用于鸚鵡熱衣原體基因型檢測的引物和探針組合及應用的制作方法

文檔序號:18145670發布日期:2019-07-10 11:47
用于鸚鵡熱衣原體基因型檢測的引物和探針組合及應用的制作方法
本發明屬于分子生物學領域,具體地說,涉及用于鸚鵡熱衣原體基因型檢測的引物和探針組合及應用。
背景技術
:鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci,C.psittaci)是一種嚴格真核細胞內寄生的人畜共患病病原體,最先從鸚鵡體內被分離出來,作為一種自然疫源性病原體,其宿主范圍極其廣泛,可以引起人類、家禽、野生禽類、家畜的感染及引發多種疾病。C.psittaci的傳播主要發生于鳥類與家禽,引起禽類嚴重的呼吸道疾病、消化道疾病和生產性能的降低,由于其部分感染狀態呈隱性感染,對禽類養殖業會造成長期性危害和損失。當人類與感染C.psittaci的動物接觸時,主要經呼吸道吸入病禽糞便、分泌物、患病動物呼吸道排出的有感染性的氣溶膠,或者病原體經眼結膜、黏膜侵入人體,從而引起人類呼吸道感染,表現為非典型肺炎,以及菌血癥,臨床上稱之為鸚鵡熱(psittacosis)或鳥疫(ornithosis)。20世紀50年代以來,世界各地曾報道過幾起源于家禽和火雞的人群鸚鵡熱的爆發。如今,隨著人類大規模集約化飼養家禽以來,雞、鴨、鴿子和火雞等家禽便成為人類感染C.psittaci的重要傳染源,密集化養殖場高濃度的病原體污染環境下,對養殖人員健康的威脅愈發突出。C.psittaci還可以感染多種哺乳動物和家畜,導致牛、羊、豬等動物肺炎、腸炎,泌尿生殖道炎癥以及懷孕動物流產、早產、產弱胎或死胎。C.psittaci對不同宿主的侵襲力與致病力不同,主要依賴于其不同的血清型,目前將C.psittaci分為A,B,C,D,E,E/B,F,WC和M56共9種血清型,各血清型具有一定的宿主特異性,A型主要宿主為鸚鵡、鴿子和人;B型主要宿主為鴿子,火雞,牛;C型主要宿主為鴨子,鵝,火雞,松雞以及人類;D型主要宿主為火雞,鸚鵡,鴿子,對人的感染力較強;E型的宿主范圍最廣泛,包括鴿子,鴨子,火雞(低毒性),E型也曾從人類肺炎病例中分離得到;F型對鸚鵡的特異性很強;E/B型是近年來新鑒定的血清型,鴨子為主要感染宿主;WC型和M56型主要在野生禽類和家畜間傳播。以上可以看出C.psittaci的A型,C型,D型和E型都可在人群間傳播以及導致人的感染和發病,作為人畜共患傳染病病原,不僅對畜牧業生產造成巨大威脅與損失,也嚴重威脅人類健康。因此C.psittaci血清型的檢測對該病原的檢測和流行情況的監控,人類公共衛生防控具有重要意義。目前對C.psittaci分型的診斷方法主要有:(1)利用血清型特異性單克隆抗體進行C.psittaci血清型分型。該方法缺少現成的成套商業化血清型檢測單抗,待測衣原體菌株需要進行細胞培養和專業純化,需要專業的衣原體培養技術和相應培養條件,并且針對非典型的分離株,該方法的診斷受到限制。(2)PCR-RFLP,對ompA基因進行限制性片段長度多態性分析。該方法在臨床樣本的敏感性有所限制,若達到較好的敏感性,仍然需要樣本進行細胞培養。針對非典型分離株,該方法的診斷受到限制。(3)ompA基因測序鑒定。該方法雖最精確,但是由于費用和效率較低等因素,在臨床實際大量檢測樣本時并不作為實際檢測手段。因而當前仍然沒有一種實際且有效的檢測方法能解決C.psittaci基因分型的檢測。目前,無論基于PCR-RFLP法還是熒光定量PCR法,在國內市場尚無成熟的鸚鵡熱衣原體基因型診斷的試劑盒,同時在該人畜共患病病原—C.psittaci的基因型診斷方面的研究較少,目前為止也沒有利用基因芯片法進行高通量、高效率檢測和分析C.psittaci各基因型的成熟方案。本發明以既能用于實驗室菌株分型研究又能用于臨床快速高效檢測為目的,開發鸚鵡熱衣原體基因型特異性診斷基因芯片,為C.psittaci基因型診斷提供新的檢測方法。技術實現要素:本發明的目的是提供用于鸚鵡熱衣原體基因型檢測的引物和探針組合及應用。本發明的另一目的是提供基于ompA基因特異區的基因型(血清型)鑒定診斷基因芯片。本發明構思如下:根據C.psittaci基因序列分析結果,各血清型之間的核苷酸差異主要發生于ompA基因的4個變異區(VD1~VD4)。研究發現鸚鵡熱衣原體血清型與ompA基因型具有對應性和等價性,基于該生物信息特點,將ompA基因作為C.psittaci血清型分型的精確靶基因。為了實現本發明目的,本發明依據鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)血清型與其ompA基因型之間的對應性和等價性,通過分析與篩選鸚鵡熱衣原體ompA基因VD1~VD4區基因序列,設計并獲得C.psittaci基因型特異性探針和特異性引物。對特異性引物進行5’Biotin修飾,在芯片雜交反應中引入鏈酶親和素-辣根過氧化物酶(SA-HRP),顯色過程中加入可沉淀型的TMB底物,從而達到HRP酶催化下形成沉淀型顯色斑點,達到可視化檢測C.psittaci,并鑒定其基因型的一種新型的寡核苷酸探針基因芯片檢測法,實現高通量檢測及可視化判讀鸚鵡熱衣原體不同基因型。