宮頸病變疾病的生物診治標志物的制作方法

文檔序號:18145657發布日期:2019-07-10 11:47
宮頸病變疾病的生物診治標志物的制作方法

本發明屬于生物醫藥領域,涉及宮頸病變疾病的生物診治標志物,具體的涉及標志物為BDKRB2。



背景技術:

宮頸癌是女性較常見的惡性腫瘤,發病率位于女性腫瘤的第二位,占女性生殖系統惡性腫瘤發病率的73%~93%。我國每年新增發病數超過13萬,特別值得注意的是,由于環境污染加上生活中的不良衛生習慣,使原本多發于50歲左右女性的宮頸癌,如今也越來越年輕化。流行病學研究發現宮頸癌的發生與人乳頭瘤病毒(HPV)感染關系密切,尤其是高危型HPV感染。但HPV感染并不是獨立致病因素。從HPV感染、宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)到宮頸癌這種金字塔式的分布表明宮頸癌形成過程除了HPV感染以外還存在其他的必要因素,宮頸癌的發生發展應是宿主遺傳因素和HPV共同作用的結果。

近年來隨著腫瘤分子生物學研究的深入,發現基因在癌癥的引發、癌前細胞和癌細胞的生存生長中起著重要的作用。探討基因在宮頸病變疾病發生發展中的意義,明確其在宮頸癌變過程各階段中的作用,可為臨床判定分期、判斷預后提供參考,為治療、預防腫瘤開辟新途徑。



技術實現要素:

為了彌補現有技術的不足,本發明的目的在于提供一種與宮頸疾?。簩m頸上皮內瘤樣病變、宮頸鱗癌發生發展相關的基因標志物,研究該標志物在宮頸上皮內瘤樣病變、宮頸鱗癌中的作用,為疾病提供精準化診斷和治療。

為了實現上述目的,本發明采用如下技術方案:

本發明的第一方面提供了一種試劑,所述試劑能夠檢測BDKRB2基因或其表達產物的水平。

進一步,所述試劑包括針對BDKRB2的探針、引物或抗體。

進一步,針對BDKRB2的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。

本發明的第二方面提供了一種試劑盒,所述試劑盒包括本發明第一方面所述的試劑。

本發明的第三方面提供了一種芯片,所述芯片包括本發明第一方面所述的試劑。

本發明的第四方面提供了一種核酸膜條,所述核酸膜條包括本發明第一方面所述的試劑。

本發明的第五方面提供了一種組合物,所述組合物包括BDKRB2的促進劑,和/或藥學上可接受的載體。所述促進劑包括提高BDKRB2基因或其表達產物穩定性、上調BDKRB2基因或其表達產物的表達水平、增加BDKRB2基因或其表達產物有效作用時間的物質。

進一步,所述促進劑為過表達BDKRB2的載體。

本發明的第六方面提供了一種篩選治療宮頸鱗癌的候選藥物的方法,所述方法包括:

用待篩選物質處理表達或含有BDKRB2基因或其編碼的蛋白的培養體系;和檢測所述體系中BDKRB2基因或其編碼的蛋白的表達或活性;

其中,若所述待篩選物質可以促進BDKRB2基因的水平或表達活性,則表明該待篩選物質是治療宮頸鱗癌的候選藥物。

在本發明中,所述體系包括(但不限于):細胞體系、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。

在本發明中,所述的步驟還包括:對獲得的候選藥物進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗,以從候選藥物中進一步選擇可以治療宮頸鱗癌的藥物。

本發明的第七方面提供了如下任一項所述的應用:

a.本發明第一方面所述的試劑、本發明第二方面所述的試劑盒、本發明第三方面所述的芯片、本發明第四方面所述的核酸膜條在制備早期診斷宮頸上皮內瘤樣病變、宮頸鱗癌的產品中的應用;

b.本發明第五方面所述的組合物在制備治療宮頸鱗癌及其轉移、侵襲的藥物中的應用;

c.BDKRB2在制備治療宮頸鱗癌及其轉移、侵襲的的藥物中的應用。

附圖說明

圖1是利用QPCR檢測BDKRB2基因在宮頸鱗癌患者中的表達情況;

