一種鑒定小茶尺蠖的引物、試劑盒及方法與流程

文檔序號:18145665發布日期:2019-07-10 11:47
一種鑒定小茶尺蠖的引物、試劑盒及方法與流程

本發明屬于分子生物學技術領域,具體涉及一種鑒定小茶尺蠖的引物、試劑盒及方法。



背景技術:

小茶尺蠖Ectropis obliqua Prout和灰茶尺蛾Ectropis grisescens Warren(即灰茶尺蠖)是茶樹重要的食葉性近緣種害蟲,因其形態極為相似,不容易區分,統稱“茶尺蠖”?;瘜W防治在短期內對茶尺蠖幼蟲具有一定的控制效果,但是大量使用則會帶來茶葉農藥殘留和環境污染問題,同時也會導致害蟲抗藥性的產生。近年來,隨著整個產業以及消費者對于農藥殘留問題越來越重視,喝上“放心茶”的呼聲與日俱增。茶尺蠖核型多角體病毒(Ectropis obliqua Nucleopolyhedrovirus,EoNPV)是茶尺蠖的主要病原性天敵,對茶尺蠖具有較強的致病能力,以此開發出的病毒制劑已逐步應用于茶尺蠖的防治中。另外,雖然通過昆蟲性信息素進行田間種群監測和大量誘殺也可以控制茶尺蠖為害,但是在實際應用中發現,以病毒制劑為主的生物防治僅對小茶尺蠖有用,性引誘對兩種茶尺蠖的防治效果存在差異,又因為二者形態相近,因此,需要有效的分子鑒定手段區分兩種昆蟲,再進行針對性防治。

本發明利用小茶尺蠖低覆蓋度的基因組測序數據,發現小茶尺蠖特異性基因序列,以小茶尺蠖基因組DNA為模板,采用特異性引物經PCR擴增后,與小茶尺蠖特異性基因序列進行比對即可鑒定茶尺蠖的品種。



技術實現要素:

本發明提供一種鑒定小茶尺蠖的引物,該引物可特異性的用于鑒定小茶尺蠖。本發明還提供了鑒定小茶尺蠖的試劑盒以及鑒定小茶尺蠖的方法。

本發明的目的可通過如下技術方案實現:

一種鑒定小茶尺蠖的引物,其特征在于,所述鑒定小茶尺蠖的引物包含3對引物,分別為引物對Xch1、引物對Xch2、引物對Xch3;所述引物對Xch1序列如SEQ ID NO:1-2所示,所述引物對Xch2序列如SEQ ID NO:3-4所示,所述引物對Xch3序列如SEQ ID NO:5-6所示;

所述引物對Xch1獲得的小茶尺蠖的特異性識別序列為S137625,其序列如SEQ ID NO.7所示;所述引物對Xch2獲得的小茶尺蠖的特異性識別序列為S336287,其序列如SEQ ID NO.8所示;所述引物對Xch3獲得的小茶尺蠖的特異性識別序列為S779467,其序列如SEQ ID NO.9所示;

一種鑒定小茶尺蠖的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包含上述引物對Xch1、引物對Xch2、引物對Xch3,以及小茶尺蠖的特異性識別序列。

本發明還提供了上述鑒定小茶尺蠖的引物在鑒定小茶尺蠖中的應用。

本發明還提供了上述鑒定小茶尺蠖的試劑盒在鑒定小茶尺蠖中的應用。

本發明還提供了一種鑒定小茶尺蠖的方法,其特征在于,包括以下步驟:

(1)待測樣品進行DNA提??;

(2)使用權利要求1所述的引物對Xch1、引物對Xch2、引物對Xch3,以提取的DNA為模板,進行PCR擴增;

(3)PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測是否存在預期大小條帶,再對照上述小茶尺蠖的特異性識別序列,鑒定出待測樣品的品種;

優選地,所述步驟(2)中PCR擴增的體系為50μL,其中包括2×Premix Ex Taq(Takara)25μL,DNA模板1μL,10μM濃度的上下游引物各2μL,余量為滅菌蒸餾水;

優選地,所述步驟(2)中PCR擴增的程序為:95℃預變性3min;95℃變性20s,58℃退火30s,72℃延伸1min30s,32個循環;72℃延伸8min,4℃保存。

有益效果:

采用本發明的引物或試劑盒可以快速、方便、高效的鑒定小茶尺蠖,準確度高、成本低,可產品化應用。

附圖說明

圖1本發明的引物用于鑒定小茶尺蠖的PCR擴增效果圖。

1、4、7為小茶尺蠖,2、5、8為灰茶尺蛾,3、6、9為家蠶,M1、M2為Maker。

具體實施方式

下面用實施例來進一步說明本發明,但本發明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件,或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1

一、本發明用于鑒定小茶尺蠖的引物詳見表1。

表1鑒定小茶尺蠖的引物序列

二、實驗方法

(1)收集單頭小茶尺蠖、灰茶尺蛾、家蠶4齡幼蟲,利用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒提取DNA,并通過紫外分光光度計確定濃度;

(2)以小茶尺蠖DNA作為模板,灰茶尺蛾DNA為對照,家蠶DNA作為陰性對照,在美國ABI VeritiTM 96孔基因擴增儀上進行PCR擴增反應,PCR擴增的體系為50μL,其中包括2×Premix Ex Taq(Takara)25μL,DNA模板1μL,10μM濃度的上下游引物各2μL,余量為滅菌蒸餾水;

其中,擴增程序為:95℃預變性3min;95℃變性20s,58℃退火30s,72℃延伸1min30s,32個循環;72℃延伸8min,4℃保存。

(3)對PCR產物運用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,UVP紫外凝膠成像系統觀察結果,并拍照保存(見圖1),其中1、4、7為小茶尺蠖,2、5、8為灰茶尺蛾,3、6、9為家蠶,M1、M2為Marker。

檢測結果顯示,1、4、7的PCR結果顯示檢測到與特異性識別序列S137625、S336287、S779467大小一致的條帶,且條帶單一,經測序后,1、4、7的PCR產物的序列與特異性識別序列S137625、S336287、S779467一致,可確定該檢測樣品為小茶尺蠖。

2、5、8的PCR結果顯示檢測到與特異性識別序列S137625、S779467大小接近的條帶,但條帶不單一,缺失特異性識別序列S336287。經測序后,2、8的PCR產物的序列與特異性識別序列S137625、S779467不一致,可確定該檢測樣品不是小茶尺蠖。

3、6、9的PCR結果顯示無條帶,可直接確定該檢測樣品不是小茶尺蠖。

因此,本發明引物可快速、準確的鑒定小茶尺蠖,具有產品化價值。

應理解,在閱讀了本發明的上述內容之后,上文中已經用一般性說明及具體實施例對本發明作了詳盡的描述,但在本發明基礎上,可以對之作一些修改或改進,這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此,在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進,均屬于本發明要求保護的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大學

<120> 一種鑒定小茶尺蠖的引物、試劑盒及方法

<130> 2019

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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gtttgaagca attgaagagg ctaatttgtg tataggtaat gatggcaccc ctacacgaag 120

ggtccttcct tcccagaacc cgaaatctgc agtagaccta acactatgct ctcctggcct 180

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