第一方面,本發明提供用于鸚鵡熱衣原體基因型檢測的引物,包括2對引物,引物對1和引物對2,序列分別如SEQIDNO:1-2所示和SEQIDNO:3-4所示。SEQIDNO:3所示的序列,N代表次黃嘌呤堿基I;W代表A或T;M代表A或C,Y代表C或T,R代表A或G。第二方面,本發明提供用于鸚鵡熱衣原體基因型檢測的探針組合,所述探針組合包括:鸚鵡熱衣原體A基因型特異性探針,序列分別如SEQIDNO:5-6所示;鸚鵡熱衣原體B基因型特異性探針,序列如SEQIDNO:7所示;鸚鵡熱衣原體C基因型特異性探針,序列分別如SEQIDNO:8-9所示;鸚鵡熱衣原體D基因型特異性探針,序列分別如SEQIDNO:10-11所示;鸚鵡熱衣原體E基因型特異性探針,序列分別如SEQIDNO:12-13所示;鸚鵡熱衣原體E/B基因型特異性探針,序列如SEQIDNO:14所示;鸚鵡熱衣原體F基因型特異性探針,序列分別如SEQIDNO:15-17所示;鸚鵡熱衣原體WC基因型特異性探針,序列分別如SEQIDNO:18-19所示;鸚鵡熱衣原體M56基因型特異性探針,序列如SEQIDNO:20所示。第三方面,本發明提供用于鸚鵡熱衣原體基因型檢測的引物和探針組合,包含SEQIDNO:1-4所示的引物以及SEQIDNO:5-20所示的探針組合。第四方面,本發明提供用于鸚鵡熱衣原體基因型檢測的芯片,即基于ompA基因特異區的基因型(血清型)鑒定診斷基因芯片。所述芯片包括芯片載體和SEQIDNO:5-20所示的特異性探針。優選地,所述芯片還包括2條陽性對照探針,序列分別如SEQIDNO:21-22所示;1條質控探針,序列如SEQIDNO:23所示;以及對照探針,所述對照探針為點樣稀釋液。SEQIDNO:22所示的序列,N代表次黃嘌呤堿基I;W代表A或T;M代表A或C,Y代表C或T,R代表A或G。在本發明的一個具體實施方式中,基因芯片的制備如下:將設計好的各基因型特異性探針序列交由上海生工生物有限公司合成,探針無需額外修飾和添加擺動臂,用雙蒸水稀釋各探針至100ng/μL作為儲存濃度,點樣時再用雙蒸水稀釋各儲存濃度探針至10ng/μL,作為工作濃度。用市售基因芯片點樣儀在方形尼龍膜上點樣(芯片陣列如圖1所示),之后將芯片放入紫外儀,探針面朝上,進行紫外交聯反應10-15min,之后避光2h,目的是使探針與載體充分交聯以連接牢固,完成后4℃保存芯片待用。經過不同探針濃度梯度驗證,最終得到探針的最佳稀釋濃度為6ng/μL。第五方面,本發明提供含有SEQIDNO:1-4所示的引物,SEQIDNO:5-20所示的特異性探針,所述引物和探針組合,或所述基因芯片的試劑盒。優選地,所述試劑盒還包括陽性質粒模板,所述陽性質粒模板為分別攜帶A、B、C、D、E、E/B、F、WC、M56各基因型對應的ompA基因片段的載體。更優選地,克隆載體為pMD18-T。在本發明的一個具體實施方式中,為確保本發明所述芯片檢測的準確性,所述試劑盒包括一套與所述芯片配套使用的質粒標準參比品。所述質粒標準參比品由分別含有鸚鵡熱衣原體A基因型的標準菌株VS1,B基因型的標準菌株CP3,C基因型標準菌株GR9,D基因型標準菌株NJ1,E基因型標準菌株CPMN,E/B基因型標準菌株WS/TR/E30,F基因型標準菌株VS225,WC基因型標準菌株WC和M56基因型標準菌株M56的ompA基因的重組質粒組成。所述重組質粒由pMD18-T質粒制備。具體地,所述質粒標準參比品包括以下9種質粒標準品:鸚鵡熱衣原體A基因型:pGM-T-VS1ompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體B基因型:pGM-T-CP3ompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體C基因型:pGM-T-GR9ompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體D基因型:pGM-T-NJ1ompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體E基因型:pGM-T-CPMNompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體EB基因型:pGM-T-WS/TR/E30ompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體F基因型:pGM-T-VS225ompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體WC基因型:pGM-T-WCompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體M56基因型:pGM-T-M56ompA質粒標準品。本發明提供的芯片不僅能夠檢測并判斷待測菌株是否為鸚鵡熱衣原體,如果是鸚鵡熱陽性菌株,可以直接鑒定出其基因型,該芯片的基因型特異性檢測探針包含了C.psittaci種下所有9種基因型:鸚鵡熱衣原體A基因型,B基因型,C基因型,D基因型,E基因型,E/B基因型,F基因型,WC基因型和M56基因型。