圖2是BDKRB2基因表達水平圖;

圖3是CCK-8法檢測BDKRB2對細胞增殖活性的影響圖;

圖4是利用transwell小室檢測BDKRB2基因對細胞遷移侵襲的影響圖,其中圖A是對細胞遷移的影響圖;圖B是對細胞侵襲的影響圖。

具體的實施方式

本發明通過高通量測序技術以及進行高通量測序分析,檢測宮頸上皮內瘤樣病變、宮頸鱗癌患者組織中的基因表達水平,發現其中表達具有明顯差異的基因,探討其與宮頸上皮內瘤樣病變、宮頸鱗癌的發生之間的關系,從而為宮頸鱗癌的早期檢測及靶向治療尋找更好的途徑和方法。經過篩選本發明首次發現了BDKRB2在宮頸鱗癌患者中表達下調,并通過基因過表達技術進一步驗證了BDKRB2參與宮頸癌細胞的增殖、侵襲過程,提示BDKRB2可作為宮頸上皮內瘤樣病變、宮頸鱗癌的分子靶標應用于疾病的診斷和治療。

BDKRB2基因

本發明中的BDKRB2的基因ID為624,在本發明中,BDKRB2包括野生型、突變型或其片段。本領域技術人員知道,在進行測序分析時,會將原始測序結果比對到人的參考基因組上,因此篩選結果中的BDKRB2可能會包含不同的轉錄本,只要可以比對到參考基因組上的BDKRB2(基因ID:624)即可。一種代表性的BDKRB2的序列如NM_000623.3所示。

本發明的BDKRB2核苷酸全長序列或其片段通??梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。

本發明可以利用本領域內已知的任何方法測定基因表達。本領域技術人員應當理解,測定基因表達的手段不是本發明的重要方面??梢栽谵D錄水平或翻譯水平上檢測生物標志物的表達水平。

本文所用術語“差異表達”表示與第二種樣品中相同的一種或多種本發明生物標志物的表達水平比較,經測定mRNA的量或水平,在一個樣品中本發明的一種或多種生物標志物的RNA和/或所述生物標志物mRNA的一種或多種剪接變體表達水平的差異?!安町惐磉_的”還可以包括與第二種樣品或樣品群中蛋白質表達量或水平比較,對樣品或樣品群中本發明生物標志物編碼的蛋白質的測定。差異表達可以如本文所述和本領域技術人員理解的方法確定。術語“差異表達”或“表達水平的變化”表示與第二種樣品中給定生物標志物的可測定表達水平比較,經測定RNA的量和/或蛋白質的量,樣品中給定生物標志物可測定表達水平的增加或降低。術語“差異表達”或“表達水平的變化”還可以表示與第二個樣品群中生物標志物的可測定表達水平比較,樣品群中給定生物標志物可測定表達水平的增加或降低。本文所用“差異表達”可以用給定生物標志物的表達水平相對于對照中給定生物標志物的平均表達水平的比率進行測定,其中比率不等于1.0。還可以用p值測定差異表達。當使用p值時,當p值小于0.1時生物標志物被鑒定為在第一和第二群體之間差異表達。更優選p值小于0.05。甚至更優選p值小于0.01。還更優選p值小于0.005。最優選p值小于0.001。當基于比率確定差異表達時,如果第一種和第二種樣品中表達水平的比率大于或小于1.0,則RNA或蛋白質是差異表達的。舉例來說,大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率,或小于1的比率,例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本發明的另一個實施方案中,如果第一群體的平均表達水平與第二群體的平均表達水平的比率大于或小于1.0,則核酸轉錄本是差異表達的。舉例來說,大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率,或小于1的比率,例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本發明的另一個實施方案中,如果第一個樣品中表達水平與第二個群體中平均表達水平的比率大于或小于1.0,例如包括比率大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20,或比率小于1,例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05,則核酸轉錄本是差異表達的。

“表達差異增加”或“上調”表示基因相對于對照而言,基因表達(以RNA表達或蛋白質表達測定)顯示增加至少10%或更多,例如20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、90%或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。

