一種檢測茶卡羊SHE基因CNV標記的方法及其應用與流程

文檔序號:18145664發布日期:2019-07-10 11:47
一種檢測茶卡羊SHE基因CNV標記的方法及其應用與流程

本發明屬于分子遺傳學領域,具體涉及茶卡羊SHE基因CNV標記的檢測。



背景技術:

綿羊在世界各地均有飼養,性情溫順,易馴化,可以為人類提供肉和毛皮等產品。體尺性狀和羊肉的質量是由多種基因共同調控的。隨著對基因組研究的深入,有證據證明拷貝數變異(Copy Number Variations,CNVs)可能影響相關基因的轉錄翻譯,從而調控基因網絡,進而影響個體表型變化,因此優化與體尺性狀相關的候選DNA標記如CNV標記有助于加速綿羊的育種進程。

拷貝數變異一般是指在全基因組范圍大于50bp的缺失、復制和插入的結構變異,是基因組內發生重排導致的,可以通過劑量效應改變對劑量效應敏感基因的表達水平;通過產生融合基因、基因功能阻斷、位置效應、隱性等位基因的去除效應等影響基因的功能和個體間的表型。

目前,人和動物全基因組范圍內的CNVs檢測方法主要有三種:微陣列比較基因組雜交芯片(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)、單核苷酸多態性芯片(SNP Array)和二代測序技術(Next-Generation Sequencing,NGS)。在比較基因組雜交芯片中寡核苷酸探針芯片被廣泛使用,具有高靈敏度、高精度和樣本量小的特點;SNP Array是利用芯片探針的平均信號強度和最小等位基因頻率,并結合統計模型進行拷貝數的推斷,但其準確性并不比aCGH芯片高,而且不同算法檢測的結果差異較大?,F有的芯片平臺對新的拷貝數變異的檢測效率很低,隨著二代測序技術的發展,當前最有效的CNVs檢測手段是通過重測序來檢測基因組結構變異,但這種方法相較之前的方法成本較高。

目前,對基因組己知的CNV檢測主要有兩種方法,基于PCR的檢測技術和基于雜交的檢測技術。PCR檢測技術主要包括實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)、依賴連接的多重擴增探針雜交技術(Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification,MLPA)和短片段多重定量技術(Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent Fragments,QMPSF)。目前使用最廣泛的是qPCR技術,該方法敏感性高、操作方法簡單、速度快、重復性好而且污染少。雜交技術主要包括Southern blotting雜交、熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)、多重擴增探針雜交技術(Multiplex Amplifiable Probe Hybridization,MAPH)等,但這些方法成本比較高,時間長而且不夠準確,目前使用較少。

SHE蛋白包含轉化蛋白E的Src同源結構域(Src Homology2Domain Containing E),是SH2家族的重要成員。SH2是一個結構保守的蛋白域,它的功能是特異性識別磷酸化酪氨酸殘基,從而使含有SH2結構域的蛋白質定位于酪氨酸磷酸化位點,該過程是膜信號轉導的基本步驟,其中細胞外區室中的信號被受體“感知”并且在細胞內區室中轉化成磷酸化酪氨酸的化學形式,最終導致基因表達或其他細胞反應。但SHE基因在綿羊等家畜上的功能研究還沒有相關報道。



技術實現要素:

本發明的目的在于提供一種檢測茶卡羊SHE基因CNV標記的方法及其應用。

為達到上述目的,本發明采用了以下技術方案:

一種檢測茶卡羊SHE基因CNV標記的方法,包括以下步驟:

以茶卡羊血液全基因組DNA為模板,以引物對SHE-CNV及引物對ANKRD1-REF為引物,通過實時熒光定量PCR分別擴增SHE基因的拷貝數變異區域及作為內參序列的ANKRD1基因的部分片段,然后根據定量結果鑒定茶卡羊SHE基因的拷貝數變異類型;所述的SHE基因拷貝數變異區域位于SHE基因參考基因組序列NC_019458.2的103174001bp至103176000bp,共2000bp。

優選的,所述的拷貝數變異類型是根據2*2-ΔCt將定量結果分為的三類:插入型,2*2-ΔCt>2.5;缺失型,2*2-ΔCt<1.5;正常型,1.5≤2*2-ΔCt≤2.5(一般2*2-ΔCt≈2)。

優選的,所述的引物對SHE-CNV為:

上游引物F1:5’-AACAAAGCGCATTTAGGGCA-3’

