表觀修飾土曲霉次級代謝物及其在制備抗腫瘤藥物中的用途的制作方法

文檔序號:18232241發布日期:2019-07-20 01:32
本發明屬于微生物藥物
技術領域
,具體涉及表觀修飾土曲霉次級代謝物及其在制備抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術
:對陸生微生物近百年的研究歷史,發現了大量的化學結構多樣性和生物活性顯著的天然產物,極大的推動了生物素藥物的發展,如:青霉素、萬古霉素、鏈霉素等。對微生物越來越多的關注,自然導致微生物的重復研究和已知化合物重復開發、新化合物發現的機率降低。因此人們開始關注微生物蘊藏量更大、種類多樣性更多的海洋來源微生物。海洋微生物由于其獨特的生存環境(高壓、高鹽、低溫、寡營養)導致其具有與陸生微生物截然不同的代謝途徑,因而更易產生不同于陸生微生物的次生代謝產物,進而表現出良好的生物活性如:抑制群體感應活性、抑菌活性、抗病毒活性、蛋白激酶抑制活性、細胞毒活性、腫瘤細胞周期抑制活性等,因而日漸成為海洋藥物研究工作者青睞的重要天然產物化學資源。海水中微生物的豐度達到106/mL,海底沉積物微生物豐度更是達到了109/mL。然而海洋樣品采集難度高,常規實驗室條件下僅有低于5%的海洋微生物被分離得到,即便獲得的微生物在實驗室培養條件下也不能完全表達其在海洋環境下的所有生物合成途徑的代謝產物。因此如何最大程度的開發這些來之不易的海洋微生物資源,使其能最大限度的被人類利用,成為科學工作者的一個重要任務和課題。曲霉屬真菌一直以來都是天然產物界研究的重要菌種,其次級代謝產物結構新穎骨架多變,除了常規的甾體、倍半萜、蒽醌等常見結構類型以外,往往還含有:生物堿類、肽類、聚酮類、二倍半萜等多種的骨架。這些結構新穎的化合物往往還含有細胞毒,抗菌,抗病毒等多種活性,成為海洋藥物先導化合物的重要來源之一,引起了業內學者的廣泛關注。表觀遺傳修飾學是研究DNA序列沒有發生變化的可遺傳的基因表達的改變。主要內容是通過組蛋白修飾、非編碼RNA調控、DNA的甲基化和染色質重塑等方式達到調控基因表達的目的。在微生物中很多調控轉錄和翻譯過程,與初級代謝產物和細胞成熟相關的機制已經被系統深入的研究。相反的,關于分子水平調節次生代謝產物生物合成機制的研究卻知之甚少。已經有證據證明:表觀遺傳修飾過程被細胞廣泛的應用于控制遺傳信息的傳遞過程,包括調控次生代謝產物產生的基因。表觀遺傳修飾調控抑制的現象在那些僅僅一小部分生物合成機制被發現的真菌中表現的尤其明顯。技術實現要素:本發明的目的在于提供一種表觀修飾土曲霉次級代謝物及其在制備抗腫瘤藥物中的用途,該表觀修飾土曲霉次級代謝物的產量高,獲得的次級代謝物具有抗腫瘤活性,可以降低耐藥細胞對藥物的耐受性,并恢復對藥物的敏感性,制備的抗腫瘤藥物的治療效果好。本發明為實現上述目的所采取的技術方案為:表觀修飾土曲霉次級代謝物,包括式I所示化合物I、式II所示化合物II和式III所示化合物III,上述化合物I對細胞K562的IC50值為9.5μM;化合物II對細胞K562的IC50值為13.0μM,對細胞MCF-7的IC50值為10.1μM;化合物III對細胞MCF-7的IC50值為8.5μM。上述次級代謝物按照以下方法提取而得:1)將土曲霉種子液接種到經脈沖電場和紫外線進行滅菌處理的發酵液中進行發酵,得到經表觀修飾的海洋真菌;2)將發酵結束后的發酵液通過粗棉布過濾以分離濾液和菌絲,分別用乙酸乙酯萃取,將所得乙酸乙酯萃取液合并,濃縮,得到乙酸乙酯溶液提取物;3)將所述乙酸乙酯提取物利用減壓硅膠柱色譜、SephadexLH-20、HPLC進一步純化,得到次級代謝物。土曲霉的發酵需要一個無雜菌生長的環境,因此,接種前培養基的滅菌對發酵效率及產品的技術經濟指標至關重要。