第六方面,本發明提供SEQIDNO:1-4所示的引物,SEQIDNO:5-20所示的特異性探針,所述引物和探針組合,所述基因芯片或者所述試劑盒的以下任一應用:1)用于非診斷目的的鸚鵡熱衣原體基因型檢測;2)用于鸚鵡熱血清型鑒定。進一步地,所述應用包括以下步驟:1)提取樣品中的DNA;2)以步驟1)中提取的DNA為模板,利用所述引物進行PCR擴增反應;3)將PCR擴增產物與所述特異性探針進行雜交,并通過向雜交反應中引入鏈酶親和素-辣根過氧化物酶系統,在顯色過程中加入TMB底物,實現可視化檢測。優選地,本發明所述引物的5′端由Biotin修飾。具體地,步驟1)應用商品化的細菌基因組提取試劑盒提取待測病原菌的核酸樣本。步驟2)利用第一對引物(C.psitt_omp_f1和C.psitt_omp_r1)和第二對引物(C.psitt_omp_f2和C.psitt_omp_r2)的雙重PCR反應體系同時擴增并獲得芯片的靶序列,提高芯片檢測的效率。擴增出芯片探針的靶序列—ompA基因的VD1-VD2和VD3-VD4兩段目的序列區。優選地,引物終濃度為0.5μM。用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測,目的條帶分別為418bp和570bp。優選地,PCR擴增條件為:96℃預變性1min;94℃,30s;55℃,30s;72℃,30s;共40個循環;72℃延伸4min;4℃保存。步驟3)芯片雜交與顯色:本發明所述基因芯片試劑盒,包含芯片反應過程中配套使用的各工作液,包含:雜交液A、洗滌液B、洗滌液C、結合液D、顯色液(W4液)。用M1、M2和M3液(表1)配制芯片工作液:雜交液A、洗滌液B和洗滌液C(基因芯片配套試劑M1,M2,M3,W4,購自上海界源生物技術有限公司)?;蛐酒涮自噭┲械腤4液為芯片顯色反應過程中使用的沉淀型TMB顯色液。表1(1)變性與雜交過程:PCR產物:雜交液(A液)=50μL:1mL體積比配置混勻后,放入金屬浴96℃,變性4min后,放入冰盒冷卻2min,之后將基因芯片放入雜交盒內,將雜交液加于芯片陣列表面,60℃,1h進行雜交反應;(2)基因芯片的顯色及結果判讀1)洗滌1:雜交完成后,棄掉雜交盒中的雜交液,用47℃預熱好的洗滌液(B液)淋洗一遍,再用47℃預熱好的洗滌液(B液)洗滌10min,重復兩遍;2)結合HRP:配置結合液:鏈酶親和素-辣根過氧化物酶(SA-HRP):A液=1μL:2000μL的體積比配制2mL結合液D,結合液D加入到基因芯片雜交盒中,與芯片室溫孵育15min;3)洗滌2:棄結合液D后取出基因芯片用雜交液A室溫淋洗芯片兩次,洗滌液C室溫淋洗兩次;4)顯色:在芯片表面加400μLW4液(沉淀型TMB顯色液),室溫孵育2-4min后去掉顯色液,TMB在HRP的催化下形成藍色沉淀顆粒,即顯色質控位點、陽性對照位點以及被捕獲的靶基因位點呈現藍色斑點,芯片背景呈現白色。該TMB藍色沉淀型芯片顯色系統的優點是背景值低、顯色明顯、不需要額外的掃描儀,可直接肉眼觀察,根據基因芯片的陣列以及陰陽性對照,即可清晰地判讀被測菌株的基因型。根據上述技術方案,本發明至少具有下列優點及有益效果:本發明依據C.psittaci各基因型在ompA基因上的多樣性和規律性,結合基因芯片的原理和優勢以及TMB沉淀型可視化顯色系統的優勢,通過分析篩選C.psittaciompA基因序列,獲得高保守片段以及基因型間高變異片段,獲得引物和基因型特異性探針,建立一種可視化顯色的寡核苷酸探針基因芯片,實現檢測和直接判讀鸚鵡熱衣原體基因型的目的。該芯片的檢測有準確、快速、高特異和高敏感性等優點,解決了依賴血清型特異性單克隆抗體分型法、PCR-RFLP分型法和基因測序法的繁瑣、局限、低效率,在實際檢測中無法有效廣泛應用等問題。該C.psittaci基因型特異性檢測芯片適宜在中小型醫療機構、臨床現場中應用檢測,對指導臨床治療,鸚鵡熱衣原體的防控防治,以及衣原體流行病學調查具有重要意義。本發明提供的高通量、可視化、高效率C.psittaci基因型檢測基因芯片無論是實驗室研究還是臨床檢測,均可實現有效的基因分型。附圖說明圖1為本發明實施例1中鸚鵡熱衣原體基因型特異性基因芯片的點樣矩陣示意圖。圖2為本發明實施例1中待測基因樣品用特異性引物(C.psitt_omp_f1和C.psitt_omp_r1;C.psitt_omp_f2和C.psitt_omp_r2)進行雙重PCR擴增后所得產物的電泳條帶圖。其中:M:2000bpMaker;1:鸚鵡熱衣原體6BC株(基因型A);2:鸚鵡熱衣原體基因型F質粒;3:沙眼衣原體;4:肺炎衣原體;5:流產衣原體;6:鸚鵡熱衣原體CP3株(基因型B);7:大腸桿菌;8:沙門氏菌。圖3為本發明實施例2中9種鸚鵡熱衣原體基因型的各質粒標準品驗證基因芯片特異性的實驗圖譜。圖4為本發明實施例3中細胞培養菌株(A)和臨床陽性病料(B)進行鸚鵡熱衣原體基因型特異性檢測基因芯片檢驗的檢測圖。圖5為本發明實施例4中基因芯片特異性檢測結果圖。具體實施方式以下實施例用于說明本發明,但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明,實施例均按照常規實驗條件,如Sambrook等分子克隆實驗手冊(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。