一種寡核苷酸標記探針原位檢測PDL1的試劑組與應用的制作方法

文檔序號:18145659發布日期:2019-07-10 11:47
一種寡核苷酸標記探針原位檢測PDL1的試劑組與應用的制作方法
本發明涉及生物
技術領域
,特別涉及一種寡核苷酸標記探針原位檢測PDL1的試劑組與應用。
背景技術
:隨著個體化精準治療的開展,更多研究者致力于調查個體對癌癥產生的免疫反應,解除腫瘤細胞免疫逃避,使免疫系統主動對癌細胞發動免疫殺傷。程序性死亡配體1(PD-L1)也被稱為白細胞分化抗原274(CD274)或B7同源物1(B7-H1),是一種由PD-L1基因編碼一種免疫抑制受體配體,可選擇性剪接形成多個轉錄變體。該蛋白是一種具有免疫球蛋白V樣和C樣結構域的I型跨膜蛋白。這種配體與其受體的相互作用抑制T細胞的活化和細胞因子的產生。主要由造血和非造血細胞(如T細胞和B細胞以及各種類型的腫瘤細胞)表達。在正常組織的感染或炎癥過程中(例如懷孕、組織移植、自體免疫疾病,以及諸如肝炎等某些疾病),這種相互作用對于通過維持免疫反應的穩態來預防自身免疫性很重要。但在腫瘤微環境中,這種相互作用通過細胞毒性T細胞失活為腫瘤細胞提供免疫逃逸。這種基因在腫瘤細胞中的表達被認為是多種人類惡性腫瘤的預后因素,包括結腸癌、肺癌和腎細胞癌等腫瘤高度表達[VelchetiV.Programmeddeathligand-1expressioninnon-smallcelllungcancer.LabInvest.2014;94(1):107–115.;OmoriS1,KenmotsuH1,AbeM2,WatanabeR3,SuginoT2,KobayashiH1,NakashimaK1,WakudaK1,OnoA1,TairaT1,NaitoT1,MurakamiH1,OhdeY4,EndoM5,AkiyamaY6,NakajimaT2,TakahashiT7.Changesinprogrammeddeathligand1expressioninnon-smallcelllungcancerpatientswhoreceivedanticancertreatments.IntJClinOncol.2018Dec;23(6):1052-1059.doi:10.1007/s10147-018-1305-4.Epub2018Jun15.]。近年來多位科學家發現,PD-L1在多種浸潤性腫瘤細胞中高表達。當T細胞上的PD-1受體與信號蛋白PD-L1結合會使腫瘤細胞能夠逃避自身免疫系統中免疫細胞攻擊,一些阻斷PD-1或PD-L1的藥物能夠重新激活免疫細胞對抗腫瘤。分析了196個腫瘤標本腎細胞癌患者發現腫瘤PD-L1高表達較低表達組腫瘤的風險率增加約4.5倍(riskratio4.53;95%confidenceinterval1.94-10.56;P<0.001.),與死亡風險增加也有關[ThompsonRH,GillettMD,ChevilleJC,LohseCM,DongH,WebsterWS,KrejciKG,LoboJR,SenguptaS,ChenL,ZinckeH,BluteML,StromeSE,LeibovichBC,KwonED.CostimulatoryB7-H1inrenalcellcarcinomapatients:Indicatoroftumoraggressivenessandpotentialtherapeutictarget.ProcNatlAcadSciUSA2004;101(49):17174–9.]。卵巢癌患者PD-L1較高的表達,顯示著較差的預后。PD-L1表達與上皮內CD8+T淋巴細胞計數呈負相關,提示腫瘤細胞PD-L1可能抑制抗腫瘤CD8+T細胞活性[HamanishiJ,MandaiM,IwasakiM,OkazakiT,TanakaY,YamaguchiK,HiguchiT,YagiH,TakakuraK,MinatoN,HonjoT,FujiiS.Programmedcelldeath1ligand1andtumor-infiltratingCD8+Tlymphocytesareprognosticfactorsofhumanovariancancer.ProcNatlAcadSciUSA2007;104(9):3360–5.]。原發性肝癌在我國和非洲地區呈現逐年增加的趨勢,中山醫院高強等研究人員通過組織芯片等高通量篩選方法發現PDL1表達豐度與肝癌預后、生存期以及復發率存在相關性,該基因可能是一個較好臨床評估指標和藥物作用靶點[QiangGao,Xiao-YingWang,Shuang-JianQiu,etal.OverexpressionofPD-L1SignificantlyAssociateswithTumorAggressivenessandPostoperativeRecurrenceinHumanHepatocellularCarcinomaClinCancerRes2009;15(3):971-979.]。許多PD-L1抑制劑正在開發的免疫治療腫瘤,在臨床試驗中顯示出良好的結果[VelchetiV.Programmeddeathligand-1expressioninnon-smallcelllungcancer.LabInvest.2014;94(1):107–115.],通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路使癌細胞死亡,具有治療多種類型腫瘤的潛力,有望實質性改善患者總生存期,其中包括Avacta生命科學開發的PD-L1inhibitor和Genentech、默沙東、百時美施貴寶、阿斯利康、羅氏等開發的抗PD-L1抗體或相關抑制劑,在某些病例中取得了較好的治療效果,因此該領域有這最大臨床檢測與治療潛力及價值[BrahmerJR1,TykodiSS,ChowLQ,HwuWJ,TopalianSL,HwuP,DrakeCG,CamachoLH,KauhJ,OdunsiK,PitotHC,HamidO,BhatiaS,MartinsR,EatonK,ChenS,SalayTM,AlaparthyS,GrossoJF,KormanAJ,ParkerSM,AgrawalS,GoldbergSM,PardollDM,GuptaA,WiggintonJM.Safetyandactivityofanti-PD-L1antibodyinpatientswithadvancedcancer.NEnglJMed.2012;366(26):2455-65.]