脈沖電場能夠將部分水分子分解成OH-和H+,其中水中氧分子俘獲由電場催化OH-時產生的電子后就會生成超氧陰離子自由基、過氧化氫和自由質子等,它與OH-結合后會導致細胞DNA發生氧化損傷。在微生物細胞體內,適量的超氧陰離子自由基發揮著代謝貯能轉化排廢及防御消毒的作用,但隨著電場強度和脈沖作用時間的不斷累積,過量的超氧陰離子自由基會在細胞體內積累,從而破壞脂質、損害核酸、破壞碳水化合物及蛋白質,最終對微生物細胞產生氧化損傷并危及其正常的生命活動,甚至引起死亡。而紫外線在脈沖電場的增益作用下,減弱了發酵液中很容易被介質吸收的缺陷,能夠強化脈沖電場的殺菌效果,避免發酵液中亞致死損傷細菌的產生,徹底殺菌,提高殺菌效果。同時脈沖電場和紫外線的共同作用,能夠軟化酵母抽提物中殘留的酵母細胞壁碎片,破壞細胞壁組分葡聚糖的β-1,3鍵而使其分解為單糖或者多糖,更易于被土曲霉吸收消化,且該滅菌是在低溫條件下進行的,能夠保護發酵液的蛋白質不被破壞,為土曲霉的發酵提供充足的營養物質,提高土曲霉的生長速率,延長其對數期,確保土曲霉的表觀遺傳修飾順利進行,提高其次級代謝產物的產量。其中,脈沖電場的場強為15-20kV/cm,脈沖頻率為1.5-2.0kHz,脈沖寬度為1.3-1.5μs,流速為20-40mL/min;紫外線的波長為150-200nm。該條件下的脈沖電場和紫外線的增益共同作用最強,殺菌效果較好,土曲霉的次級代謝產物的產量較高。本發明還公開表觀修飾土曲霉次級代謝物在制備抗腫瘤藥物中的用途。上述抗腫瘤藥物包括化合物I和/或化合物II和/或化合物III?;衔颕、II對細胞K562有抑制作用,IC50值分別為9.5和13.0μM?;衔颕I、III對細胞MCF-7有抑制作用,IC50值分別為10.1和8.5μM。表明:化合物I、II對人慢性髓性白血病K562細胞表現出一定的抑制活性,化合物II、III對人乳腺癌細胞MCF-7表現出一定的抑制活性,具有抗腫瘤活性,可以降低耐藥細胞對藥物的耐受性,并恢復對藥物的敏感性,最終改善治療的結果;同時上述化合物來自于微生物的次級代謝產物,易于被機體吸收,毒性非常小,副作用和不良反應率低。上述抗腫瘤藥物還包括藥學上可接受的輔料。上述治療糖尿病藥物為片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、湯劑、膏劑、露劑、口服液劑、滴丸劑或糖漿劑。與現有技術相比,本發明的有益效果為:本發明表觀修飾土曲霉次級代謝物具有抗腫瘤活性,可以降低耐藥細胞對藥物的耐受性,并恢復對藥物的敏感性,最終改善治療的結果;同時上述表觀修飾土曲霉次級代謝物來自于微生物的次級代謝產物,易于被機體吸收,毒性非常小,副作用和不良反應率低;本發明表觀修飾土曲霉次級代謝物的制備方法簡單,能夠完全滅殺發酵液中的細菌,軟化酵母抽提物中殘留的酵母細胞壁碎片,保護發酵液的蛋白質不被破壞,為土曲霉的發酵提供充足的營養物質,提高土曲霉的生長速率,延長其對數期,確保土曲霉的表觀遺傳修飾順利進行,提高其次級代謝產物的產量。本發明采用了上述技術方案提供表觀修飾土曲霉次級代謝物及其在制備抗腫瘤藥物中的用途,彌補了現有技術的不足,設計合理,操作方便。具體實施方式下面,結合具體實施例對本發明實施方式作進一步說明。本申請公開一種表觀修飾土曲霉次級代謝物,包括式I所示化合物I、式II所示化合物II和式III所示化合物III,上述化合物I對細胞K562的IC50值為9.5μM;化合物II對細胞K562的IC50值為13.0μM,對細胞MCF-7的IC50值為10.1μM;化合物III對細胞MCF-7的IC50值為8.5μM。上述次級代謝物按照以下方法提取而得:1)真菌材料:從來自青島石老人海水浴場滸苔樣品中分離出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739,滸苔樣品依次用無菌海水、75%乙醇和無菌水洗滌。