實施例1鸚鵡熱衣原體基因型特異性探針和引物的篩選1、材料衣原體探針和引物:委托生工生物工程(上海)股份公司進行合成?;蛐酒c樣儀,PersonalArrayerTM16個人點樣儀:由北京博奧晶典生物技術有限公司提供。細菌核酸的提取試劑盒:全式金(北京)生物技術有限公司提取試劑盒(EasyPureBacteriaGenomicDNAKit,貨號:EE161-01)。尼龍膜(NylonMembranes,positivelycharged,Roche公司):購自Sigma-Aldrich公司。辣根過氧化物酶標記鏈酶親和素(streptavidin-HRP):購自ThermoFisherScientific公司?;蛐酒涮自噭?M1,M2,M3,W4),購自上海界源生物技術有限公司。根據配比說明書(表1)配置芯片工作液:雜交液A、洗滌液B和洗滌液C?;蛐酒涮自噭┲械腤4液為芯片顯色過程中使用的沉淀型TMB顯色液。2、方法鸚鵡熱衣原體基因型特異性引物和探針的篩選過程如下:在NCBI網站的GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上檢索并下載鸚鵡熱衣原體所有菌株的ompA基因組,共包括69個菌株的基因組(表2)。表2鸚鵡熱衣原體菌株名稱應用MegAlign軟件對上述C.psittaci所有69個菌株基因組的ompA基因進行比對和篩選:根據ompA基因的特點,將ompA基因進行分區段分析,分別比對所有鸚鵡熱依原體ompA基因的VD1、VD2、VD3、VD4區以及VD區之間的五段保守區。其中,針對VD1、VD2、VD3、VD4區的篩選,旨在尋找“最高變區”。經過一系列比對后,初步篩選出一批鸚鵡熱衣原體基因型特異初篩探針,共36條。將所有這些初篩探針點制成基因芯片,通過實際標準基因組樣本檢測,以分析、驗證和評價每一條初篩探針的效率。利用鸚鵡熱衣原體所有基因型菌株的各標準基因組和標準質粒,檢測這些初篩探針的有效性,剔除非特異性雜交、低效率雜交、低敏感性的探針,旨在最終獲得實際可用的最高效的C.psittaci基因型特異性探針。經過大量的實際標準基因組樣本驗證分析,最終發現位于ompA基因VD1-VD2區的高變區和VD3-VD4區的高變區,這兩個C.psittaci高變區(VD1-VD2區和VD3-VD4區)的特點在于核苷酸堿基位點的變異呈現針對基因型典型的規律性,即基因型間差異較大,而基因型內保守度較好,且相對應的探針已經在實際檢測驗證中反應效率很好,具有高特異性和敏感性。因此將這兩段序列作為基因型特異性探針的篩選區域,最終獲得一套最優化的鸚鵡熱衣原體基因型特異性探針,所述探針的序列見SEQIDNO:5-20(表4)。由此,分別對這兩段“最高變區”序列上、下游的ompA基因保守區進行篩選比對,得到兩對通用引物,第一對引物:C.psitt_omp_f1和C.psitt_omp_r1,引物目的片段大小為418bp,所述引物的序列為:SEQIDNO:1-2;第二對引物:C.psitt_omp_f2和C.psitt_omp_r2,引物目的片段的大小為570bp;所述引物的序列為:SEQIDNO:3-4(表3)。同時設計該基因芯片的顯色質控探針兼定位探針、陽性對照探針和陰性對照探針:與C.psitt_omp_f1和C.psitt_omp_f2引物互補的序列作為陽性對照探針,以雜交液作為陰性對照探針,顯色質控探針兼定位探針是20T序列,并在5’端連接生物素(Biotin)。所述顯色質控探針兼定位探針。表3鸚鵡熱衣原體特異性擴增引物表4鸚鵡熱衣原體基因型特異性寡核苷酸探針序列以上序列中所涉及的簡并堿基的信息如下:簡并堿基N代表次黃嘌呤核苷酸I;簡并堿基W代表核苷酸:A,T;簡并堿基代表M代表核苷酸A,C;簡并堿基Y代表核苷酸C,T;簡并堿基R代表核苷酸A,G。實施例2鸚鵡熱衣原體基因型特異性基因芯片的制備本實施例通過由實施例1中所述最終獲得的最優引物和探針制備芯片,并對芯片雜交條件和顯色條件進行優化,最終優選出制作芯片的最佳反應體系,保證本芯片的檢測結果達到最優。1、材料衣原體探針和引物:委托生工生物工程(上海)股份公司進行合成?;蛐酒c樣儀,PersonalArrayerTM16個人點樣儀:由北京博奧晶典生物技術有限公司提供。細菌核酸的提取試劑盒:全式金(北京)生物技術有限公司提取試劑盒(EasyPureBacteriaGenomicDNAKit,貨號:EE161-01)。尼龍膜(NylonMembranes,positivelycharged,Roche公司):購自Sigma-Aldrich公司。辣根過氧化物酶標記鏈酶親和素(streptavidin-HRP):購自ThermoFisherScientific公司?;蛐酒涮自噭?M1,M2,M3,W4),購自上海界源生物技術有限公司。根據配比說明書(表1)配置芯片工作液:雜交液A、洗滌液B和洗滌液C?;蛐酒涮自噭┲械腤4液為芯片顯色過程中使用的沉淀型TMB顯色液。2、方法2.1鸚鵡熱衣原體基因型特異性基因芯片的制備過程以及探針陣列將最終確定的探針和引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成,探針無需添加擺動臂以及特殊修飾,參照表3在每條引物的5’進行Biotin修飾。合成的引物和探針干粉置于-20℃冰箱儲存備用。