“表達差異降低”或“下調”表示基因相對于對照而言,基因表達(以RNA表達或蛋白質表達測定)顯示降低至少10%或更多,例如20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、90%或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如,上調基因包括與從正常個體分離的mRNA或蛋白質的表達相比,從以患有宮頸病變疾病為特征的個體分離的組織中mRNA或蛋白質表達水平增加的基因。例如,下調基因包括與從正常個體分離的組織相比,從以患有宮頸病變疾病為特征的個體分離的組織中mRNA或蛋白質表達水平降低的基因。

本發明的基因和蛋白使用本領域普通技術人員已知的多種技術進行檢測,這些技術包括但不限于:核酸測序、核酸雜交、核酸擴增技術、蛋白免疫技術。

所述核酸擴增技術選自聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、轉錄介導的擴增(TMA)、連接酶鏈式反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。其中,PCR需要在擴增前將RNA逆轉錄成DNA(RT-PCR),TMA和NASBA直接擴增RNA。

本發明中的核酸雜交技術包括但不限于原位雜交(ISH)、微陣列和Southern或Northern印跡。原位雜交(ISH)是一種使用標記的互補DNA或RNA鏈作為探針以定位組織一部分或切片(原位)或者如果組織足夠小則為整個組織(全組織包埋ISH)中的特異性DNA或RNA序列的雜交。

本發明的蛋白免疫技術包括夾心免疫測定,例如夾心ELISA,其中使用識別生物標志物上不同表位的兩種抗體進行該生物標志物的檢測;放射免疫測定(RIA)、直接、間接或對比酶聯免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫測定(EIA)、熒光免疫測定(FIA)、蛋白質印跡法、免疫沉淀法和基于任何顆粒的免疫測定(如使用金顆粒、銀顆?;蛉槟z顆粒、磁性顆?;蛄孔狱c)??衫缭谖⒘康味ò寤驐l的形式中實施免疫法。

檢測BDKRB2蛋白的試劑為BDKRB2蛋白的特異性結合劑。特異性結合劑是例如蛋白質BDKRB2的受體、結合蛋白質BDKRB2的凝集素、針對蛋白質BDKRB2的抗體、針對蛋白質BDKRB2的肽抗體(peptidebody)、雙特異性雙重結合劑或雙特異性抗體形式。

特異性結合劑的例子是肽、肽模擬物、aptamer、spiegelmer、darpin、錨蛋白重復蛋白、Kunitz型域、抗體、單域抗體和單價抗體片段。在本發明的具體實施例中,所述特異性結合劑為BDKRB2特異性抗體。

術語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體,即構成群體的各個抗體相同和/或結合相同表位,除了生產單克隆抗體的過程中可能產生的可能變體外,此類變體一般以極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結合靶物的多肽序列的抗體,其中靶物結合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結合多肽序列在內的過程得到的。例如,選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨特克隆。應當理解,選定的靶物結合序列可進一步改變,例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結合序列人源化、提高其在細胞培養物中的產量、降低其在體內的免疫原性、創建多特異性抗體等,而且包含改變后的靶物結合序列的抗體也是本發明的單克隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同,單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性以外,單克隆抗體制備物的優勢在于它們一般未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”指示抗體從基本上同質的抗體群獲得的特征,不應解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。

“抗體片段”包含全長抗體的一部分,一般是其抗原結合區或可變區??贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段;雙抗體;線性抗體;單鏈抗體分子;及由抗體片段形成的多特異性抗體。

本發明的抗體的“功能性片段”指那些保留與衍生它們的完整全鏈分子以基本上相同的親和力結合多肽且在至少一種測定法中有活性(諸如在小鼠模型中,或在體外抑制抗體片段結合的抗原的生物學活性)的片段。

本發明提供了檢測BDKRB2的表達水平的產品,所述產品包括(但不限于)芯片、試劑盒、核酸膜條。其中芯片包括:固相載體;以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針或抗體,所述的寡核苷酸探針特異性地對應于BDKRB2所示的部分或全部序列,所述抗體特異性的結合BDKRB2蛋白。

