鼠肉與山羊肉、綿羊肉多重PCR檢測試劑盒及鑒定方法與流程

文檔序號:18145666發布日期:2019-07-10 11:47
鼠肉與山羊肉、綿羊肉多重PCR檢測試劑盒及鑒定方法與流程

本發明涉及分子生物學技術在肉制品檢測領域的應用,更具體地說,是一種鼠肉(大白鼠、小白鼠、豚鼠、褐家鼠)、山羊肉與綿羊肉DNA快速鑒定試劑盒及檢測方法。



背景技術:

肉類食品屬民生食用產品,其質量的好壞關系人民群眾健康和生命安全。日常生活中,我們食用的羊肉多為綿羊肉和山羊肉。山羊肉為??苿游锴嘌虻娜?。補虛助陽。治虛勞內傷,筋骨痹弱,腰脊酸軟,陽痿,帶下,不孕。山羊肉中有一種傳統的優質羊肉叫柏籽羊肉,素以鮮嫩清香、無腥膻味而聞名,被譽為“土人參”“補心丸”。上世紀80年代以來,張勇飛等專家根據《黃帝內經˙素問˙萎論》“脾主身之肌肉”原理和現代生物分子學理論,以中藥為手段,可使普通山羊肉轉化為柏籽羊肉,作為藥膳食用。綿羊肉肌肉呈暗紅色,肉纖維細而軟,肌肉間夾有白色脂肪,脂肪較硬且脆。山羊肉肉色較綿羊肉淡,有皮下脂肪,只在腹部有較多的脂肪,肉有膻味。綿羊肉的脂肪含量會更高一些,山羊肉它最重要的特點就是膽固醇含量是比較低的,所以說對于心腦血管疾病以及心臟病等等能夠起著一定的預防功效,所以在日常生活當中患有高血脂,高血壓以及老人們最好吃山羊肉。

目前肉制品市場上鼠肉冒充羊肉事件頻發。因生鼠肉是粉色的,和羊肉的色澤、紋路接近,不法商販為節約成本購入未經檢驗檢疫的老鼠肉,添加明膠、胭脂紅等冒充羊肉,以肉卷、肉串、肉丸、火腿腸等形式銷售至各地農貿市場。大約75%的人類感染可能來自不同途徑直接或間接接觸的動物產品,鼠屬于嚙齒類的哺乳動物,繁殖速度快,數量多,對居住的環境和食物要求不高,是多種傳染病病原的儲存宿主和主要傳染源,鼠體內的部分病毒即便通過高溫加熱也很難被消除或減弱。目前,據報道用于肉類產品摻假的鼠類主要來源于醫學實驗室的小白鼠、大白鼠和豚鼠;野外捕獲的田鼠、褐家鼠等。實驗室鼠雖經檢疫,但在實驗室制作動物模型或臨床用藥前評估時,喂養鼠飼料添加一些特定藥品或直接在鼠體內注射藥品,這些藥品在肉里大量存在,人食用后會導致機體損害!部分野外老鼠是食用鼠藥毒死的,食用者存在中毒的風險,因此鼠肉是絕不允許被擺上餐桌的。摻假肉制品的出現會影響消費者的身體健康和生命安全。此外,這些摻假肉制品出口到國外會嚴重損害食品企業形象及國家信譽?;谑称钒踩耘c質量監督的需要,有必要對食品中動物源性成分進行檢測。

國內外常用的檢測摻假肉的方法有感官鑒定技術、光譜色譜分析、酶聯免疫吸附技術、常規PCR,實時熒光定量PCR和數字PCR等。感官鑒定技術需要檢驗人員對各物種的細微形態有較強的認識;近紅外光譜主要對肉類中的含氫基團進行檢測,其缺點是需大量樣品建立與分析模型,且檢測精度不高;色譜分析僅適用于新鮮和冷凍肉類;在肉類加工過程中,蛋白質易變性而使酶聯免疫反應失效,所以酶聯免疫吸附技術只適合于未加工過的肉制品;電子鼻和電子舌在硬件結構和識別算法上仍存在仿生性差的缺點;目前對于動物源成分檢測的國家標準和行業標準主要采用PCR法。實時熒光定量PCR和數字PCR能夠同時進行特異性識別和量化,提供更精確和可靠的定量數據。但應用的儀器、試劑價格昂貴,且耗時長,對檢測技術人員要求高,操作難度大,不適宜快速批量檢測使用。

線粒體DNA基因組在動物物種鑒定方面比核基因以及核糖體12S和16S基因更具優勢,線粒體DNA作為唯一的核外遺傳信息載體,具有獨立復制、進化速度快、不受核基因影響等特點,被廣泛用于動物的種屬鑒別研究中。在線粒體13個編碼蛋白的基因中,Cyt b基因擁有合適的進化速率和長度,在Gene Bank數據庫中擁有最多的基因數據,在動物屬間、種間存在多樣性,被廣泛用于物種間的鑒別工作。因此,本研究選擇各物種Cyt b基因設計特異性引物,建立多重PCR反應體系,完成對鼠、山羊、綿羊三個物種的特異性鑒別。