然后,用研缽搗碎樣品,然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培養基(每升含馬鈴薯提取物200克,葡萄糖20克,瓊脂15克,和海水1L)中,在28℃下培養至出現單一菌種,將該菌種轉移到另一PDA培養基并儲存于4℃,通過多相分類學研究、菌落形態及18SrRNA序列分析、菌株發育樹的建立,鑒定其為土曲霉OUCMDZ-2739;2)擴大培養:將土曲霉AspergillusterreusOUCMDZ-2739接種在培養基中擴大培養,得真菌種子液;3)表觀遺傳修飾調控:將上述真菌種子液按接種量為3-5%接種到經脈沖電場和紫外線進行滅菌處理的發酵液中,在溫度為22-28℃的條件下進行發酵,時間為25-35天,得到經表觀修飾的海洋真菌。土曲霉的發酵需要一個無雜菌生長的環境,因此,接種前培養基的滅菌對發酵效率及產品的技術經濟指標至關重要。脈沖電場能夠將部分水分子分解成OH-和H+,其中水中氧分子俘獲由電場催化OH-時產生的電子后就會生成超氧陰離子自由基、過氧化氫和自由質子等,它與OH-結合后會導致細胞DNA發生氧化損傷。在微生物細胞體內,適量的超氧陰離子自由基發揮著代謝貯能轉化排廢及防御消毒的作用,但隨著電場強度和脈沖作用時間的不斷累積,過量的超氧陰離子自由基會在細胞體內積累,從而破壞脂質、損害核酸、破壞碳水化合物及蛋白質,最終對微生物細胞產生氧化損傷并危及其正常的生命活動,甚至引起死亡。而紫外線在脈沖電場的增益作用下,減弱了發酵液中很容易被介質吸收的缺陷,能夠強化脈沖電場的殺菌效果,避免發酵液中亞致死損傷細菌的產生,徹底殺菌,提高殺菌效果。同時脈沖電場和紫外線的共同作用,能夠軟化酵母抽提物中殘留的酵母細胞壁碎片,破壞細胞壁組分葡聚糖的β-1,3鍵而使其分解為單糖或者多糖,更易于被土曲霉吸收消化,且該滅菌是在低溫條件下進行的,能夠保護發酵液的蛋白質不被破壞,為土曲霉的發酵提供充足的營養物質,提高土曲霉的生長速率,延長其對數期,確保土曲霉的表觀遺傳修飾順利進行,提高其次級代謝產物的產量;4)提?。簩?0L發酵液通過粗棉布過濾以分離濾液和菌絲,濾液用等效體積的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液。菌絲用80%丙酮萃取三次,丙酮溶液經減壓濃縮,然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液,兩個乙酸乙酯溶液組合在一起。并在減壓下濃縮,得到31.2g乙酸乙酯溶液提取物;5)分離純化:將乙酸乙酯提取物利用減壓硅膠柱色譜進行逐步洗脫,洗脫液為石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100%~0%)的屈服梯度6個主要餾分(餾分1~6),4.8g的餾分2通過SephadexLH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)進一步純化,得到200mg餾分2.3,餾分2.3繼續用HPLC純化,洗脫液為75%MeOH-H2O,獲得12.5mg化合物I(tR=9.4min);6.7g的餾分3通過SephadexLH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)進一步純化,得到1.4g餾分3.3和1.1g餾分3.4,其中餾分3.3繼續用HPLC純化,洗脫液為70%MeOH-H2O,獲得40.3mg化合物II(tR=11.5min)和13.6mg化合物III(tR=16.4min)。其中,脈沖電場的場強為15-20kV/cm,脈沖頻率為1.5-2.0kHz,脈沖寬度為1.3-1.5μs,流速為20-40mL/min;紫外線的波長為150-200nm。該條件下的脈沖電場和紫外線的增益共同作用最強,殺菌效果較好,土曲霉的次級代謝產物的產量較高。