一種腸出血性大腸埃希菌O157:H7檢測試劑盒及其應用的制作方法

文檔序號:18145669發布日期:2019-07-10 11:47
一種腸出血性大腸埃希菌O157:H7檢測試劑盒及其應用的制作方法

本發明屬于生物技術領域,具體涉及一種腸出血性大腸埃希菌O157:H7檢測試劑盒,該試劑盒利用大腸埃希菌O157:H7和大腸埃希菌O55:H7菌株獨有的lpf2C基因型,以及兩種細菌中lpf2D基序的差異作為分子標記,利用該序列設計兩對特異性的引物,通過常規PCR擴增特征性基因片段進行檢測。



背景技術:

埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli) 是革蘭氏染色陰性,呈桿狀的兼性厭氧菌,通常存在于溫血動物的胃腸道。其中,血清型O157:H7大腸桿菌是腸出血型大腸桿菌(enterohemorrhagic E. coli, EHEC)中最重要的一類,在世界范圍內引起人類和動物的爆發感染。該菌感染劑量低,侵入人體后,可以引起出血性或非出血性腹瀉、出血性結腸炎和溶血性尿毒綜合癥等,具有非常重要的公共衛生意義。為了及時、準確地監控可能發生的爆發感染,建立敏感、特異和可靠的技術用于快速而選擇性的檢測大腸桿菌O157:H7 是極其必要的。

實驗室對大腸桿菌O157:H7的傳統鑒定方法基于選擇性培養基,該方法要求分離純化菌株,然后再選擇性培養基上劃線培養,全部流程耗時長,人力成本高,同時根據顯色反應造成的誤判結果也多,不利于對該類細菌的監控快速、準確的要求。近年來,由于分子生物學技術的發展,運用PCR 技術檢測大腸桿菌O157:H7的方法也有很多被建立,選擇志賀毒素stx1 和stx2、LEE毒力島eae、菌毛fimA、鞭毛fliC等基因中的一個或者多個作為分子標記。然而雖然鑒定該類基因可以在一定程度上幫助對O157:H7菌株的預警,但由于大多基因并不是O157:H7菌株所獨有,因此其結果也并非100%的可靠。

長極性菌毛(LPF)是大腸桿菌中廣泛存在的一類菌毛,根據其在細菌基因組的位置可以分為LPF1型和LPF2型,而對LPF操縱子的基序分析后,可以再將LPF1分為5個基因型,LPF2分為3個基因型。本研究團隊根據GenBank上已有的O157:H7全基因組數據分析顯示,全部O157:H7菌株包含獨有的LPF1-3和LPF2-2基因型菌毛的操縱子,說明該操縱子內基因可以作為候選分子標記。但是該兩種基因型的菌毛操縱子同時還存在于O157:H7菌株的祖源菌株O55:H7菌株中,并不能直接用于O157:H7菌株的判定。



技術實現要素:

本發明所要解決的技術問題是:提供一種快速、簡便、特異性強、適合臨床使用的特異性PCR檢測試劑盒,用于快速鑒別大腸桿菌O157:H7菌株。

為解決上述技術問題,本發明的技術方案為:提供一種腸出血性大腸埃希菌O157:H7檢測試劑盒,所述試劑盒包括兩組引物,第一組引物用于檢測O157:H7與O55:H7菌株獨有的lpf2C基因,上、下游引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;第二組引物用于排除O55:H7菌株,上、下游引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

優選的,所述試劑盒還包括PCR 預混液和DNA 聚合酶,其中預混液包括:10×PCR 緩沖液、dNTPs、MgCl2。

上述試劑盒的使用方法, 其具體步驟為:

(1)提取待測樣本核酸,使用第一組引物進行PCR擴增反應;

(2)對步驟(1)擴增陽性的樣本核酸,使用第二組引物進行PCR擴增反應;

(3)第一輪PCR反應陽性且第二輪PCR反應陰性的樣本為腸出血性大腸埃希菌O157:H7。

本發明公開了大腸桿菌LPF2操縱子的lpf2Clpf2D基因作為監測、鑒別O157:H7大腸桿菌的分子標記的應用。

與現有技術相比,本發明所述技術方案的優點在于:

1.標記基因為O157:H7和O55:H7所獨有的,對于第一步陽性的樣品通過第二步PCR,可以區分菌株是O157:H7或是O55:H7菌株,特異性好。

2. 用于檢測、監測臨床樣品中O157:H7大腸桿菌,已通過多株O157:H7和O55:H7 菌株PCR檢測驗證,該PCR檢測方法得出的結果準確無誤,且沒有假陽性和相互交叉反應的發生。