。但是如何快速便捷確認相關組織腫瘤樣品的PDL1表達分布是針對PD-1/PD-L1信號細胞免疫治療的關鍵前提。熒光原位雜交技術(fluorescenceinsituhybridization),簡稱FISH。熒光原位雜交(FISH)基于傳統的細胞遺傳學和核酸雜交技術的結合,其基礎是Southernblot原理,以半抗原如生物素、地高辛間接標記或以熒光素直接標記的已知核酸分子為探針,探針和靶序列DNA或RNA變性后雜交,互補的異源單鏈核酸分子在適宜的溫度和離子強度下退火形成穩定的異源雙鏈結構,通過熒光標記的親和素或抗地高辛抗體將半抗原顯示出來,通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號,來確定與特異探針雜交后被染色的細胞或細胞器的形態和分布,或者是結合了熒光探針的DNA區域或RNA分子在染色體或其他細胞器中的定位。FISH具有快速靈敏、特異性好的特點,可同時分析初步分析基因豐度并進行空間定位。目前最常使用FISH的技術有如下幾種:(1)寡核苷酸探針FISH技術:最常用的寡核苷酸探針一般是15-45bp,短的探針易于結合到靶序列,但標記效果相對較弱,探針的標記有直接標記和間接標記兩種。(2)核酸肽探針FISH技術:核酸肽(PeptideNucleicAcid,PNA),一種不帶電荷的DNA類似物,其主鏈骨架是由重復的N-(2-氨基乙基)甘氨酸以酰胺鍵聚合而成,堿基通過亞甲基連接到PNA分子的主鏈上。PNA/DNA分子雜交結合力、專一性都很高,由于沒有電荷排斥力,使其雜交形成雙螺旋結構的熱穩定性高;PNA探針能夠接近位于rRNA高級結構域中的特異靶序列,極大地提高了PNA-FISH檢測的靈敏性;PNA探針一般長度為15bp,但由于靶向序列較短,可能會出現非特異結合。(3)多彩(Multicolor)FISH技術:近年來,很多學者致力于以不同染色的標記探針和熒光染料同時檢測出多個靶序列的研究,最新的多彩FISH技術可以同時用七種染色進行檢測。由以上可見,人工寡核苷探針是以核苷酸為原料,通過DNA合成儀合成,避免了真核細胞中存在的高度重復序列帶來的不利影響。由于大多數寡核苷酸序列較短,組織穿透性極好。根椐目的基因的特異性序列設計的探針,特異性較強。PDL1與多種腫瘤的形成和免疫逃避有著密切關系,并且可以作為藥物治療的作用靶標,對于該基因的有效監測和監控,可以為臨床診斷和預后提供積極參考與幫助。技術實現要素:本發明的目的是提供一種寡核苷酸標記探針原位檢測PDL1的試劑組與應用。第一方面,本發明要求保護一種用于檢測PDL1的探針組或探針。本發明所要求保護的用于檢測PDL1的探針組或探針,其中所述探針組可由如下中的全部或部分組成;所述探針可為如下任一:(a1)PDL1探針1:SEQIDNo.1所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.1中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a2)PDL1探針2:SEQIDNo.2所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.2中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a3)PDL1探針3:SEQIDNo.3所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.3中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a4)PDL1探針4:SEQIDNo.4所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.4中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a5)PDL1探針5:SEQIDNo.5所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.5中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a6)PDL1探針6:SEQIDNo.6所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.6中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a7)PDL1探針7:SEQIDNo.7所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.7中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a8)PDL1探針8:SEQIDNo.8所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.8中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a9)PDL1探針9:SEQIDNo.9所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.9中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a10)PDL1探針10:SEQIDNo.10所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.10中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a11)PDL1探針11:SEQIDNo.11所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.11中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a12)PDL1探針12:SEQIDNo.12所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.12中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a13)PDL1探針13:SEQIDNo.13所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.13中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a14)PDL1探針14:SEQIDNo.14所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.14中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a15)PDL1探針15:SEQIDNo.15所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.15中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a16)PDL1探針16:SEQIDNo.16所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.16中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a17)PDL1探針17:SEQIDNo.17所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.17中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a18)PDL1探針18:SEQIDNo.18所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.18中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a19)PDL1探針19:SEQIDNo.19所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.19中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a20)PDL1探針20:SEQIDNo.20所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.20中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a21)PDL1探針21:SEQIDNo.21所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.21中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a22)PDL1探針22:SEQIDNo.22所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.22中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a23)PDL1探針23:SEQIDNo.23所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.23中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a24)PDL1探針24:SEQIDNo.24所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.24中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a25)PDL1探針25:SEQIDNo.25所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.25中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(a26)PDL1探針26:SEQIDNo.26所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.26中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA。第二方面,本發明要求保護用于檢測PDL1的試劑盒。本發明所要求保護的用于檢測PDL1的試劑盒,含有前文第一方面所述的探針組或探針,還含有陰性對照探針。所述陰性對照探針為SEQIDNo.27所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.27中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA。進一步地,所述試劑盒中還含有陽性對照探針;所述陽性對照探針為用于檢測β-actin的探針組或用于檢測β-actin的探針,所述用于檢測β-actin的探針組可為如下中的全部或部分;所述用于檢測β-actin的探針為如下任一:(b1)β-actin探針1:SEQIDNo.28所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.28中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(b2)β-actin探針2:SEQIDNo.29所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.29中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(b3)β-actin探針3:SEQIDNo.30所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.30中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(b4)β-actin探針4:SEQIDNo.31所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.31中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(b5)β-actin探針5:SEQIDNo.32所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.32中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(b6)β-actin探針6:SEQIDNo.33所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.33中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(b7)β-actin探針7:SEQIDNo.34所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.34中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(b8)β-actin探針8:SEQIDNo.35所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.35中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(b9)β-actin探針9:SEQIDNo.36所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.36中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA;(b10)β-actin探針10:SEQIDNo.37所示的單鏈DNA,或者將SEQIDNo.37中的T替換為U后所得序列所示的單鏈RNA。在前文第一方面和第二方面中,所述探針組和所述試劑盒中的所有探針的5'端和/或3'端均可經標簽標記。進一步地,所述標簽標記可選自如下:熒光標記(如異硫氰酸熒光素FITC,羧基熒光素FAM,4甲-6羧羅丹明TAMRA,吲哚二羧菁Cy3/Cy5,四氯-6-羧基熒光素TET、六氯-6-甲基熒光素HEX、四甲基異硫氰酸鹽羅丹明TRITC等)、生物素(Biotin)標記、地高辛(Digoxigenin)標記、氨基修飾(Amine)、巰基修飾(Thiol)、膽固醇修飾(Cholesteroi)等半抗原報告分子標記。在前文第一方面和第二方面中,所述探針組和所述試劑盒中的所有探針的全部或部分中的1個或多個核苷酸經修飾。其中,所述多個核苷酸為“至少兩個核苷酸,至多為組成該探針的全部核苷酸”。進一步地,所述修飾可選自如下:N-(2-氨基乙基)甘氨酸修飾、二羥基甲氧修飾,二羥基氟代修飾、硫代磷酸酯鍵修飾、鎖核酸修飾(Lockednucleicacid,LNAβ-D-呋喃核糖的2'-O、4’-C位通過縮水作用形成剛性的結構)、PNA修飾(以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架,其余的與DNA相同)等。在本發明的具體實施方式中,所述用于檢測PDL1的探針具體為所述PDL1探針2(SEQIDNo.2),其5'端前3個和3'端后3個核苷酸均經硫代磷酸酯鍵修飾,且自5’末端開始第5、14和19位核苷酸均經鎖核酸修飾。在本發明的具體實施方式中,所述用于檢測PDL1的探針組具體由如下4個探針組成:(1)所述PDL1探針2(SEQIDNo.2),其5'端前3個和3'端后3個核苷酸均經硫代磷酸酯鍵修飾,且自5’末端開始第5、14和19位核苷酸均經鎖核酸修飾。(2)所述PDL1探針5(SEQIDNo.5),其5'端前3個和3'端后3個核苷酸均經硫代磷酸酯鍵修飾,且自5’末端開始第5、13和19位核苷酸均經鎖核酸修飾。(3)所述PDL1探針16(SEQIDNo.16),其5'端前3個和3'端后3個核苷酸均經硫代磷酸酯鍵修飾,且自5’末端開始第4、11和22位核苷酸均經鎖核酸修飾。(4)所述PDL1探針25(SEQIDNo.25),其5'端前3個和3'端后3個核苷酸均經硫代磷酸酯鍵修飾,且自5’末端開始第5、12和23位核苷酸均經鎖核酸修飾。在本發明的具體實施方式中,所述陰性對照探針具體為SEQIDNo.27所示的單鏈DNA,其5'端前3個和3'端后3個核苷酸均經硫代磷酸酯鍵修飾,且自5’末端開始第4和13位核苷酸均經鎖核酸修飾。在本發明的具體實施方式中,所述用于檢測β-actin的探針為所述β-actin探針7(SEQIDNo.34),其5'端前3個和3'端后3個核苷酸均經硫代磷酸酯鍵修飾,且自5’末端開始第6、16和19位核苷酸均經鎖核酸修飾。在本發明的具體實施方式中,所述用于檢測β-actin的探針組具體由如下4個探針組成:(1)所述β-actin探針1(SEQIDNo.28),其5'端前3個和3'端后3個核苷酸均經硫代磷酸酯鍵修飾,且自5’末端開始第7和16位核苷酸均經鎖核酸修飾。(2)所述β-actin探針3(SEQIDNo.30),其5'端前3個和3'端后3個核苷酸均經硫代磷酸酯鍵修飾,且自5’末端開始第9、19和25位核苷酸均經鎖核酸修飾。(3)所述β-actin探針7(SEQIDNo.34),其5'端前3個和3'端后3個核苷酸均經硫代磷酸酯鍵修飾,且自5’末端開始第6、16和19位核苷酸均經鎖核酸修飾。(4)所述β-actin探針9(SEQIDNo.36),其5'端前3個和3'端后3個核苷酸均經硫代磷酸酯鍵修飾,且自5’末端開始第8、14和19位核苷酸均經鎖核酸修飾。