將裝有探針(干粉)的離心管置于離心機內,以12000rpm離心5min,加入雙蒸水稀釋各探針至濃度為100ng/μL作為儲存濃度,點樣時用雙蒸水稀釋探針至10ng/μL作為工作濃度。確定最終的探針陣列,為5×5陣列,探針陣列見圖1。陣列圖中各字母代表的探針如下:A1C.psittaciA基因型探針SEQIDNO:5F2C.psittaciF基因型探針SEQIDNO:16A2C.psittaciA基因型探針SEQIDNO:6F3C.psittaciF基因型探針SEQIDNO:17BC.psittaciB基因型探針SEQIDNO:7WC1C.psittaciWC基因型探針SEQIDNO:18C1C.psittaciC基因型探針SEQIDNO:8WC2C.psittaciWC基因型探針SEQIDNO:19C2C.psittaciC基因型探針SEQIDNO:9M56C.psittaciM56基因型探針SEQIDNO:20D1C.psittaciD基因型探針SEQIDNO:10PC1陽性對照探針SEQIDNO:21D2C.psittaciD基因型探針SEQIDNO:11PC2陽性對照探針SEQIDNO:22E1C.psittaciE基因型探針SEQIDNO:12SC顯色質控探針SEQIDNO:23E2C.psittaciE基因型探針SEQIDNO:13NC陰性探針雜交液E/BC.psittaciE/B基因型探針SEQIDNO:14F1C.psittaciF基因型探針SEQIDNO:15按照圖1所述的探針陣列,用市售的基因芯片點樣儀(北京博奧晶典生物技術有限公司)按已設定好的程序以接觸式或噴射式形式在方形尼龍膜上點樣;或者在沒有點樣儀的情況下,可以手工制備基因芯片:用10μL的移液槍,調至0.2μL后吸取相應稀釋好的探針,在方形尼龍膜上點樣(點樣陣列如圖1所示)。芯片點制完成后放入紫外儀,交聯反應10min后避光2h,使探針與載體充分交聯,之后保存備用。2.2雙重PCR反應特異性擴增病原菌核酸的提取使用全式金(北京)生物技術有限公司的細菌基因組快速提取試劑盒(EasyPureBacteriaGenomicDNAKit,貨號:EE161-01)進行病原菌核酸的提取,操作按說明書要求進行。利用第一對引物(C.psitt_omp_f1和C.psitt_omp_r1)和第二對引物(C.psitt_omp_f2和C.psitt_omp_r2)的雙重PCR反應體系(表5)提高芯片檢測的效率,擴增出芯片探針的靶序列—ompA基因的VD1-VD2和VD3-VD4兩段目的序列區。所優選的引物終濃度為0.5μM。用瓊脂糖凝膠電泳對雙重PCR產物進行檢測,目的條帶分別為418bp和570bp。合成的引物干粉置于離心機內,以12000rpm離心5min,加入雙蒸水稀釋至濃度為100μM作為儲存濃度,PCR時取10μL用雙蒸水稀釋至10μM作為工作濃度。表5雙重PCR體系組分體積終濃度模板2.0μLC.psitt_omp_f11μL0.5μMC.psitt_omp_r11μL0.5μMC.psitt_omp_f21μL0.5μMC.psitt_omp_r21μL0.5μMPCRSuperMix25μLddH2O19μL總體積50μLPCR擴增反應條件為:96℃預變性1min;94℃,30s;55℃,30s;72℃,30s;共40個循環;72℃延伸4min;4℃保存。反應結束后,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測,目的條帶大小為417bp和570bp。圖2為選取的衣原體菌株基因樣品經PCR擴增后產物的電泳圖。4℃保存PCR產物或進行下一步實驗。2.3基因芯片雜交與顯色方案2.3.1建立芯片雜交體系(1)變性與雜交:PCR產物:雜交液(A液)=50μL:1mL體積比配置混勻后,放入金屬浴96℃,變性4min后,放入冰盒冷卻2min,之后將基因芯片放入雜交盒內,將雜交液加于芯片陣列表面,60℃,1h進行雜交反應;(2)基因芯片的顯色及結果判讀1)洗滌1:雜交完成后,棄掉雜交盒中的雜交液,用47℃預熱好的洗滌液(B液)淋洗一遍,再用47℃預熱好的洗滌液(B液)洗滌10min,重復兩遍;2)結合HRP:配制結合液:鏈酶親和素-辣根過氧化物酶(SA-HRP):A液=1μL:2000μL的體積比配制2mL結合液D加入到基因芯片雜交盒中,與芯片室溫孵育15min;3)洗滌2:棄結合液D后取出基因芯片用雜交液A室溫淋洗芯片兩次,洗滌液C室溫淋洗兩次;4)顯色:在芯片表面加400μLW4液(沉淀型TMB顯色液),室溫孵育2-4min后去掉顯色液,TMB在HRP的催化下形成藍色沉淀顆粒,即顯色質控位點、陽性對照位點以及被捕獲的靶基因位點呈現藍色斑點,芯片背景呈現白色。該TMB藍色沉淀型芯片顯色系統的優點是背景值低、顯色明顯、不需要額外的掃描儀,可以直接肉眼清晰地觀察,根據基因芯片的陣列以及陰陽性對照,即可直接判讀被測菌株的基因型。2.3.2雜交反應體系的最優化使用最優化的雜交反應條件可以確保和提高本發明基因芯片的特異性及靈敏度,本發明優化了以下條件:探針點樣濃度、雜交反應液配比比例、雜交反應溫度與時間、洗滌條件、結合液孵育溫度與時間、顯色反應時間等多個參數進行探索,最優條件的摸索和篩選如表6所示。