下游引物R1:5’-ACGTCATGATCCAGCGATAGT-3’;

所述的引物對ANKRD1-REF為:

上游引物F2:5’-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3’

下游引物R2:5’-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3’。

優選的,所述的實時熒光定量PCR的擴增體系為:25ng/μL模板DNA 1μL、10pmol/L的引物對SHE-CNV或引物對ANKRD1-REF所對應的上、下游引物各0.5μL以及2×SYBR Green qPCR Mix6.25μL和ddH2O4.25μL。

優選的,所述的實時熒光定量PCR的反應程序為:1)95℃預變性10min;2)95℃變性15s,60℃退火1min,共40個循環;3)繪制熔解曲線(Bio Rad CFX96 3.1)。

優選的,基于引物對SHE-CNV擴增的PCR產物片段大小為174bp,基于引物對ANKRD1-REF擴增的PCR產物片段大小為143bp。

上述檢測茶卡羊SHE基因CNV標記的方法在茶卡羊分子標記輔助選擇育種中的應用。

優選的,茶卡羊群體中具有正常型拷貝數變異類型的個體在體長等生長性狀上優于缺失型和插入型拷貝數變異類型的個體。

一種檢測茶卡羊SHE基因CNV標記的實時熒光定量PCR試劑盒,包括上述引物對SHE-CNV及引物對ANKRD1-REF。

本發明的有益效果體現在:

本發明根據所發現的位于綿羊SHE基因候選區域Chr1:103174001bp-103176000bp的拷貝數變異位點,建立了通過實時熒光定量PCR技術檢測該位點在茶卡羊群體中的拷貝數變異情況的方法,檢測方法操作簡便,可以快速、準確、可靠的獲得茶卡羊個體SHE基因拷貝數變異類型;通過對茶卡羊SHE基因拷貝數變異與體高、體長、體重、胸圍等重要經濟性狀進行關聯分析,發現茶卡羊SHE基因的對應拷貝數變異位點可以作為CNV標記,其檢測不受個體年齡和性別的限制,可用于早期選育,為綿羊生長性狀的分子標記輔助選擇提供科學依據,從而加快優勢綿羊種群的建立及育種進程(例如,可用于加快茶卡羊體長性狀的選育進程)。

附圖說明

圖1為本發明實施例中進行qPCR繪制的擴增曲線。

圖2為本發明實施例中進行qPCR繪制的熔解曲線。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明做詳細說明。

本發明利用實時熒光定量PCR對茶卡羊SHE基因的拷貝數變異進行檢測并用于分子育種,包括以下步驟:

(1)根據NCBI數據庫的綿羊SHE基因序列,用Primer5.0軟件進行引物設計;

(2)采用實時熒光定量PCR(qPCR)技術檢測候選位點在群體中的拷貝數變異情況;

(3)利用SPSS23.0軟件將拷貝數變異類型與綿羊生長性狀進行關聯分析,篩選到一個與茶卡羊生長性狀相關的CNV標記;該CNV標記位于綿羊SHE基因(GenBank Accession No.NC_019458.2)參考序列的103174001-103176000區域內。