在本發明的具體實施方式中,所用的各探針均5'端經熒光標記,標記的具體是Cy3。在前文第二方面中,根據需要所述試劑盒中還可含有用于檢測PDL1基因的引物對;所述用于檢測PDL1基因的引物對為由SEQIDNo.38和SEQIDNo.39所示的兩條單鏈DNA組成的引物對。進一步地,所述試劑盒中還可含有用于檢測內參基因hGAPDH的引物對;所述用于檢測內參基因hGAPDH的引物對為由SEQIDNo.40和SEQIDNo.41所示的兩條單鏈DNA組成的引物對。上述兩個引物對可用于通過qRT-PCR進一步復核探針所檢測的PDL1基因表達趨勢。第三方面,本發明還要求保護如下任一所示應用:(A1)前文第一方面所述的探針組在制備前文第二方面所述試劑盒中的應用。(A2)前文第一方面所述的探針組或前文第二方面所述試劑盒在對PDL1進行原位檢測中的應用,或在制備用于對PDL1進行原位檢測的產品中的應用。(A3)前文第一方面所述的探針組或前文第二方面所述試劑盒在對PDL1進行表達水平和/或分布情況檢測中的應用,或在制備用于對PDL1進行表達水平和/或分布情況檢測的產品中的應用。(A4)前文第一方面所述的探針組或前文第二方面所述試劑盒在協助判斷腫瘤或參與其他細胞反應(如炎癥反應等)的發生發展階段和/或趨勢中的應用,或在制備用于協助判斷腫瘤或參與其他細胞反應(如炎癥反應等)的發生發展階段和/或趨勢的產品中的應用。進一步地,所述對PDL1進行原位檢測可為對腫瘤細胞或非腫瘤細胞中的PDL1進行原位檢測;所述對PDL1進行表達水平和/或分布情況檢測可為對腫瘤細胞或非腫瘤細胞中的PDL1進行表達水平和/或分布情況檢測。其中,所述腫瘤細胞可為癌癥細胞。在本發明的具體實施方式中,所述非腫瘤細胞具體為如下細胞:人正常肝臟細胞(如HL7702細胞)或人腎上皮細胞(如293T細胞);所述腫瘤細胞具體為人肝癌細胞(如HUH7細胞或LM3細胞)。本發明結合fish探針的原位結合可視特點和廣泛用途,開發能夠快速檢測臨床樣品癌細胞中PDL1相對表達水平與分布的寡核苷酸(fish探針法),并通過qRT-PCR進步復核其基因表達趨勢,進步豐富臨床相關應用與研究提供有效工具。附圖說明圖1為PDL1基因序列位置確定。圖2為PDL1的3個轉錄本序列分析比對圖。圖3為HL7702細胞中PDL1基因的原位檢測結果。圖4為HUH7細胞中PDL1基因的原位檢測結果。圖5為LM3細胞中PDL1基因的原位檢測結果。圖6為293T細胞中PDL1基因的原位檢測結果。圖7為RNA提取質量檢測結果。1為HL7702細胞;2為HUH7細胞;3為LM3細胞;4為293T細胞。圖8為實時熒光定量PCR檢測PDL1的擴增曲線。A為樣品HL7702.hGAPDH/hPDL1擴增曲線;B為樣品HUH7.hGAPDH/hPDL1擴增曲線;C為樣品LM3.hGAPDH/hPDL1擴增曲線;D為樣品293T.hGAPDH/hPDL1擴增曲線。A-D中,均左側圖為針對人源GAPDH擴增曲線;右側圖為人源PDL1擴增曲線;圖中各有3條曲線是三次重復檢測。圖9為實時熒光定量PCR檢測PDL1的表達豐度的數據統計柱狀圖。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業途徑得到。實施例1、寡核苷酸標記探針原位檢測PDL1一、實驗材料探針合成實驗中用到相關堿基單體即對應的核糖核苷酸(A腺嘌呤、C是胞嘧啶、U尿嘧啶、G是鳥嘌呤)和脫氧核糖核苷酸(A腺嘌呤、T胸腺嘧啶、C胞嘧啶、G鳥嘌呤)。熒光標記(異硫氰酸熒光素FITC,羧基熒光素FAM,4甲-6羧羅丹明TAMRA,吲哚二羧菁Cy3/Cy5,四氯-6-羧基熒光素TET、六氯-6-甲基熒光素HEX、四甲基異硫氰酸鹽羅丹明TRITC);生物素(Biotin);地高辛(Digoxigenin);氨基修飾(Amine);巰基修飾(Thiol);膽固醇修飾(Cholesteroi)等半抗原標記分子。以及以下修飾單體:N-(2-氨基乙基)甘氨酸修飾、二羥基甲氧修飾,二羥基氟代修飾、硫代磷酸酯鍵修飾、LNA修飾、PNA修飾原料均為蘇州吉瑪基因股份有限公司提供。HL7702細胞(人正常肝臟細胞)、HUH7細胞(人肝癌細胞)、LM3細胞(人肝癌細胞)、293T細胞(人腎上皮細胞)(上海生科院細胞庫),常規培養使用含10%胎牛血清(BI)的DMEM培養基(Corning)(含1.5mML-谷氨酸,100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素)中,37℃5%CO2飽和濕度培養箱中培養。Trypsin-EDTASolution(0.25%Trypsin+0.53mMEDTA,Hyclone)48孔板(Corning)。固定液:4%多聚甲醛。實驗過程中用到的bufferA、B、C、D、E、F均為吉瑪基因產品貨號F03501的一個試劑盒中的試劑。探針應避光稀釋并保存,且實驗過程中加入探針后的操作應在避光條件下進行。DAPI用PBS按照1:1000稀釋,需避光保存和使用。二、實驗步驟1、目的基因查找與探針設計依據官方基因信息,查找分析目的基因CD274(CD274CD274molecule[Homosapiens(human)]GeneID:29126,AlsoknownasB7-H;B7H1;PDL1;PD-L1;PDCD1L1;PDCD1LG1)即PDL1基因在染色體基因組上分布,確定目的基因位于9號染色體上,將目的基因三個轉錄本序列進行比對分析,確定保守區域與非保守區域(圖1和圖2)。針對PDL1基因外顯子區域設計26條寡合苷酸單鏈探針和一條陰性對照探針(表1)并分別進行序列比對,盡可能排除與基因組中其他基因,特別是外顯子基因的非特異性匹配。另外,設計了10條針對β-actin基因的寡合苷酸單鏈探針作為檢測時的陽性對照(表2)。表1用于檢測PDL1的26條寡合苷酸單鏈探針注:PDL1-NC為陰性對照探針。表2用于檢測PDL1的26條寡合苷酸單鏈探針2、靶點探針合成以上探針序列(表1和表2)由上海吉瑪制藥技術有限公司提供合成,可以是合成RNA探針序列或DNA探針序列,分別對應核糖核苷酸(A腺嘌呤、C是胞嘧啶、U尿嘧啶、G是鳥嘌呤)和脫氧核糖核苷酸(A腺嘌呤、T胸腺嘧啶、C胞嘧啶、G鳥嘌呤)。