccaggttctgctatga22<210>4<211>21<212>DNA<213>人工合成序列<400>4catgtacgttgctatccaggc21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工合成序列<400>5ctccttaatgtcacgcacgat21當前第1頁1 2 3 
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