利用多重PCR技術,在同一個PCR反應管中加入多對特異性引物,同時對多個目的基因進行擴增分析,節省檢測時間和檢測成本,為臨床或食品安全檢測提供更多更準確的信息,具有高效性、系統性、經濟簡便性等優點。



技術實現要素:

本發明的目的是在建立鼠肉(大白鼠、小白鼠、豚鼠、褐家鼠)、山羊肉與綿羊肉線粒體 DNA的基因組文庫基礎上,采用生物信息學技術對鼠肉、山羊肉與綿羊肉線粒體DNA基因組進行篩選,設計可有效地區分鼠肉、山羊肉與綿羊肉的特異性DNA序列,利用多重PCR 技術在一個反應體系中加入三對特異性引物,針對三個模板可擴增三個具有差異的目的片段。提供一種能夠準確鑒別鼠肉、山羊肉與綿羊肉特異性分子標志,使用方便的鼠肉、山羊肉與綿羊肉多重PCR檢測試劑盒,具有節省時間、降低成本和提高效率的特點,并提供簡便、快速、檢測結果可靠的鑒定方法。

本發明的目的是由以下技術方案來實現的:

鼠肉、山羊肉與綿羊肉多重PCR檢測試劑盒,它包含:

1.線粒體DNA提取體系

P1溶液30mL,P2溶液30mL,P3溶液10mL,P4溶液30mL,P5溶液30mL,P6溶液 50mL;

2.鼠、山羊及綿羊三對線粒體DNA特異寡核苷酸引物

在GenBank中下載種屬基因序列,再應用NCBI Primer-BLAST在線引物設計軟件設計,具體引物序列如下:

引物1(鼠,擴增長度102bp)

Forward primer:5′TGAGGTGCTACCGTTATT3′

Reverse primer:5′GGTGGCTTTGTCTACTGA3′

引物2(山羊,擴增長度219bp)

Forward primer:5′TACTCGGAGACCCAGACAAC3′

Reverse primer:5′GGCTGATTGGGCGGAATATT3′

引物3(綿羊,擴增長度364bp)

Forward primer:5′TTCACCTACTCTTCCTCCAC3′

Reverse primer:5′ATTATGCTCCGTTGCTTT3′

引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成

3.鼠肉、山羊肉、綿羊肉陽性對照品

紫外燈下切下鼠肉、山羊肉、綿羊肉特異性DNA片段,進行凝膠回收;測定其濃度,轉化大腸桿菌后涂板過夜培養;藍白篩選后轉入LB液體培養基于37℃恒溫氣浴振蕩器中培養過夜;質粒小提,測定其DNA濃度。選取濃度超過100ng/μL的樣本交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序分析。分析測序結果,并將提取的質粒經PCR鑒定后稀釋一定濃度作為試劑盒的陽性對照品。

4.多重PCR反應體系

鑒定反應體系(3管)800μL;陽性對照反應體系(3管),鼠肉(C-鼠陽)、山羊肉(C- 山羊陽)、綿羊肉(C-綿羊陽)各1管,各50μL;陰性對照反應體系1管,50μL。

(a)鑒定反應體系:總體系為50μL,其中含有反應緩沖液(10×)5μL,dNTP(2.5mmol·L-1) 2-5μL,MgCl2(2.5mmol·L-1)3μL,Taq DNA聚合酶1-5μL,引物1、引物2和引物3(10μmol·L-1) 中的每種0.5-2μL,待檢樣本DNA1-3μL,余為雙蒸餾水;

(b)陽性對照反應體系:總體系為50μL,其中含有反應緩沖液(10×)5μL,dNTP(2.5 mmol·L-1)2-5μL,MgCl2(2.5mmol·L-1)3μL,Taq DNA聚合酶1-5μL,引物1、引物2和引物3(10μmol·L-1)中的每種0.5-2μL,鼠肉、山羊肉及綿羊肉DNA(1:1:1)混合物1-3μL,余為雙蒸餾水;

(c)陰性對照液:貂肉或狐貍肉DNA按1:1混合1-3μL。

5.多重PCR反應條件

分別將鼠肉、山羊肉及綿羊肉基因組DNA加入PCR檢測試劑盒的(a)鑒定反應體系、 (b)陽性對照反應體系和(c)陰性對照反應體系的總體系各50μL加入反應管中,置于PCR 反應儀中按下列程序進行:94℃預變性5min,94℃30s,退火50-55℃30s,72℃45s,30個循環,72℃延伸7min,4℃;