2.該檢測方法所需的試劑及設備成本較低,設計合成的檢測引物-20℃可以長期保存,能多次使用。

附圖說明

圖1為F1和R1引物特異性快速檢測PCR產物電泳圖。其中:

M為DL2000分子標記,泳道1為大腸桿菌O157:H7標準株EDL933,泳道2為O157:H7標準株NCTC 12900,泳道3為O157:H7野生株JS157-1,泳道4為O157:H7野生株JS157-2,泳道5為O157:H7野生株JS157-3,泳道6為O157:H7野生株JS157-4,泳道7為大腸桿菌O55:H7標準株G58,泳道8為O55:H7野生株JS55-1,泳道9為O55:H7野生株JS55-2,泳道10為O55:H7野生株JS55-3,泳道11為大腸桿菌O55:H6標準株CMCC(B)44336,泳道12為大腸桿菌O26標準株CMCC(B) 44389,泳道13為大腸桿菌O45標準株CMCC(B) 44407,泳道14為大腸桿菌O113標準株CMCC(B) 44474,泳道15為大腸桿菌O121標準株CMCC(B) 44717,泳道16為大腸桿菌O145標準株CMCC(B) 44740,泳道17為黏附侵襲大腸桿菌標準株LF82,泳道18為K99大腸桿菌標準株C83907,泳道19為空腸彎曲菌標準株ATCC 33291,泳道20為肺炎克雷伯標準株CMCC(B) 46117,泳道21為福氏志賀氏菌標準株CMCC(B) 51572,泳道22為鼠傷寒沙門菌標準株ATCC 14028,泳道23為腸炎沙門菌CMCC(B) 50336,泳道24為魏氏梭菌標準株C59。

圖2為F2和R2引物特異性快速檢測PCR產物電泳圖。其中:

M為MARK I DNA Ladder分子標記,泳道1為大腸桿菌O157:H7標準株EDL933,泳道2為O157:H7標準株NCTC 12900,泳道3為O157:H7野生株JS157-1,泳道4為O157:H7野生株JS157-2,泳道5為O157:H7野生株JS157-3,泳道6為O157:H7野生株JS157-4,泳道7為大腸桿菌O55:H7標準株G58,泳道8為O55:H7野生株JS55-1,泳道9為O55:H7野生株JS55-2,泳道10為O55:H7野生株JS55-3。

具體實施方式

本發明的實驗基礎是:由于LPF2-2操縱子是O157:H7菌株和O55:H7菌株所獨有的保守基因序列,根據其中lpf2C基因保守區域設計第一組引物。當待檢菌株模板可以特異性擴增預期659 bp大小的條帶時,說明該待檢菌株為O157:H7菌株或O55:H7菌株;當模板不能擴增相應條帶,則該待檢菌株非O157:H7菌株。

此外,本實驗室前期研究通過比對大量LPF基序后還發現,O157:H7菌株的LPF2-2操縱子中lpf2D基因在第74位較O55:H7菌株缺失序列TTTGTTTTAATAGTGATGGCG。該序列則可以用于對O157:H7菌株和O55:H7菌株的進一步區分。因此設計第二組引物,其中上游引物的3’端包含TTTGTTTTAATAGTGATGGCG中的部分序列,下游引物在lpf2D保守區。使用第一組引物檢測結果為陽性的樣品模板,對第二組引物進行PCR擴增,可以特異性擴增預期376 bp大小的條帶時,說明該待檢菌株為大腸桿菌O55:H7菌株;當模板不能擴增相應條帶,則該待檢菌株是大腸桿菌O157:H7菌株。

實施例1引物設計

根據GenBank 上發表的大腸桿菌O157:H7 Sakai株(登錄號:NC_002695.2)和O55:H7 CB9615株(登錄號:CP001846.1)特有的LPF2-2型操縱子基序設計上下游引物F1和R1,其核苷酸序列為 SEQ ID NO:1 和SEQ ID NO:2。由該引物擴增大腸桿菌O157:H7獲得保守基因片段為659 bp,其核苷酸序列為SEQ ID NO:5。

再根據O157:H7Sakai株的LPF2-2操縱子中的lpf2D基因在第74位較O55:H7 CB9615株缺失序列TTTGTTTTAATAGTGATGGCG的特征設計第二輪引物F2和R2,其核苷酸序列分別為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。由該引物擴增O55:H7 CB9615株可得保守基因片段為376bp,其核苷酸序列為SEQ ID NO:6。