其中,發酵液包括如下成分:8-15g/L葡萄糖、17-22g/L麥芽糖、18-23g/L甘露醇、9-12g/L谷氨酸單鈉、0.4-0.6g/LKH2PO4、0.2-0.5g/LMgSO4·7H2O、2-4g/L酵母抽提物、30-35g/LSEA鹽、9-11μMTSA和1L自來水。該發酵液中添加表觀遺傳修飾調控劑組蛋白去乙?;敢种苿㏕SA能有效激活AspergillusterreusOUCMDZ-2739菌株體內不同生合成途徑基因水平的表達,進而代謝產生不同于不添加抑制劑條件下的化合物類型,是激活真菌沉默基因表達的有效手段,得到新的化合物,為微生物醫藥領域提供新的途徑。本申請還公開一種表觀修飾土曲霉次級代謝物在制備抗腫瘤藥物中的用途。上述抗腫瘤藥物包括化合物I和/或化合物II和/或化合物III?;衔颕、II對細胞K562有抑制作用,IC50值分別為9.5和13.0μM?;衔颕I、III對細胞MCF-7有抑制作用,IC50值分別為10.1和8.5μM。表明:化合物I、II對人慢性髓性白血病K562細胞表現出一定的抑制活性,化合物II、III對人乳腺癌細胞MCF-7表現出一定的抑制活性,具有抗腫瘤活性,可以降低耐藥細胞對藥物的耐受性,并恢復對藥物的敏感性,最終改善治療的結果;同時上述化合物來自于微生物的次級代謝產物,易于被機體吸收,毒性非常小,副作用和不良反應率低。其中,腫瘤藥物進一步包括化合物I、化合物II和化合物III,其中化合物I、化合物II和化合物III的重量比為1:2.4-2.8:0.7-0.9。白血病癌細胞和女性乳腺癌細胞分屬于非實體瘤細胞和實體瘤細胞,致病機制很復雜,目前也只有通過化療來減少病痛,由于患者長期接觸化療藥物,不可避免會對某一種化療藥物產生耐受性,要加大藥物劑量才能恢復細胞對藥物敏感性,化療藥物加大劑量勢必會對人機體產生損害,而且一旦對一種藥物產生耐受性,同時可能會對其他化療藥物產生交叉耐受,這就形成了腫瘤細胞的多藥耐,是阻礙化療方法成功的絆腳石。而藥物的這種組合不僅對免疫應答激活具有協同效應,對人慢性髓性白血病K562細胞和人乳腺癌細胞MCF-7的抑制效果達到最佳,抗腫瘤活性較高,且還可以提高腫瘤患者自身免疫力;而且能降低ATP結合盒蛋白在細胞上的表達,可以降低耐藥細胞對藥物的耐受性,并恢復對藥物的敏感性,最終改善治療的結果。上述抗腫瘤藥物還包括藥學上可接受的輔料。該輔料中包含納米顆粒,納米顆粒通常包含糖,葡聚糖,磷酸鈣,殼聚糖,肽和/或塑料聚合物。上述納米顆粒具有100nm以下的尺寸,能夠包裹化合物I、化合物II和化合物III,以受控的和可調諧的動力學釋放藥物,導致治療反應,然后該納米可以可降解為無毒組分,以使得能夠從機體清除而沒有不利的毒性。尤其是ELP納米顆粒,先天免疫系統僅在腫瘤內激活,并且防止了先天性免疫系統的系統性激活。該輔料中還包含鳥嘌呤、連翹苷和P-糖蛋白抑制劑(如維拉帕米、環孢菌素A、VX-710和PSC833),輔料中的鳥嘌呤和連翹苷能夠克服P-糖蛋白抑制劑存在的親和力特異性不足的缺點,然后鳥嘌呤、連翹苷和P-糖蛋白抑制劑共同通過競爭性結合P-糖蛋白底物位點,對抗腫瘤藥物中的化合物I、化合物II和化合物III起作用并恢復對藥物的敏感性,最終改善治療的結果,同時可以引起藥物相互作用,有效抑制腫瘤細胞的增殖。上述治療糖尿病藥物為片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、湯劑、膏劑、露劑、口服液劑、滴丸劑或糖漿劑。下面,結合具體實施例對本發明實施方式作進一步說明。實施例1:次級代謝物按照以下方法提取而得:1)真菌材料:從來自青島石老人海水浴場滸苔樣品中分離出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739,滸苔樣品依次用無菌海水、75%乙醇和無菌水洗滌。