表6基因芯片雜交反應的條件優化參數最終優選出的本芯片的最佳反應體系為:探針最佳點樣濃度為6ng/μL,雜交過程中反應液最優配比比例為50μL:1mL,雜交反應的最優溫度為55℃、最優時間為60min,洗滌條件為水浴37℃,3次,之后結合液孵育最優時間和溫度為水浴37℃、20min,最終最佳顯色條件為室溫避光2-4min。在一系列最優化體系條件下進行芯片反應,本芯片的檢測結果達到最優,芯片特異性、重復性、穩定性均良好。實施例3鸚鵡熱衣原體質粒標準參比品的構建本實施例建立了一套該基因芯片的配套質粒標準參比品,從而減少從衣原體病原純化標準基因組機會,降低感染幾率,更方便的驗證和檢測基因芯片的效率;同時也作為衣原體種特異性芯片檢測試劑盒相配套的標準參比品,在臨床檢樣過程中建立陽性對照。1、材料:各基因型標準菌株:基因型標準菌株AVS1BCP3CGR9DNJ1ECPMNFVS225E/BWS/TR/E30M56M56WCWC本實驗室保藏有鸚鵡熱衣原體A、B、C和D基因型標準株或基因組。細菌基因組DNA提取試劑盒:北京全式金生物技術有限公司的EasyPureBacteriaGenomicDNAKit,貨號:EE161-01。質粒DNA可視化提取試劑盒:PlasmidMiniPrepKit,貨號:EM101-01。pEASY-T1CloningKit試劑盒:北京全式金生物技術有限公司,貨號:CT101-01,本快速克隆試劑盒中包含的克隆載體為pMD18-T載體。微量分光光度計:Nano-300型,杭州奧盛儀器有限公司。2、方法:2.1提取基因組:將以上擁有菌株分別培養純化以后,進行提取基因組,用針對鸚鵡熱衣原體ompA基因的特異性引物做PCR靶序列擴增,PCR結果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收和純化PCR產物,并提交與生工生物工程(上海)股份有限公司測序比對,以達到雙重驗證。其余E、F、E/B、M56和WC基因型均未獲得標準菌株或基因組,為滿足實驗需求,本發明由上海生工生物有限公司根據NCBI網站GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上已經公開的鸚鵡熱衣原體CPMN株(E基因型)、鸚鵡熱衣原體VS225株(F基因型)、鸚鵡熱衣原體WS/TR/E30株(E/B基因型)、鸚鵡熱衣原體M56株(M56基因型)和鸚鵡熱衣原體WC株(WC基因型)的ompA基因脫氧核苷酸序列合成以上所述五個C.psittaci基因型的標準菌株的ompA序列樣品,并按一定濃度稀釋后儲存備用。2.2克隆質粒的構建和制備:應用pEASY-T1CloningKit試劑盒進行克隆載體的構建??寺》磻w系如表7所示:表7克隆反應體系成分體積PCRProduct0.5-4μLpEASY-T1CloningVector1μL離心管中加好試劑后輕輕混合后,室溫(20℃-37℃)反應5分鐘。反應結束后,至于冰上。加連接產物于50μLTrans1-T1感受態細胞中,輕彈混勻,冰浴20-30分鐘;42℃水浴熱激30秒,立即至于冰上2分鐘;取250μL至LB培養基,200rpm、37℃培養1小時;取200μL菌液均勻的涂在含有IPTG和X-gal的平板上,進行篩選培養。2.3陽性克隆質粒的檢測與質粒DNA的提取通過PCR方法、限制性酶切分析以及測序三種方法對陽性克隆質粒進行檢測和驗證。對測序含目標片段的單克隆菌液使用質粒小提試劑盒提取質粒DNA,用微量分光光度計測定所提質粒的濃度,根據公式計算出拷貝數,無DNA酶水稀釋成梯度:1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL,分裝后-20℃儲存備用。4、最終成功構建獲得9種鸚鵡熱衣原體各基因型標準株的質粒標準參比品如下:鸚鵡熱衣原體A基因型:pGM-T-VS1ompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體B基因型:pGM-T-CP3ompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體C基因型:pGM-T-GR9ompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體D基因型:pGM-T-NJ1ompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體E基因型:pGM-T-CPMNompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體EB基因型:pGM-T-WS/TR/E30ompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體F基因型:pGM-T-VS225ompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體WC基因型:pGM-T-WCompA質粒標準品;鸚鵡熱衣原體M56基因型:pGM-T-M56ompA質粒標準品。經過多重驗證,所構建的質粒標準品準確無誤,圖3為12種衣原體種的質粒標準品驗證本基因芯片的實驗結果圖。