實施例2本發明所述腸出血性大腸埃希菌O157:H7檢測試劑盒特異性試驗

采用本發明所述試劑盒分別對大腸桿菌O157:H7標準株EDL933和NCTC 12900,O157:H7野生株JS157-1、 JS157-2、JS157-3和JS157-4,O55:H7標準株G58,O55:H7野生株JS55-1、JS55-2和JS55-3; O55:H6標準株CMCC(B) 44336, O26標準株CMCC(B) 44389, O45標準株 CMCC(B) 44407, O113標準株CMCC(B) 44474,O121標準株CMCC(B) 44717, O145標準株CMCC(B) 44740,黏附侵襲大腸桿菌標準株LF82,K99標準株C83907,以及其他種屬腸道細菌即空腸彎曲菌標準株ATCC 33291,肺炎克雷伯標準株CMCC(B) 46117,福氏志賀氏菌標準株CMCC(B) 51572,鼠傷寒沙門菌標準株ATCC 14028,腸炎沙門菌CMCC(B) 50336,魏氏梭菌標準株C59進行檢測。提取上述菌株核酸分別進行下述兩輪PCR驗證實驗。第一輪PCR反應:參照TaKaRa TaqTM說明書配置PCR反應體系(20 μL),以上述菌株核酸為模板,采用引物F1和R1進行擴增,PCR反應條件為:95℃預變性5min,94℃ 15s,50℃退火15s,72℃延伸30s,25個循環;72℃再延伸5min;擴增產物通過瓊脂糖電泳進行檢測驗證。結果如圖1所示:大腸桿菌O157:H7標準株EDL933和NCTC 12900,O157:H7野生株JS157-1、JS157-2、JS157-3和JS157-4,O55:H7標準株G58,O55:H7野生株JS55-1、JS55-2和JS55-3均可以擴增出約659bp大小條帶。而其他菌株均不能擴增出任何條帶。

第二輪PCR反應:參照TaKaRa TaqTM說明書配置PCR反應體系(20 μL),以第一輪PCR反應陽性結果的菌株核酸為模板,采用引物F2和R2進行擴增,PCR反應條件為:95℃預變性5min,94℃15s,51℃退火15s,72℃30s,25個循環,72℃再延伸5min,擴增PCR 產物;擴增產物再次通過瓊脂糖電泳進行檢測驗證。結果如圖2所示:只有O55:H7菌株G58、JS55-1、JS55-2和JS55-3可以擴增出約376bp大小條帶。而大腸桿菌O157:H7菌株EDL933、NCTC 12900、JS157-1、JS157-2、JS157-3和JS157-4擴增后無條帶。

綜上所述本發明所述試劑盒特異性好,且沒有假陽性和相互交叉反應的發生。

以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解,本發明不受上述實施例的限制,上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理,在不脫離本發明精神和范圍的前提下,本發明還會有各種變化和改進,這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。

序列表

<110> 江蘇省農業科學院

<120> 一種腸出血性大腸埃希菌O157:H7檢測試劑盒及其應用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgggttatc gctactctay 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aaggtcactc mgtcacta 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctaatggtg atggcgtttg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgaggtgga ttggttgga 19

<210> 5

<211> 659

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgggttatc gctactctay ggaggggttc tacaccctca atgaatgggt gtcgcgacag 60

gataatgatt ctgatttctg ggtaacgggc aaccgtcgca gccgcttcga aggcacctgg 120

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tggcagaccg atgaggtcga acgtttatta cagttcggct ataacaacaa ctggcgaaac 240

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catgaaagca cgatgcaggt cggtctgaac ggaacgatgc tggaagggcg taacctgtct 480

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caacattttg attatggcgc cagaggcggc gtgctggtgc atagtgackg agtgacctt 659

<210> 6

<211> 376

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctaatggtg atggcgtttg ttttaatagt gatggcgcaa cgcacatgtc aaatttatca 60

tttggtccgc tgacggtggc agcggcgaat aaccactccg gatacaatat tttcgaggca 120

ctgagcaaca cgactggaac atacccggtg cgctgtcact gtgatgacac gcatggcgga 180

ccgggccaac aaacagcatt ttttcctatc ttctacacgg gagatgccgc accggggctt 240

gtgcttgagc gcactcttaa tgggttaaat tactatgctc tgaatgatta tttatcggtc 300

ggcgtgacga tttttattat taataaccaa tatgcggcca ttccttttga acacttatcc 360

aaccaatcca cctcac 376

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