所述固相載體包括無機載體和有機載體,所述無機載體包括但不限于有硅載體、玻璃載體、陶瓷載體等;所述有機載體包括聚丙烯薄膜、尼龍膜等。

本發明提供了一種試劑盒,所述試劑盒可用于檢測BDKRB2基因或蛋白的試劑。選自下組的一種或多種物質:容器、使用說明書、陽性對照物、陰性對照物、緩沖劑、助劑或溶劑。

本發明的試劑盒中還可附有試劑盒的使用說明書,其中記載了如何采用試劑盒進行檢測。

在某些實施方案中,本文提供的是用于檢測一種或多種生物標志物的蛋白質水平的試劑盒。在某些實施方案中,所述試劑盒包含用識別蛋白質生物標志物的抗體包被的試紙條、洗滌溶液、進行該試驗的試劑、蛋白質分離或純化工具、檢測工具以及陽性和陰性對照。在某些實施方案中,所述試劑盒還包含使用該試劑盒的說明書。所述試劑盒可以定制供在家使用、臨床使用或研究使用。

本發明提供了一種核酸膜條,核酸膜條包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探針;所述基底可以是任何適于固定寡核苷酸探針的基底,例如尼龍膜、硝酸纖維素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅膠晶片、微縮磁珠等。

促進劑和藥物組合物

本發明提供了一種藥物(組合物),它含有有效量的所述的BDKRB2的促進劑,以及藥學上可接受的載體。所述的組合物可用于治療宮頸鱗癌。

作為本發明的一種優選方式,所述的BDKRB2的促進劑是一種BDKRB2的表達載體。所述的表達載體通常還含有啟動子、復制起點和/或標記基因等。

藥學可接受的載體或稀釋劑的實例是軟化水或蒸餾水;鹽水溶液;植物油類,如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油,麻油類,如花生油(peanutoil)、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、麻油、花生油(arachisoil)或椰子油;硅油類,包括聚硅氧烷類,如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷;揮發性硅酮類;礦物油類,如液體石蠟、軟石蠟或角鯊烷;纖維素衍生物,如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素;低級烷醇類,例如乙醇或異丙醇;低級芳烷醇類(aralkanols);低級聚烷撐二醇類或低級烷撐二醇類,例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油;脂肪酸酯類,如棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯;聚乙烯吡咯烷酮;瓊脂;黃耆樹膠或阿拉伯膠和凡士林。一般載體或多種載體形成組合物的10wt%至99.9wt%。

組合物可以是適合注射給藥的劑型、適合口服攝取的劑型(如膠囊、片劑、囊片、酏劑)、適合局部給藥的油膏、乳膏或洗劑形式、適合用作滴眼劑的遞送劑型、適合通過吸入給藥的氣霧劑形式(如通過鼻內吸入或口吸入)、適合胃腸外給藥的劑型,即皮下、肌肉內或靜脈內注射。

對于可注射溶液或懸液的給藥,無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或載體可包括林格氏溶液、等滲鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇和1,2丙二醇。

用于口服的合適載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑的一些實例包括花生油、液體石蠟、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、海藻酸鈉、阿拉伯膠、黃耆樹膠、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明膠和卵磷脂。另外,這些口服劑型可含有合適的調味劑和著色劑。當以膠囊劑型使用時,膠囊可用能延緩崩解的化合物包被,如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

佐劑典型地包括潤滑劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、殺菌劑和緩沖劑。

口服給藥的固體劑型可包含在人和獸醫藥學實踐中可接受的粘合劑、增甜劑、崩解劑、稀釋劑、調味劑、包衣劑、防腐劑、潤滑劑和/或延時劑(timedelayagent)。合適的粘合劑包括阿拉伯膠、明膠、玉米淀粉、黃耆樹膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素或聚乙二醇。合適的增甜劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴特或糖精。合適的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜爾膠、黃原膠、膨潤土、藻酸或瓊脂。合適的稀釋劑包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高嶺土、纖維素、碳酸鈣、硅酸鈣或磷酸二鈣。合適的調味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃、柑橘或樹莓調味劑。合適的包衣劑包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它們的酯類的聚合物或共聚物、蠟、脂肪醇、玉米蛋白、蟲膠或麩質。合適的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素E、α-生育酚、抗壞血酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石。合適的延時劑包括單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