本發明構建的質粒標準品在芯片檢測中效果良好,各種之間特異性達標,可以作為芯片驗證和檢樣的標準依據,以及作為特異性和靈敏度檢測的參考品。實施例4鸚鵡熱衣原體種特異性檢測的芯片的樣本檢測以及符合性評價本實施例用于使用本發明所提供的芯片,檢測細胞培養菌株標本、臨床所采的咽喉拭子、泄殖腔拭子、肺泡灌洗液、胎盤膜、陰道分泌物中的鸚鵡熱衣原體病原以及對鸚鵡熱衣原體基因型進行鑒別。1、材料:細菌基因組DNA提取試劑盒:全式金生物技術(北京)有限公司EasyPureBacteriaGenomicDNAKit,貨號:EE161-01?;蛐酒簩嵤├?制備的試劑盒。參比組:衣原體ompA基因測序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。樣本來源:(1)標準基因組來源:15份細胞培養菌株培養皿(包含鸚鵡熱衣原體:6BC株、CP3株、NJ1株、GR9株;沙眼衣原體:D/UW-3/CX株;肺炎衣原體:N16株;流產衣原體:B577株;鼠衣原體:Mopn株以及陰性純細胞培養物)。(2)臨床樣本:咽喉拭子、泄殖腔拭子、肺泡灌洗液、胎膜、陰道分泌物樣本。2、方法:基因組純化:細胞培養菌株標本、咽喉拭子、泄殖腔拭子、肺泡灌洗液、胎膜、陰道分泌物樣本,經過適當滅菌生理鹽水稀釋后,可以直接用試劑盒提取核酸樣品;完成核酸準備后,可以按照如實施示例1.中所述,利用本發明的衣原體種屬特異性基因芯片進行待測基因樣品的檢測和衣原體種屬性鑒別。隨機選取基因芯片非相關人員培養的15份細胞培養菌株培養皿(包含鸚鵡熱衣原體:6BC株、CP3株、NJ1株、GR9株;沙眼衣原體:D/UW-3/CX株;肺炎衣原體:N16株;流產衣原體:B577株;鼠衣原體:Mopn株以及陰性純細胞培養物)進行盲測;選取臨床采集的80份病料(包含咽喉拭子、肺泡灌洗液、胎膜、陰道分泌物)進行檢測,以上檢測同時用測序法結果比對,從而驗證本發明基因芯片的準確性和符合性。3、結果:用本發明鸚鵡熱衣原體基因型特異性基因芯片對標準菌株細胞培養樣本以及臨床疑似病料樣本進行檢測,并與生工生物工程(上海)股份有限公司對相應衣原體ompA基因的測序結果進行比對,芯片法與測序法檢測結果如表8所示。表8衣原體種屬特異性基因芯片的樣本檢測以及符合性驗證統計芯片法檢測樣本的符合率如下:樣品類型樣本量基因芯片檢測結果與測序結果的符合率細胞培養菌株15皿100%臨床采集病理樣品45份97.78%圖4為細胞培養菌株以及臨床疑似病料所提取的基因組進行基因芯片檢測的結果。4、從該基因芯片檢測結果與測序結果的符合率統計得出:該芯片針對背景比較簡單、干凈的細胞培養物樣品,檢測的準確性與符合性可達100%,在臨床采集的背景復雜且病原載量相對很低的病料檢測方面,芯片檢測的準確性與符合性可達97.78%。因此,可判斷本發明的鸚鵡熱衣原體基因型特異性基因芯片的準確性和符合性都相對很高,不僅能用于實驗室診斷研究,也可以在實際中準確檢測樣品。實施例5鸚鵡熱衣原體種特異性檢測芯片的特異性評價本實施例用于對衣原體種特異性檢測芯片進行特異性評價。選擇流產衣原體,肺炎衣原體,沙眼衣原體,豬衣原體,家畜衣原體,大腸桿菌、沙門氏菌、肺炎支原體和H9N2禽流感病毒作為C.psittaci基因型檢測芯片的特異性驗證樣本。利用上述制備的鸚鵡熱衣原體基因型特異性診斷基因芯片進行檢測,驗證該基因芯片的特異性。其中,病毒樣品提取病毒RNA后,先將RNA反轉錄成cDNA,再進行PCR和芯片檢測。1、材料:菌種來源:鸚鵡熱衣原體CB3株(基因型A)、鸚鵡熱衣原體CP3株(基因型B)、鸚鵡熱衣原體9N株(基因型D)、肺炎衣原體、沙眼衣原體、肺炎支原體、大腸桿菌、H9N2。細菌基因組DNA提取試劑盒:全式金生物技術(北京)有限公司的EasyPureBacteriaGenomicDNAKit,貨號:EE161-01?;蛐酒簩嵤├?制備的試劑盒。2、方法:用衣原體種屬特異性基因芯片在優化的條件下進行檢測,驗證該基因芯片的特異性。3、結果如圖5所示,上述常見病原體的檢測結果均為陰性,說明該基因芯片特異性良好。本發明所述的基因芯片特異性良好,針對每個單獨的菌種或者模擬臨床實際多種衣原體混合感染的情況下,進行鸚鵡熱衣原體基因型特異性檢測,芯片依然能區分并鑒定鸚鵡熱衣原體的基因型,達到良好的檢測效果,適用于臨床實際樣品分析。實施例6鸚鵡熱衣原體種特異性檢測芯片的靈敏度分析本實施例用于對鸚鵡熱衣原體基因特異性基因芯片的靈敏性進行評價。1、材料:質粒標準品:實施例3制備的質粒;基因芯片:實施例2制備的芯片;2、方法分別將以上所述實施例3中制備的鸚鵡熱衣原體各基因型質粒標準品設置稀釋濃度梯度,檢測基因芯片的敏感性和最低檢測限度。濃度分別為106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL,采用優化后的芯片反應體系進行芯片檢測。3、結果結果表明本發明的鸚鵡熱衣原體基因型檢測芯片對鸚鵡熱衣原體A、B、C、D、E、E/B、F、WC、M56各基因型的檢測限為2×103copies/反應(2指PCR反應時添加的質粒模板的量),故本發明的基因芯片檢測各種衣原體的最低檢測限為2×103copies/反應,性能較優。