6.結果判定

反應產物使用1.5%瓊脂糖凝膠,在DYY-Ⅲ型水平電泳儀上電泳,85mV電泳1h,分子量100bp的DNA Marker作參照,凝膠成像分析系統觀察和分析得出結果。凝膠電泳圖譜中,鼠、山羊、綿羊在100-400bp處,在與陽性對照品鼠(102bp)、山羊(219bp)、綿羊(364bp) 凝膠電泳圖譜相應位置上出現DNA條帶,空白對照無條帶,判定為含有相應肉類成分。

鼠肉、山羊肉與綿羊肉多重PCR檢測試劑盒快速鑒定方法,它包含以下步驟:

1.樣本前處理

取待檢樣本50mg置于無菌燒杯中,加入10mL生理鹽水溶液浸泡20min,在平皿中用手術刀去除結締組織后將組織切碎。

2.線粒體DNA提取

(1)裂解向經過前處理的樣品中加入37℃預熱的P1溶液500μL,P2溶液30μL,P3 溶液15μL,混勻,56℃水浴振蕩1小時。

(2)沉淀加入P4溶液500μL,離心(轉速為每分鐘10000轉)10分鐘。吸取上清液 500μL和P5溶液500μL置于離心管中,-20℃放置1h,離心(轉速為每分鐘10000轉)10 分鐘,棄去上清液。

(3)洗滌用P6溶液500μL洗滌沉淀物1次,離心(轉速為每分鐘11000轉)10分鐘,棄去上清液(重復1次),沉淀室溫干燥,加入80μL TE溶解DNA,作為供試品溶液。

3.建立PCR反應

(1)陽性對照取3支無菌空白溶液管,分別加入預混好的鼠、山羊、綿羊陽性對照反應液50μL;

(2)陰性對照取1支無菌空白溶液管,加入預混好的鑒定反應液47-49μL,同時加入陰性對照液1-3μL,混勻,做好標記。

(3)PCR反應在無菌空白溶液管中加入預混好的鑒定反應液47-49μL,同時加入相應的供試品DNA溶液1-3μL,混勻,做好標記。

(4)反應程序反應管置于PCR反應儀中按下列程序進行:94℃預變性5min,94℃ 30s,退火50-55℃30s,72℃45s,30個循環,72℃延伸7min,4℃。

4.結果判定

反應產物使用1.5-1.8%瓊脂糖凝膠,在DYY-Ⅲ型水平電泳儀上電泳,70-85mV電泳 45min-1h,分子量100bp的DNA Marker作參照,凝膠成像分析系統觀察和分析得出結果。凝膠電泳圖譜中,鼠、山羊、綿羊在100-400bp處,在與陽性對照品鼠(102bp)、山羊(219bp)、綿羊(364bp)凝膠電泳圖譜相應位置上出現3條DNA條帶,空白對照無條帶,判定為含有相應肉類成分。參照圖1。

本發明的鼠肉、山羊肉與綿羊肉多重PCR檢測試劑盒是利用鼠肉、山羊肉及綿羊肉細胞色素b具有的種屬特異性,能夠準確同時區別鼠肉、山羊肉及綿羊肉的特異性;鑒定方法具有簡便、快速、檢測結果可靠等優點。

附圖說明

圖1為試劑盒檢測鼠肉、山羊肉及綿羊肉鑒定結果示意圖。

其中:1:為陽性對照品(鼠肉+山羊肉+綿羊肉);M:為標準分子量(100bp ladder marker); 2:為褐家鼠肉結果;3:為褐家鼠肉+牛肉結果;4:為小白鼠肉+豬肉結果;5:為山羊肉結果;6:為綿羊肉結果;7:為綿羊肉+豚鼠肉結果;8:為空白對照結果。

圖2實施例一檢測鮮鼠肉、鮮山羊肉及鮮綿羊肉鑒定結果示意圖。

其中:1:陽性對照品(鼠肉+山羊肉+綿羊肉);M:為標準分子量(100bp laddermarker); 2:褐家鼠肉+山羊肉;3:褐家鼠肉+綿羊肉;4:山羊肉+綿羊肉;5:小白鼠肉;6:山羊肉;7:綿羊肉;8:豚鼠肉+山羊肉+綿羊肉;9:空白對照。

圖3實施例二檢測烘培后的鼠肉、山羊肉及綿羊肉制品鑒定結果示意圖。

其中:1:為陽性對照品(鼠肉+山羊肉+綿羊肉);M:為標準分子量(100bp laddermarker); 2:為烘培后褐家鼠肉;3:為烘培后褐家鼠肉+市售牛肉火腿腸;4:為烘培后小白鼠肉+市售雞肉串;5:市售綿羊肉卷;6:市售山羊肉;7:為市售羊肉串;8:空白對照。

具體實施方式:

下面利用實施例一對本發明作進一步描述。

材料為鼠肉、山羊肉、綿羊肉、狗肉、貂肉、狐貍肉(樣本均由長春市食品藥品檢驗中心提供)。

1.樣本前處理

取待檢樣本50mg置于無菌燒杯中,加入10mL生理鹽水溶液浸泡20min,在平皿中用手術刀去除結締組織后將組織切碎。

2.線粒體DNA提取

(1)裂解向經過前處理的樣品中加入37℃預熱的P1溶液500μL,P2溶液30μL,P3 溶液15μL,混勻,56℃水浴振蕩1h。

(2)沉淀加入P4溶液500μL,離心(轉速為10000r/min)10min。吸取上清液500μL 和P5溶液500μL置于離心管中,-20℃放置1h,離心(轉速為每分鐘10000轉)10分鐘,棄去上清液。

(3)洗滌用P6溶液500μL洗滌沉淀物1次,離心(轉速為10000r/min)10min,棄去上清液(重復1次),沉淀室溫干燥,加入80μL TE溶解DNA,作為供試品溶液。

3.建立PCR反應

(1)陽性對照取3支無菌空白溶液管,分別加入預混好的鼠、山羊、綿羊陽性對照反應液50μL;

(2)陰性對照取1支無菌空白溶液管,加入預混好的鑒定反應液47μL,同時加入陰性對照液3μL,混勻,做好標記。

(3)PCR反應在無菌空白溶液管中加入預混好的鑒定反應液4μL,同時加入相應的供試品DNA溶液3μL,混勻,做好標記。

(4)反應程序反應管置于PCR反應儀中按下列程序進行:94℃預變性5min,94℃ 30s,退火53℃30s,72℃45s,30個循環,72℃延伸7min,4℃。

4.結果判定

反應產物使用1.5%瓊脂糖凝膠,在DYY-Ⅲ型水平電泳儀上電泳,85mV電泳1h,分子量100bp的DNA Marker作參照,凝膠成像分析系統觀察和分析得出結果。凝膠電泳圖譜中,鼠、山羊、綿羊在100-400bp處,在與陽性對照品鼠(102bp)、山羊(219bp)、綿羊(364bp) 凝膠電泳圖譜相應位置上出現DNA條帶,空白對照無條帶,判定為含有相應肉類成分,參照圖2。

實施例二對烘培后的鼠肉、市售山羊肉及綿羊肉制品進行鑒定

材料為烘培后鼠肉(鼠肉由長春市食品藥品檢驗中心提供);市售牛肉火腿腸;市售雞肉串;市售綿羊肉卷;市售山羊肉;市售羊肉串(市售樣本均為吉林市大福源超市購買)。

1.樣本前處理

取待檢樣本50mg置于無菌燒杯中,加入10mL生理鹽水溶液浸泡20min,在平皿中用手術刀去除結締組織后將組織切碎。

2.線粒體DNA提取

(1)裂解向經過前處理的樣品中加入37℃預熱的P1溶液500μL,P2溶液30μL,P3 溶液15μL,混勻,56℃水浴振蕩1h。

(2)沉淀加入P4溶液500μL,離心(轉速為10000r/min)10min。吸取上清液500μL 和P5溶液500μL置于離心管中,-20℃放置1h,離心(轉速為10000r/min)10min,棄去上清液。

(3)洗滌用P6溶液500μL洗滌沉淀物1次,離心(轉速為11000r/min)10min,棄去上清液(重復1次),沉淀室溫干燥,加入80μL TE溶解DNA,作為供試品溶液。

3.建立PCR反應

(1)陽性對照取3支無菌空白溶液管,分別加入預混好的鼠、山羊、綿羊陽性對照反應液50μL;

(2)陰性對照取1支無菌空白溶液管,加入預混好的鑒定反應液47μL,同時加入陰性對照液3μL,混勻,做好標記。

(3)PCR反應在無菌空白溶液管中加入預混好的鑒定反應液4μL,同時加入相應的供試品DNA溶液3μL,混勻,做好標記。

(4)反應程序反應管置于PCR反應儀中按下列程序進行:94℃預變性5min,94℃ 30s,退火53℃30s,72℃45s,30個循環,72℃延伸7min,4℃。

4.結果判定

反應產物使用1.5%瓊脂糖凝膠,在DYY-Ⅲ型水平電泳儀上電泳,85mV電泳1h,分子量100bp的DNA Marker作參照,凝膠成像分析系統觀察和分析得出結果。凝膠電泳圖譜中,鼠、山羊、綿羊在100-400bp處,在與陽性對照品鼠(102bp)、山羊(219bp)、綿羊(364bp) 凝膠電泳圖譜相應位置上出現DNA條帶,空白對照無條帶,判定為含有相應肉類成分,參照圖3。

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