用于口服給藥的液體劑型除了上述藥物以外,還可包含液體載體。合適的液體載體包括水、油類如橄欖油、花生油(peanutoil)、麻油、向日葵油、紅花油、花生油(arachisoil)、椰子油、液體石蠟、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。

用于口服給藥的懸液可進一步包括分散劑和/或懸浮劑。合適的懸浮劑包括羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙稀吡咯烷酮、海藻酸鈉或乙酰乙醇。合適的分散劑包括卵磷脂、如硬脂酸之類的脂肪酸的聚氧乙烯酯類、聚氧乙烯山梨醇單-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯和類似物。

用于口服給藥的乳劑可進一步包括一種或多種乳化劑。合適的乳化劑包括上面所例舉的分散劑或天然樹膠,如瓜爾膠、阿拉伯膠或黃耆樹膠。

本發明的藥物組合物還可以與其他治療宮頸鱗癌的藥物聯用,其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥,甚至在同一組合物中同時給藥。還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。

優選的,可采用基因治療的手段進行。比如,可直接將BDKRB2的促進劑通過諸如注射等方法給藥于受試者;或者,可通過一定的途徑將攜帶BDKRB2的促進調劑的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上,具體情況需視所述的促進劑的類型而定,這些均是本領域技術人員所熟知的。

下面結合具體的實施例進一步說明本發明,本發明的實施例僅用于解釋本發明,并不意味著限制本發明的保護范圍。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業途徑得到。

實施例1篩選與宮頸鱗癌相關的基因標志物

1、樣本收集

收集32例宮頸鱗癌(CESC)組織和18正常組織(N),24例宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)組織,所有病例術前未做任何免疫抑制劑治療、放療以及化療,所有納入的研究對象均于收集標本前簽署知情同意書。上述所有標本的取得均通過組織倫理委員會的同意。每組各取4例標本進行基因表達譜的檢測分析,進行差異表達基因的篩選,并在各組全部病例標本中進行驗證實驗。

2、RNA樣品的制備

利用QIAGEN的組織RNA提取試劑盒提取各組組織中的總RNA,具體步驟參考說明書。

3、RNA樣品的質量分析

將上述提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳,利用Nanodrop2000對所提RNA的濃度和純度進行檢測,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,Agilent2100測定RIN值。單次建庫要求RNA總量5μg,濃度≥200ng/μL,OD260/280介于1.8~2.2之間。

4、cDNA文庫的構建

利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit進行cDNA文庫的構建,具體操作按說明書進行。

5、測序

使用Illumina X-Ten測序平臺對cDNA文庫進行測序,具體操作按說明書進行。

6、高通量轉錄組測序數據分析

對測序結果進行生物信息學分析,采用metaMA包分析,meta分析中p值合并所用方法為inverse normal method,差異表達基因的篩選標準是FDR<0.05。

7、結果

RNA-seq結果顯示,與正常對照相比,BDKRB2基因在宮頸鱗癌組織、以及在宮頸上皮內瘤樣病變組織中的表達量顯著下調,其中宮頸鱗癌組織中的表達量與宮頸上皮內瘤樣病變組織相比,表達量也顯著下調,差異具有統計學意義,因此對BDKRB2進行進一步的大樣本驗證。

實施例2QPCR測序驗證BDKRB2基因的差異表達

1、對BDKRB2基因差異表達進行大樣本QPCR驗證。

2、RNA提取

利用QIAGEN的組織RNA提取試劑盒提取各組組織中的總RNA,具體步驟參考說明書。

3、QPCR

1)逆轉錄反應

采用FastQμant cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號:KR106)進行lncRNA反轉錄,首先去除基因組DNA反應,在試管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl,總RNA 1μg,加RNase Free ddH2O使總體積至10μl,水浴鍋中42℃加熱3min.