對以上序列分別可以進行5'端和/或3'端多種標簽標記:如進行熒光標記(異硫氰酸熒光素FITC,羧基熒光素FAM,4甲-6羧羅丹明TAMRA,吲哚二羧菁Cy3/Cy5,四氯-6-羧基熒光素TET、六氯-6-甲基熒光素HEX、四甲基異硫氰酸鹽羅丹明TRITC);生物素(Biotin);地高辛(Digoxigenin);氨基修飾(Amine);巰基修飾(Thiol);膽固醇修飾(Cholesteroi)等半抗原報告分子標記。對以上序列1個或多個堿基可以分別進行如下修飾:N-(2-氨基乙基)甘氨酸修飾、二羥基甲氧修飾,二羥基氟代修飾、硫代磷酸酯鍵修飾、鎖核酸修飾(Lockednucleicacid,簡稱LNA,β-D-呋喃核糖的2'-O、4’-C位通過縮水作用形成剛性的結構)、PNA修飾(以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架,其余的與DNA相同)。本實施例中具體選用如下探針進行下述步驟3實驗:PDL1一條探針的實驗組:5'-CTGC+TTGTCCAGA+TGACT+TCGGC-3',即基本序列為表1中的PDL1-2(SEQIDNo.2)。其中,探針的5'端前3個和3'端后3個堿基均經硫代磷酸酯鍵修飾;加號后緊挨著的一個堿基經LNA修飾,且5'端經熒光標記,標記的是Cy3。PDL1多條探針的實驗組,由如下探針組成:5'-CTGC+TTGTCCAGA+TGACT+TCGGC-3',即基本序列為表1中的PDL1-2(SEQIDNo.2);5'-GCGT+TCAGCAAA+TGCCAG+TAGGTC-3',即基本序列為表1中的PDL1-5(SEQIDNo.5);5'-ATT+TGGAGGA+TGTGCCAGAGG+TAGTT-3',即基本序列為表1中的PDL1-16(SEQIDNo.16);5'-CATT+TGGAGGA+TGTGCCAGAGG+TAGTT-3',即基本序列為表1中的PDL1-25(SEQIDNo.25)。在PDL1多條探針的實驗組中,各探針的5'端前3個和3'端后3個堿基均經硫代磷酸酯鍵修飾;加號后緊挨著的一個堿基經LNA修飾,且5'端均經熒光標記,標記的均是Cy3。PDL1陰性對照探針組:5'-GTG+TAACACGTC+TATACGCCCA-3',即基本序列為表1中的PDL1-NC(SEQIDNo.27)。其中,探針的5'端前3個和3'端后3個堿基均經硫代磷酸酯鍵修飾;加號后緊挨著的一個堿基經LNA修飾,且5'端經熒光標記,標記的是Cy3。β-actin一條探針的實驗組:5'-CCTCC+TGAGCGCAAG+TAC+TCCGTGT-3',即基本序列為表2中的β-actin-7(SEQIDNo.34)。其中,探針的5'端前3個和3'端后3個堿基均經硫代磷酸酯鍵修飾;加號后緊挨著的一個堿基經LNA修飾,且5'端經熒光標記,標記的是Cy3。β-actin多條探針的實驗組,由如下探針組成:5'-ACGCGG+TCTCGGCGG+TGGTGGCG-3',即基本序列為表2中的β-actin-1(SEQIDNo.28);5'-TCACGCCC+TGGGAAGGAA+AGGACA+AGAAGC-3',即基本序列為表2中的β-actin-3(SEQIDNo.30);5'-CCTCC+TGAGCGCAAG+TAC+TCCGTGT-3',即基本序列為表2中的β-actin-7(SEQIDNo.34);5'-TGAGGGC+AGGACT+TAGCT+TCCACAGCA-3',即基本序列為表2中的β-actin-9(SEQIDNo.36);在β-actin多條探針的實驗組中,各探針的5'端前3個和3'端后3個堿基均經硫代磷酸酯鍵修飾;加號后緊挨著的一個堿基經LNA修飾,且5'端均經熒光標記,標記的均是Cy3。3、細胞爬片制備(實驗過程中用到的bufferA、B、C、D、E、F均為吉瑪基因產品貨號F03501的一個試劑盒)(1)按照3-5×103細胞/孔的密度將貼壁細胞(HL7702細胞、HUH7細胞、LM3細胞、293T細胞)接種于48孔板(孔內提前放入已處理好的且大小合適的蓋玻片)中(建議事先鋪在CONFOCAL專用培養皿中),混勻后于37℃5%CO2培養箱中培養過夜。(2)吸棄孔板中的培養基,PBS洗兩次,每次5min。(3)吸棄PBS,每孔加入100μl4%多聚甲醛,室溫固定15min。(4)吸棄4%多聚甲醛,每孔加入100μl0.1%(體積比)BufferA(現用現配)室溫處理細胞15min。(5)吸棄0.1%BufferA,PBS洗兩次,每次5min。(6)吸棄PBS,每孔加入100μl2×BufferC,37℃培養箱放置30min。(7)吸棄2×BufferC,每孔加入100μl70%乙醇,室溫放置3min。(8)吸棄70%乙醇,每孔加入100μl85%乙醇,室溫放置3min。(9)吸棄85%乙醇,每孔加入100μl無水乙醇,室溫放置3min。(10)吸棄無水乙醇,室溫干燥。(11)BufferE提前在37℃水浴鍋孵育2h。(12)探針稀釋:可參看探針標簽或報告單上所示參數:nmole/OD260,例如:nmole/OD260=4.17,則在每OD探針干粉制品中加入41.7μl滅菌DEPC水,混勻后即得濃度約為100μM的儲存液。(13)配制探針混合液:例:70μlBufferE,2μl探針(含有1條或多條探針混合),28μlDEPC水,終體積為100μl;(可先做預實驗確定所需的探針濃度,即探針5μl~0.6μl,70μlBufferE,加DEPC水補足至100μl。)注:mix中各探針各加0.7μl。(14)每孔加入上述100μl探針混合液,73℃變性5min,37℃培養箱雜交孵育過夜12~16h。(15)雜交次日,將樣本從37℃培養箱取出,吸棄探針混合液,每孔加入100μl0.1%(體積百分比)BufferF洗滌5min。(16)吸棄0.1%BufferF,每孔加入100μl的2×BufferC洗滌5min。(17)吸棄2×BufferC,每孔加入100μl的1×BufferC洗滌5min,吸棄洗滌液。