(4)根據拷貝數變異類型進行生長性狀優異的綿羊優勢種群選育。

1、茶卡羊樣本采集

本發明以茶卡羊作為檢測對象,302頭茶卡羊的血液樣本采集自青海省烏蘭縣茶卡鎮(2018年5月采集)。

2、血樣DNA的提取

1)冰凍的血樣在室溫水浴中融化,將1mL全血轉入一個無菌的2mL離心管中。

2)加入等體積的PBS緩沖液,溫和搖動10min,室溫3500g離心10min。

3)用移液器棄上清,重復步驟2至上清液透明,沉淀無色。

4)離心管中加DNA提取液1mL,溫和搖動使細胞沉淀懸浮,加入蛋白酶K3μL(終濃度為60μg/mL),混勻。

5)在恒溫水浴箱中55℃溫育過夜(16h左右),至細胞沉淀物被完全消化,溶液澄清。

6)反應液冷卻至室溫,加入1倍體積(1mL)的Tris飽和酚,放置冰上溫和搖動20min,4℃,12000g離心10min。

7)將上層水相用移液器移到另一滅菌離心管中。

8)加入0.5倍體積(0.5mL)的酚和0.5倍體積(0.5mL)的氯仿,放置冰上溫和搖動20min,4℃12000g離心10min。

9)將上層水相用移液器移到另一滅菌離心管中。

10)加入1倍體積的氯仿,放置冰上溫和搖動20min,4℃12000g離心10min。

11)將上層水相用移液器移到另一滅菌離心管中。

12)加入2倍體積的預冷無水乙醇(-20℃),輕輕口底搖晃多次至DNA析出,然后-20℃放置30min。

13)用玻璃鉤將DNA團轉入一新的滅菌離心管中,4℃12000g離心10min,棄去乙醇。

14)加入70%乙醇1mL,溫和搖動10min,4℃12000g離心10min,棄乙醇,重復漂洗一次。

15)真空干燥或室溫下使乙醇揮發干凈,根據DNA的量,加入超純水100~300μL,4℃保存至DNA完全溶解,分光光度計測定濃度后,-80℃保存。

3、目標序列及內參序列的擴增

以NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的綿羊SHE基因序列(GenBank Accession No.NC_019458.2)為參考序列,利用Primer5.0設計擴增茶卡羊SHE基因對應拷貝數變異區域(目標序列)的實時熒光定量PCR引物對。通過繪制的擴增曲線(圖1)和熔解峰來確定引物是否適用于qPCR分析。內參序列為已知的不存在拷貝數變異的序列,具體選擇為ANKRD1基因中的一段143bp的序列。目標序列和內參序列的擴增引物對序列信息具體參見表1(2018年7月)。

表1.實時熒光定量PCR的引物信息

根據繪制的熔解曲線,各樣品曲線吻合在一起,且曲線走勢平滑,峰高且尖,無引物二聚體或非特異擴增引起的雜峰(圖2)。

上述實時熒光定量PCR所用的擴增體系以12.5μL計為:25ng/μL模板DNA 1μL,10pmol/L的上、下游引物各0.5μL,2×SYBR Green qPCR Mix6.25μL,ddH2O4.25μL。

上述實時熒光定量PCR所用的擴增反應程序為:1)95℃預變性10min;2)95℃變性15s,60℃退火1min,共40個循環;3)繪制熔解曲線(Bio Rad CFX96 3.1)。

4、拷貝數變異的推斷

每個樣品分別用目標序列和內參序列的引物進行擴增,并且每對引物3個重復。根據2*2-ΔCt方法進行拷貝數的分析。其中ΔCt=Ct目的序列–Ct內參序列。2*2-ΔCt表示的是拷貝數。根據2*2-ΔCt將定量結果分為三類:插入型(Gain),2*2-ΔCt>2.5;缺失型(Loss),2*2-ΔCt<1.5;正常型(Normal),2*2-ΔCt≈2。Ct即Cycle threshold,為PCR擴增過程中,擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數。

5、SHE基因CNV位點與生長性狀的關聯分析

生產數據:體高、體長、胸圍、體重。

關聯分析模型:先對數據進行描述分析,確定是否存在離群值,再利用最小二乘分析對數據校正;根據數據特征,應用SPSS23.0軟件分析各基因型間的生長性狀效應。在對基因型效應進行分析時采用了固定模型:

Yijk=μ+Ai+CNVj+eijk

其中:Yijk為性狀觀察值,μ為總體均值,Ai為第i頭個體的年齡,CNVj為第j個拷貝數變異類型的固定效應,eijk為隨機誤差。各組數據間的差異性采用LSD多重比較進行檢驗,試驗結果以Mean±SE形式表示。

表2.茶卡羊SHE基因CNV拷貝數變異與生長性狀的關聯性分析

注:平均值肩標上具有相同字母表示差異不顯著(P>0.05),平均值肩標上字母不同表示差異顯著(P<0.05);括號里面的數值表示拷貝數類型的頻率。

關聯分析結果表明(見表2):具有正常型拷貝數變異類型的茶卡羊個體在體長性狀上優于缺失型和插入型拷貝數變異類型的茶卡羊個體。說明SHE基因上的CNV位點(NC_019458.2的103174001bp至103176000bp)可以作為一個提高茶卡羊體長性狀的候選分子遺傳標記。

6、CNV標記在綿羊選育中的應用

以上的CNV(NC_019458.2的103174001bp至103176000bp)位點可作為候選分子遺傳標記,尋找與其相關或緊密連鎖的影響綿羊體長性狀的數量性狀基因座,以對茶卡羊進行分子標記輔助選擇,從而加快茶卡羊品種改良的選育進程。

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