將10×Fast RT Bμffer 2.0μl,RT Enzyme Mix 1.0μl,FQ-RT Primer Mix 2.0μl,RNase Free ddH2O 5.0μl,混合后加入上述試管中一起混合共20μl,水浴鍋中42℃加熱15min,95℃加熱3min。

2)引物設計

根據Genebank中BDKRB2基因和GAPDH基因的編碼序列設計QPCR擴增引物,由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下:

BDKRB2基因:

正向引物為5’-GAGTGTCATCACCTTCTG-3’(SEQ ID NO.1);

反向引物為5’-TCTGGATCTCCTTGAACT-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因:

正向引物為5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3);

反向引物為5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

3)QPCR擴增檢驗

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(貨號:FP205),進行擴增,實驗操作按產品說明書進行。

采用20μl反應體系:2×SuperReal PreMix Plus 10μl,正反向引物(10μM)各0.6μl,5×ROX Reference Dye△2μl,DNA模板2μl,滅菌蒸餾水4.8μl。每個樣本設置3個平行管,所有擴增反應均重復三次以上以保證結果的可靠性。

擴增程序為:95°15min,(95℃10s,55℃30s,72℃32s)×40個循環,95℃15s,60℃60s,95℃15s)。

4)cDNA模板濃度的篩選

將各樣本cDNA混合后,以此為模板進行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀釋,稀釋后樣品各取2μl作模板,分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增,同時在60-95℃進行融解曲線分析,根據擴增效率高和溶解曲線單峰原則進行模板濃度的篩選。

根據溶解曲線,可以看出,當cDNA的進行10倍稀釋時,PCR的擴增效率較高,溶解曲線單峰比較好。

5)樣品RealTime PCR檢測

將各樣品cDNA 10倍稀釋后取2μl作模板,分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增。同時在60-95℃進行溶解曲線分析,通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶,2-ΔΔCT法進行相對定量。

4、結果

結果如圖1所示,與正常組織相比,宮頸鱗癌組織和宮頸上皮內瘤樣病變組織中的BDKRB2表達量顯著下調,其中宮頸上皮內瘤樣病變組織與正常組織相比,呈現顯著性下調,宮頸鱗癌組織與宮頸上皮內瘤樣病變組織相比,呈現顯著性下調,差異均具有統計學意義(P<0.05)。

實施例3 BDKRB2基因的過表達

根據NCBI中BDKRB2基因序列信息設計特異性引物,進行擴增獲得相應基因,將基因片段膠回收后分別與表達載體pEGFP-C1進行連接后轉化入DH5α感受態細胞中,挑取陽性克隆經PCR和測序鑒定后獲得pEGFP-C1-BDKRB2重組質粒。

1、細胞培養

宮頸鱗癌細胞(Hela)用含10%胎牛血清和1%P/S的RPIM-1640培養基在37℃、5%CO2的培養箱中培養,當細胞長至80%~90%時,使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶常規消化傳代。

2、轉染

將實驗分為3組,分別為對照組(Hela)、空白對照組(轉染pEGFP-C1)、實驗組(轉染pEGFP-C1-BDKRB2),按照invitrogen公司的lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染。步驟如下:

1)對數生長期的細胞消化輕輕吹打成單細胞懸液,用不含抗生素的培養基接種于6孔板,6孔板的細胞密度達2×105個/孔,當細胞融合率達40%-60%進行轉染試驗;

2)次日轉染,取10μl Lipofectamine 2000稀釋于200μl不含血清的Opti-MEMI培養基,室溫靜置5min;

3)取4μg質粒溶于200μl無血清的Opti-MEM I培養基;

4)將上述兩種稀釋液混合均勻,室溫孵育20分鐘;質粒和轉染試劑的比例為每孔4μg:10μl;

5)將6孔板中細胞更換1.6ml新鮮RPIM-1640培養基。將上述混懸液分別加入到6孔板中,每孔培養液終體積為2ml;

6)轉染6小時后更換2ml新鮮完全培養液繼續培養;