(18)吸棄1×BufferC,每孔加入100μl稀釋后的DAPI工作液(即步驟一中的“DAPI用PBS按照1:1000(體積比)稀釋,需避光保存和使用”),避光染色20min,吸棄,加入100μlPBS,盡快于熒光顯微鏡(徠卡-SP8)下觀察。三、實驗結果HL7702細胞中PDL1基因的原位檢測結果如圖3所示。HUH7細胞中PDL1基因的原位檢測結果如圖4所示。LM3細胞中PDL1基因的原位檢測結果如圖5所示。293T細胞中PDL1基因的原位檢測結果如圖6所示。由圖3-圖6所示結果,可見:PDL1表達豐度高的熒光fish探針顯示信號強,不同的細胞PDL1表達豐度不一樣,本發明所提供的PDL1探針針對PDL1表達情況可以初步顯示其豐度與位置(結合如下步驟四結果)。四、PDL1基因表達驗證通過實時熒光定量PCR的方法進步驗證PDL1在各細胞(HL7702細胞、HUH7細胞、LM3細胞、293T細胞)中的表達豐度。1、材料與方法熒光定量PCR分析(1)引物設計如表3所示。表3實時熒光定量PCR檢測PDL1所用引物(2)試劑和儀器實時熒光定量通用試劑(Cat#GMRS-001吉瑪,上海)MX3000P實時熒光定量PCR儀(Stratagene,U.S.)第一步:總RNA提取(1)往收集完畢的細胞樣品中加入1mlEzol裂解液,漩渦震蕩混勻。(2)加入0.2ml三氯甲烷,劇烈搖動10s,室溫放置1分鐘。(3)4℃,12,000g離心15min。(4)將上清水相轉移至另一新的無RNA酶離心管中,并加入等體積的100%乙醇。(5)吸取全部樣品,加入帶有2ml收集管的mini-spin離心柱。8,000g,室溫離心15s,棄盡流穿液。(6)將剩余的樣品轉移至離心柱,重復第5步。(7)往離心柱中加入700μlWB,輕蓋蓋子,8,000g,室溫離心15s,棄盡流穿液。(8)重復第7步,用500μlWB洗滌離心柱兩次。(9)將離心柱轉移至一新的無RNA酶的1.5ml離心管中,往硅膠膜中央滴加50μlDEPC水,4℃,10,000g離心3min洗脫RNA。第二步:逆轉錄反應體系逆轉錄反應體系如表4所示。表4逆轉錄反應體系組分終濃度用量2×逆轉錄緩沖液2×10μl逆轉錄引物(1μM)50nM1.2μl總RNA—2μlMMLV逆轉錄酶(200U/μl)2U/μl0.2μlDEPC水To20μl第三步:逆轉錄程序42℃30min;85℃10min。第四步:實時熒光定量反應體系實時熒光定量反應體系如表5所示。表5實時熒光定量反應體系組分終濃度用量2×定量PCRMasterMix1×10μl上游引物(20μM)0.08μM0.08μl下游引物(20μM)0.08μM0.08μlcDNA模板—2μlTaqDNA聚合酶(2.5U/μl)0.05U/μl0.4μlddH2O加至20μl第五步:定量PCR反應程序95℃變性3分鐘;95℃12秒,62℃,40秒,40個循環。2、結果(1)RNA提取質量檢測結果如表6和圖7所示。表6RNA提取質量檢測結果樣本ID樣本Type260/280濃度(ng/μl)1.HL7702RNA1.99356.62.HUH7RNA1.94320.43.LM3RNA1.97298.74.293TRNA1.96315.6結果說明:(1)RNA電泳28srRNA、18srRNA條帶清晰可見,說明RNA未降解;(2)OD值測定A260/A280在1.9~2.2之間,說明RNA未降解,提取過程中沒有蛋白污染。(2)四種細胞的hGAPDH/hPDL1擴增曲線如圖8所示。結果說明:每個樣品每個基因3個重復,精密度滿足進一步分析要求.3、原始數據和相對定量計算結果如表7至表10以及圖9所示。表7HL7702細胞擴增的原始數據和相對定量計算結果表8HUH7細胞擴增的原始數據和相對定量計算結果表9LM3細胞擴增的原始數據和相對定量計算結果表10293T細胞擴增的原始數據和相對定量計算結果結果說明,實時熒光定量檢測以上細胞中PDL1基因表達趨勢結果與本發明中開發的PDL1寡核苷酸fish探針檢測熒光豐度結果(步驟三所示)趨勢較為一致。本實施例的實驗證明,利用本發明的成套探針可成功標記細胞內或組織切片人類程序性死亡配體1(PD-L1)基因,可以方便、準確、快速地標記腫瘤細胞或非腫瘤細胞中標志基因PDL1的表達與分布,可用于協助判斷腫瘤或參與其他細胞反應(如炎癥反應等)的發生發展階段與趨勢。本發明的成套探針的穩定結合力及特異性高,非特異性背景信號低,具有很高的應用前景。<110>上海吉瑪制藥技術有限公司;蘇州吉瑪基因股份有限公司<120>一種寡核苷酸標記探針原位檢測PDL1的試劑組與應用<130>GNCLN190658<160>41<170>PatentInversion3.5<210>1<211>31<212>DNA<213>Artificialsequence<400>1aacggaagatgaatgtcagtgctacaccaag31<210>2<211>23<212>DNA<213>Artificialsequence<400>2ctgcttgtccagatgacttcggc23<210>3<211>26<212>DNA<213>Artificialsequence<400>3gttatcacaacagggtggttacagcg26<210>4<211>26<212>DNA<213>Artificialsequence<400>4gggtggttacagcgatgaaatgagat26<210>5<211>24<212>DNA<213>Artificialsequence<400>5gcgttcagcaaatgccagtaggtc24<210>6<211>25<212>DNA<213>Artificialsequence<400>6acagggtggttacagcgatgaaatg25<210>7<211>24<212>DNA<213>Artificialsequence<400>7gcgttcagcaaatgccagtaggtc24<210>8<211>22<212>DNA<213>Artificialsequence<400>8cgcttgtagtcggcaccaccat22<210>9<211>22<212>DNA<213>Artificialsequence<400>9tgctttcgccaggttccatttt22<210>10<211>23<212>DNA<213>Artificialsequence<400>10cattctcctcctctgctttcgcc23<210>11<211>19<212>DNA<213>Artificialsequence<400>11tgcaggcggacagaagcgc19<210>12<211>33<212>DNA<213>Artificialsequence<400>12aacggaagatgaatgtcagtgctacaccaaggc33<210>13<211>26<212>DNA<213>Artificialsequence<400>13ggaaccgtgacagtaaatgcgttcag26<210>14<211>22<212>DNA<213>Artificialsequence<400>14ggcattgagtggaggcaaaggg22<210>15<211>25<212>DNA<213>Artificialsequence<400>15cactgcttgtccagatgacttcggc25<210>16<211>26<212>DNA<213>Artificialsequence<400>16atttggaggatgtgccagaggtagtt26<210>17<211>29<212>DNA<213>Artificialsequence<400>17aacggaagatgaatgtcagtgctacacca29<210>18<211>28<212>DNA<213>Artificialsequence<400>18cctcgcatcatccttatgctatgacact28<210>19<211>30<212>DNA<213>Artificialsequence<400>19ctggtttgggcaagttacttaatctgtttg30<210>20<211>31<212>DNA<213>Artificialsequence<400>20ctcgcatcatccttatgctatgacactggac31<210>21<211>27<212>DNA<213>Artificialsequence<400>21catttggaggatgtgccagaggtagtt27<210>22<211>27<212>DNA<213>Artificialsequence<400>22cagggcatctgaatctcgaaacctcca27<210>23<211>25<212>DNA<213>Artificialsequence<400>23cccagaccacattggcctatttcct25<210>24<211>25<212>DNA<213>Artificialsequence<400>24cagggcatctgaatctcgaaacctc25<210>25<211>27<212>DNA<213>Artificialsequence<400>25catttggaggatgtgccagaggtagtt27<210>26<211>25<212>DNA<213>Artificialsequence<400>26ccacattggcctatttcctcctctt25<210>27<211>22<212>DNA<213>Artificialsequence<400>27gtgtaacacgtctatacgccca22<210>28<211>23<212>DNA<213>Artificialsequence<400>28acgcggtctcggcggtggtggcg23<210>29<211>31<212>DNA<213>Artificialsequence<400>29gggaaggaaaggacaagaagccctgagcacg31<210>30<211>30<212>DNA<213>Artificialsequence<400>30tcacgccctgggaaggaaaggacaagaagc30<210>31<211>30<212>DNA<213>Artificialsequence<400>31cgcctagaagcatttgcggtggacgatgga30<210>32<211>27<212>DNA<213>Artificialsequence<400>32tagcgggccactcacctgggtcatctt27<210>33<211>29<212>DNA<213>Artificialsequence<400>33gccaccagaagaggtagcgggccactcac29<210>34<211>25<212>DNA<213>Artificialsequence<400>34cctcctgagcgcaagtactccgtgt25<210>35<211>33<212>DNA<213>Artificialsequence<400>35cataggaatccttctgacccatgcccaccatca33<210>36<211>27<212>DNA<213>Artificialsequence<400>36tgagggcaggacttagcttccacagca27<210>37<211>29<212>DNA<213>Artificialsequence<400>37ccacatctgctggaaggtggacagcgagg29<210>38<211>25<212>DNA<213>Artificialsequence<400>38acaagcgaattactgtgaaagtcaa25<210>39<211>24<212>DNA<213>Artificialsequence<400>39agttcatgttcagaggtgactgga24<210>40<211>20<212>DNA<213>Artificialsequence<400>40tctctgctcctcctgttcga20<210>41<211>20<212>DNA<213>Artificialsequence<400>41gcgcccaatacgaccaaatc20當前第1頁1 2 3 
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