雖然,上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述,但在本發明基礎上,可以對之做一些修改或改進,這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此,在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進,均屬于本發明要求保護的范圍。序列表<110>中國農業大學<120>用于鸚鵡熱衣原體基因型檢測的引物和探針組合及應用<130>KHP191110709.9<160>23<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1actacggagattatgttttcgatcgtgt28<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>2cgtgcaccyacgctccaaga20<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>3ggngcwgmnttccaataygcncartc26<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>4tccttagaatctgaattgagc21<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>5ggttttcagctgcaagctcaatctc25<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>6cccaagccttataggatcaaccactg26<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>7gctaccaactcaacctctaccgatct26<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>8agctccttaacaaatgaccaacttccc27<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>9tggcctctgctgttatgaacttgac25<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>10tcaataatcaacttccaaacgtagccatca30<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>11tgtcgacggtaccaatacttactctga27<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>12cgagcttccaatgcaacttcctaac25<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>13actactttgcccaataatggtggtaagg28<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>14ccagctcaacctctaccgagct22<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>15ccgtagcagctgatcaacttcca23<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>16agctttagatgctagcaacaaattctgc28<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>17agccgctgctgttttgaacttga23<210>18<211>29<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>18ggaattgctggaaatagcgaaagtaatgc29<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>19tggctactgctgttttagacgca23<210>20<211>26<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>20gcagttagtaccgatcttccaaagca26<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>21actacggagattatgttttcgatcgtgt28<210>22<211>26<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>22ggngcwgmnttccaataygcncartc26<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>23tttttttttttttttttttt20當前第1頁1 2 3 
再多了解一些
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