然后,用研缽搗碎樣品,然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培養基(每升含馬鈴薯提取物200克,葡萄糖20克,瓊脂15克,和海水1L)中,在28℃下培養至出現單一菌種,將該菌種轉移到另一PDA培養基并儲存于4℃,通過多相分類學研究、菌落形態及18SrRNA序列分析、菌株發育樹的建立,鑒定其為土曲霉OUCMDZ-2739;2)擴大培養:將土曲霉AspergillusterreusOUCMDZ-2739接種在培養基中擴大培養,得真菌種子液;3)表觀遺傳修飾調控:將上述真菌種子液按接種量為3%接種到經脈沖電場和紫外線進行滅菌處理的發酵液中,在溫度為22℃的條件下進行發酵,時間為25天,得到經表觀修飾的海洋真菌;4)提?。簩?0L發酵液通過粗棉布過濾以分離濾液和菌絲,濾液用等效體積的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液,菌絲用80%丙酮萃取三次,丙酮溶液經減壓濃縮,然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液,兩個乙酸乙酯溶液組合在一起。并在減壓下濃縮,得到38.3g乙酸乙酯溶液提取物;5)分離純化:將乙酸乙酯提取物利用減壓硅膠柱色譜進行逐步洗脫,洗脫液為石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100%~0%)的屈服梯度6個主要餾分(餾分1~6),5.9g的餾分2通過SephadexLH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)進一步純化,得到245.5mg餾分2.3,餾分2.3繼續用HPLC純化,洗脫液為75%MeOH-H2O,獲得15.3mg化合物I(tR=9.4min);8.2g的餾分3通過SephadexLH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)進一步純化,得到1.7g餾分3.3和1.4g餾分3.4,其中餾分3.3繼續用HPLC純化,洗脫液為70%MeOH-H2O,獲得49.5mg化合物II(tR=11.5min)和16.7mg化合物III(tR=16.4min)。其中,脈沖電場的場強為15kV/cm,脈沖頻率為1.5kHz,脈沖寬度為1.3μs,流速為20mL/min;紫外線的波長為150nm。發酵液按照如下成分配制:8g/L葡萄糖、17g/L麥芽糖、18g/L甘露醇、9g/L谷氨酸單鈉、0.4g/LKH2PO4、0.2g/LMgSO4·7H2O、2g/L酵母抽提物、30g/LSEA鹽、9μMTSA和1L自來水。實施例2:次級代謝物按照以下方法提取而得:1)真菌材料:從來自青島石老人海水浴場滸苔樣品中分離出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739,滸苔樣品依次用無菌海水、75%乙醇和無菌水洗滌。然后,用研缽搗碎樣品,然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培養基(每升含馬鈴薯提取物200克,葡萄糖20克,瓊脂15克,和海水1L)中,在28℃下培養至出現單一菌種,將該菌種轉移到另一PDA培養基并儲存于4℃,通過多相分類學研究、菌落形態及18SrRNA序列分析、菌株發育樹的建立,鑒定其為土曲霉OUCMDZ-2739;2)擴大培養:將土曲霉AspergillusterreusOUCMDZ-2739接種在培養基中擴大培養,得真菌種子液;3)表觀遺傳修飾調控:將上述真菌種子液按接種量為4%接種到經脈沖電場和紫外線進行滅菌處理的發酵液中,在溫度為25℃的條件下進行發酵,時間為30天,得到經表觀修飾的海洋真菌;4)提?。簩?0L發酵液通過粗棉布過濾以分離濾液和菌絲,濾液用等效體積的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液,菌絲用80%丙酮萃取三次,丙酮溶液經減壓濃縮,然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液,兩個乙酸乙酯溶液組合在一起。并在減壓下濃縮,得到41.9g乙酸乙酯溶液提取物;5)分離純化:將乙酸乙酯提取物利用減壓硅膠柱色譜進行逐步洗脫,洗脫液為石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100%~0%)的屈服梯度6個主要餾分(餾分1~6),6.4g的餾分2通過SephadexLH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)進一步純化,得到268mg餾分2.3,餾分2.3繼續用HPLC純化,洗脫液為75%MeOH-H2O,獲得16.7mg化合物I(tR=9.4min);9.0g的餾分3通過SephadexLH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)進一步純化,得到1.9g餾分3.3和1.5g餾分3.4,其中餾分3.3繼續用HPLC純化,洗脫液為70%MeOH-H2O,獲得54.1mg化合物II(tR=11.5min)和18.2mg化合物III(tR=16.4min)。其中,脈沖電場的場強為18kV/cm,脈沖頻率為1.8kHz,脈沖寬度為1.4μs,流速為30mL/min;紫外線的波長為180nm。發酵液按照如下成分配制:10g/L葡萄糖、20g/L麥芽糖、20g/L甘露醇、10g/L谷氨酸單鈉、0.5g/LKH2PO4、0.3g/LMgSO4·7H2O、3g/L酵母抽提物、33g/LSEA鹽、10μMTSA和1L自來水。實施例3:次級代謝物按照以下方法提取而得:1)真菌材料:從來自青島石老人海水浴場滸苔樣品中分離出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739,滸苔樣品依次用無菌海水、75%乙醇和無菌水洗滌。然后,用研缽搗碎樣品,然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培養基(每升含馬鈴薯提取物200克,葡萄糖20克,瓊脂15克,和海水1L)中,在28℃下培養至出現單一菌種,將該菌種轉移到另一PDA培養基并儲存于4℃,通過多相分類學研究、菌落形態及18SrRNA序列分析、菌株發育樹的建立,鑒定其為土曲霉OUCMDZ-2739;2)擴大培養:將土曲霉AspergillusterreusOUCMDZ-2739接種在培養基中擴大培養,得真菌種子液;3)表觀遺傳修飾調控:將上述真菌種子液按接種量為5%接種到經脈沖電場和紫外線進行滅菌處理的發酵液中,在溫度為28℃的條件下進行發酵,時間為35天,得到經表觀修飾的海洋真菌;4)提?。簩?0L發酵液通過粗棉布過濾以分離濾液和菌絲,濾液用等效體積的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液,菌絲用80%丙酮萃取三次,丙酮溶液經減壓濃縮,然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液,兩個乙酸乙酯溶液組合在一起。