7)72h收集細胞,提取RNA,進行QPCR檢測。

3、QPCR檢測BDKRB2基因的轉錄水平

1)細胞總RNA的提取

采用QIAGEN的細胞RNA提取試劑盒進行細胞總RNA的提取,具體步驟詳見試劑盒說明書

3.2逆轉錄步驟同實施例2。

3.3QPCR擴增步驟同實施例2。

4、統計學方法

實驗都是按照重復3次來完成的,結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示,采用SPSS18.0統計軟件來進行統計分析的,過表達BDKRB2基因表達組與對照組之間的差異采用t檢驗,認為當P<0.05時具有統計學意義。

5、結果

結果如圖2顯示,相比對照組Hela和轉染空載pEGFP-C1,實驗組pEGFP-C1-BDKRB2能夠顯著增加BDKRB2基因的表達水平,差異具有統計學意義。

實施例4 CCK-8法檢測宮頸鱗癌細胞增殖活性

1、轉染6小時后用0.25%胰蛋白酶消化細胞,用含10%胎牛血清的培養液配成單個細胞懸液(1×104/孔),接種于96孔培養板中(100μl/孔),每組各設6個復孔,同時設立無細胞的培養液空白對照。

2、于檢測時間點(0h,24h,48h,72h,96h,120h)分別加入細胞增殖檢測試劑CCK-8,工作濃度為1:10,即100μl培養液加入10μl CCK-8;

3、在37℃,5%CO2孵育箱中孵育1h后,進行檢測,酶標儀讀數OD 450nm。

4、結果判斷:轉染后0h,24h,48h,72h,96h,120h使用酶標儀觀察Hela細胞的增殖活性,細胞在波長450nm處的吸光光度值(OD值)表示處于增殖狀態的細胞數量,以無細胞的培養液組OD值為對照。

5、結果

結果如圖3所示,轉染pEGFP-C1-BDKRB2的實驗組的細胞增殖顯著減少,提示改變BDKRB2的表達水平可以改變宮頸鱗癌細胞的增殖能力,說明BDKRB2與宮頸鱗癌細胞的增殖相關,提示BDKRB2可作為靶標應用于宮頸鱗癌的治療。

實施例5 Transwell方法檢測宮頸鱗癌細胞遷移和侵襲

1、細胞遷移能力檢測

1)遷移前一天將完全培養基加入孔板中,放入小室置于培養箱中過夜;

2)將轉染48h后的細胞進行饑餓處理,收集細胞計數,用0.2%BSA的無血清培養基制成1×105的懸液。

3)取200μl細胞懸液接種于Transwell小室內培養。

4)取出小室,吸干剩余液體后置于70%甲醇固定30min,用棉簽擦去上室面的細胞。

5)小室浸入0.4%結晶紫染色10min,PBS清洗兩遍,顯微鏡下隨機選取視野計數膜底面的細胞數。

2、細胞侵襲能力檢測

1)侵襲實驗前一天在冰上用RPIM 1640 1:8稀釋基質膠,每個24孔懸掛式小室底部膜上室面加稀釋后的基質膠60μl干燥待用。

2)水化基底膜:每孔加入50μl含10g/LBSA的無血清培養液,37℃,30min,吸出培養板中殘余液體。

3)將轉染48h后的細胞進行饑餓處理,收集細胞計數,用0.2%BSA的無血清培養基制成1×105的懸液。

4)取出小室,吸干剩余液體后置于70%甲醇固定30min,用棉簽擦去上室面的細胞。

5)小室浸入0.4%結晶紫染色10min,PBS清洗兩遍,顯微鏡下隨機選取視野計數膜底面的細胞數。

3、數據處理

用SPSS18.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料用均數±標準差表示。多個樣本均數比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。

4、結果

結果如圖4所示,實驗組的細胞遷移和侵襲數分別較轉染空白質粒的少,說明過表達BDKRB2基因降低宮頸鱗癌細胞的遷移和侵襲能力,提示BDKRB2可作為分子靶標應用于宮頸鱗癌轉移和侵襲的治療。

上述實施例的說明只是用于理解本發明的方法及其核心思想。應當指出,對于本領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明原理的前提下,還可以對本發明進行若干改進和修飾,這些改進和修飾也將落入本發明權利要求的保護范圍內。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技術有限公司

<120> 宮頸病變疾病的生物診治標志物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 2

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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