并在減壓下濃縮,得到39.6g乙酸乙酯溶液提取物;5)分離純化:將乙酸乙酯提取物利用減壓硅膠柱色譜進行逐步洗脫,洗脫液為石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100%~0%)的屈服梯度6個主要餾分(餾分1~6),6.1g的餾分2通過SephadexLH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)進一步純化,得到253.8mg餾分2.3,餾分2.3繼續用HPLC純化,洗脫液為75%MeOH-H2O,獲得15.9mg化合物I(tR=9.4min);8.5g的餾分3通過SephadexLH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)進一步純化,得到1.8g餾分3.3和1.4g餾分3.4,其中餾分3.3繼續用HPLC純化,洗脫液為70%MeOH-H2O,獲得51.2mg化合物II(tR=11.5min)和17.3mg化合物III(tR=16.4min)。其中,脈沖電場的場強為20kV/cm,脈沖頻率為2.0kHz,脈沖寬度為1.5μs,流速為40mL/min;紫外線的波長為200nm。發酵液按照如下成分配制:15g/L葡萄糖、22g/L麥芽糖、23g/L甘露醇、12g/L谷氨酸單鈉、0.6g/LKH2PO4、0.5g/LMgSO4·7H2O、4g/L酵母抽提物、35g/LSEA鹽、11μMTSA和1L自來水。實施例4:表觀修飾土曲霉次級代謝物在制備抗腫瘤藥物中的用途,取化合物I添加散劑的常規輔料,按照常規方法制成散劑。實施例5:表觀修飾土曲霉次級代謝物在制備抗腫瘤藥物中的用途,取化合物II添加片劑的常規輔料,按照常規方法制成片劑。實施例6:表觀修飾土曲霉次級代謝物在制備抗腫瘤藥物中的用途,取化合物III添加顆粒劑的常規輔料,按照常規方法制成顆粒劑。實施例7:表觀修飾土曲霉次級代謝物在制備抗腫瘤藥物中的用途,按照重量比為1:2.4:0.7取化合物I、化合物II和化合物III,添加膠囊劑的常規輔料,按照常規方法制成膠囊劑。實施例8:表觀修飾土曲霉次級代謝物在制備抗腫瘤藥物中的用途,按照重量比為1:2.8:0.9取化合物I、化合物II和化合物III,添加膠囊劑的常規輔料,按照常規方法制成膠囊劑。實施例9:表觀修飾土曲霉次級代謝物在制備抗腫瘤藥物中的用途,片劑的制備:按照重量比為1:2.5:0.76取化合物I、化合物II和化合物III,添加膠囊劑的常規輔料,按照常規方法制成膠囊劑。實施例10:表觀修飾土曲霉次級代謝物在制備抗腫瘤藥物中的用途,片劑的制備:按照重量比為1:2.5:0.76取化合物I、化合物II和化合物III,添加膠囊劑的常規輔料(其中輔料中包含鳥嘌呤、連翹苷和P-糖蛋白抑制劑),按照常規方法制成膠囊劑。實施例11:表觀修飾土曲霉次級代謝物在制備抗腫瘤藥物中的用途,片劑的制備:按照重量比為1:2.5:0.76取化合物I、化合物II和化合物III,添加膠囊劑的常規輔料(其中輔料中包含ELP納米顆粒、鳥嘌呤、連翹苷和P-糖蛋白抑制劑),按照常規方法制成膠囊劑。對比例1:本實施例與實施例2的技術方案的區別在于:本實施例用發酵液高溫殺菌,得到31.2g乙酸乙酯溶液提取物;將乙酸乙酯提取物利用減壓硅膠柱色譜進行逐步洗脫,洗脫液為石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100%~0%)的屈服梯度6個主要餾分(餾分1~6),4.8g的餾分2通過SephadexLH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)進一步純化,得到200mg餾分2.3,餾分2.3繼續用HPLC純化,洗脫液為75%MeOH-H2O,獲得12.5mg化合物I(tR=9.4min);6.7g的餾分3通過SephadexLH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)進一步純化,得到1.4g餾分3.3和1.1g餾分3.4,其中餾分3.3繼續用HPLC純化,洗脫液為70%MeOH-H2O,獲得40.3mg化合物II(tR=11.5min)和13.6mg化合物III(tR=16.4min)。對比實施例2和對比例1可知,實施例2獲得的乙酸乙酯溶液提取物遠多于對比例1,這說明,脈沖電場和紫外線的共同作用,能夠確保滸苔來源真菌的表觀遺傳修飾順利進行,提高其次級代謝產物的產量。試驗例1:化合物I、化合物II和化合物III的細胞毒活性測試:分別以人慢性髓性白血病K562細胞和MCF-7細胞為模型,阿霉素為陽性對照藥,采用MTT比色法對目標次級代謝物的細胞毒活性測試。MTT溶液的配制方法:稱取MTT0.5g,溶于100mL的磷酸緩沖液(PBS)或無酚紅的培養基中,用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌,放4℃冰箱避光保存即可。在配制和保存的過程中,容器要用鋁箔紙包住,實驗的時候關閉超凈臺上的日光燈以避光。方法:取對數生長期的腫瘤細胞,將細胞密度調至每毫升2×105個/mL,按每孔200μL加到96孔細胞培養板中,于37℃通入5%CO2的培養箱中培養4h。樣品分別設定5個濃度梯度,每個濃度設3個平行樣,同時設陽性、陰性對照,每孔加樣品液或空白液各2μL,培養72h,然后每孔加MTT液10μL,繼續培養4h,37℃、2000r/min離心8min,吸去上清。每孔加入二甲基亞砜各100μL,在微量振蕩器上振蕩15min,至結晶完全溶解后,酶標儀測定每孔570nm處的吸光值(OD值)。取三孔的平均吸光值,并按IR%=(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100%公式計算樣品對細胞增殖的抑制率,并采用bliss法計算出半數抑制率IC50。測得化合物I、II對細胞K562有抑制作用,IC50值分別為9.5和13.0μM?;衔颕I、III對細胞MCF-7有抑制作用,IC50值分別為10.1和8.5μM。表明:化合物I、II對人慢性髓性白血病K562細胞表現出一定的抑制活性,化合物II、III對人乳腺癌細胞MCF-7表現出一定的抑制活性,具有抗腫瘤活性。試驗例2:抗腫瘤藥物對細胞增殖的抑制率細胞相對活力:按照試驗例1中的方法進行測試,計算抗腫瘤藥物對K562、K562/ADR、MCF-7、MCF-7/ADR細胞增殖的抑制率,結果如表1所示。表1抗腫瘤藥物對細胞增殖的抑制率項目K562K562/ADRMCF-7MCF-7/ADR實施例49.6299.300實施例513.1352.610.3315.7實施例6008.6266.1實施例77.8278.76.8230.1實施例87.7275.37.0256.7實施例97.2221.46.5220.7實施例106.4196.26.0169.4由表1可知,實施例11對K562、K562/ADR、MCF-7、MCF-7/ADR細胞增殖的抑制率最大。對比實施例4、5、6、7、8和9可知,抗腫瘤藥物中化合物I、化合物II和化合物III的重量比為1:2.4-2.8:0.7-0.9時,對人慢性髓性白血病K562細胞和人乳腺癌細胞MCF-7的抑制效果達到最佳,抗腫瘤活性較高,可以降低耐藥細胞對藥物的耐受性,并恢復對藥物的敏感性,最終改善治療的結果。對比實施例9和10可知,輔料中鳥嘌呤、連翹苷和P-糖蛋白抑制劑的存在可以引起藥物相互作用,有效抑制腫瘤細胞的增殖。上述實施例中的常規技術為本領域技術人員所知曉的現有技術,故在此不再詳細贅述。以上實施方式僅用于說明本發明,而并非對本發明的限制,本領域的普通技術人員,在不脫離本發明的精神和范圍的情況下,還可以做出各種變化和變型。因此,所有等同的技術方案也屬于本發明的范疇,本發明的專利保護范圍應由權利要求限定。當前第1頁1 2 3 
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