一種可對腫瘤靶向治療相關靶點和免疫治療相關TMB及MSI同時進行檢測的體系的制作方法

文檔序號:18145655發布日期:2019-07-10 11:47
一種可對腫瘤靶向治療相關靶點和免疫治療相關TMB及MSI同時進行檢測的體系的制作方法
本發明涉及一種基于高通量測序平臺開發的基因檢測體系,可同時檢測腫瘤相關靶向治療和免疫治療相關基因信息。
背景技術
::大量臨床研究已經表明,以TKI類小分子抑制劑為代表的靶向治療藥物給廣大癌癥患者帶來了更多的獲益,相應的伴隨診斷產品也成為了臨床制定治療方案前必選的項目之一。靶向治療雖然可以使病人更多獲益,但仍有30%以上的病人因為不符合靶向治療的標準,無法選擇該治療方案。近年來,免疫檢查點抑制劑藥物的突破性進展,為癌癥患者帶來了新的希望,尤其以PD1/PDL1類藥物的臨床研究最為火熱,但不建議在含有驅動基因突變的患者中使用。目前,大多臨床專家形成以下共識:一線治療時首選靶向治療,若不符合靶向治療的標準,再考慮免疫治療。因此,靶向治療相關驅動基因突變及免疫檢查點抑制劑相關分子靶標檢測對臨床腫瘤治療均具有重要意義。臨床大多以腫瘤手術組織或活檢標本為檢測目標,一般病理醫生可以將組織做成石蠟包埋玻片,通過組織細胞形態,對腫瘤細胞含量及腫瘤類型進行病理診斷,不足之處在于腫瘤組織存在較強異質性,局部組織不能代表整體情況,且很多晚期癌癥患者無法獲取腫瘤組織,失去了較多治療選擇。研究發現血液中存在腫瘤游離DNA,易于獲得,且不存在異質性問題,可作為組織樣本的最佳替代樣本。但其缺點在于,外周血中腫瘤來源游離DNA含量較組織樣本少,腫瘤突變豐度較低,對檢測技術的靈敏度和準確性要求較高。目前臨床用于腫瘤靶向治療的伴隨診斷產品多以ARMS-PCR為主,靈敏度和準確性都較高,缺點是通量相對較低,于是更多的檢測產品逐漸轉向高通量測序(NGS)平臺。免疫治療療效與機體免疫狀態有較大相關性,臨床研究顯示PDL1高表達或腫瘤突變負荷(TMB)較高或錯誤修復系統缺陷的患者療效較好,因此臨床關于免疫檢查點抑制劑藥物的伴隨診斷產品基本圍繞PDL1表達、TMB(Tumormutationburden,腫瘤突變負荷)檢測及MSI(Microsatalliteinstability,微衛星不穩定)檢測展開,三種分子靶標的檢測方法一般為:免疫組化、NGS、PCR+Sanger。綜上所述,目前臨床用于腫瘤治療的分子靶標較多,涉及基因組范圍內多個基因、多種突變類型,傳統檢測方式多樣,但均只能檢測個別靶標,要做到精準、全面的治療,需要多種方法、多個技術平臺的綜合使用,成本高、速度慢、操作復雜。技術實現要素::本發明提供了一種可對腫瘤靶向治療相關靶點和免疫治療相關TMB及MSI同時進行檢測的體系,該體系基于高通量測序技術開發,采用探針捕獲的靶向測序方法,結合生物信息分析技術,可同時適用于組織樣本類型和血液樣本類型。一種可對腫瘤靶向治療相關靶點和免疫治療相關TMB及MSI同時進行檢測的體系,包括:文庫制備試劑;所述的文庫根據提取的DNA類型而定,ctDNA樣本直接進行建庫而得;組織樣本進行片段化,使其長度集中在200~500bp左右,再建庫而得;所建的文庫,兩端接頭含有6~12bp的隨機分子標簽;探針:探針為DNA探針,長度在30~150bp之間,覆蓋的區域包括含EGFR、ALK在內的靶向治療藥物相關基因靶點和至少200個MSI位點;測序系統,能夠對文庫進行測序;數據分析系統;所述數據分析系統能夠分析包括數據質控信息和統計信息、突變位點信息及TMB數值在內的結果。本發明所述的術語“文庫”的含義為:兩端含有一段特定相同序列的DNA片段分子庫,包括了全部基因組或部分基因組的序列信息,可以被同一段序列進行擴增或信息讀取。本發明所述的術語“建庫”的含義為:將一系列DNA片段分子兩端連上加上特定序列標簽的過程。與現有檢測產品相比,本發明的主要有益效果有:1、適用范圍廣:可同時適用于組織樣本和液體活檢樣本。2、檢測范圍全:同時檢測靶向藥物相關位點、PD1/PDL1相關免疫治療分子指標,通過一次性檢測,可同時指導或輔助指導靶向治療和免疫治療。本發明的直接目的不是得到疾病診斷結果,而是為指定個性化治療方案提供參考依據。3、節約樣本:只需要一份樣本,就可同時對多種基因信息進行檢測,有效解決了病人樣本量不足以同時檢測多個項目的問題。4、節省時間:一次檢測可以獲得多個有效信息,不需要等靶向治療相關檢測結果出來之后再進行免疫治療相關檢測。5、準確性高:文庫接頭部分設計有分子標簽,可對擴增中產生的錯誤進行校準,結果更加準確可靠。6、靈敏度高:對于組織樣本靈敏度可以達到1%,對于血液樣本,靈敏度可以達到0.5%,高靈敏度可減少低頻突變的漏檢,提升陽性檢出率,增加患者獲益概率。附圖說明圖1為實施例2中TMB分析結果與WES結果對比。具體實施方式一種可對腫瘤靶向治療相關靶點和免疫治療相關TMB及MSI同時進行檢測的方法,包括以下步驟:1、樣本采集:本產品可同時適用于外周血樣本和腫瘤組織樣本。外周血樣本可通過高速離心的方式分離血漿和白細胞,以血漿樣本抽提的DNA作為檢測樣本,以白細胞作為對照樣本;組織檢測樣本可以為新鮮手術組織、穿刺組織、FFPE、石蠟包埋塊、蠟卷、胸水等,對照樣本可以選擇白細胞樣本、唾液樣本、口腔拭子或者癌旁組織樣本等可獲取個人全部遺傳信息的非癌癥組織樣本,優選白細胞樣本,腫瘤組織樣本建議進行病理質控,腫瘤細胞含量最好不低于20%。2、DNA提?。菏褂肈NA提取試劑盒進行DNA提取,DNA質量應不低于10ng,260/280吸光值在1.8~2.0之間,組織樣本主要DNA片段分布應不低于200bp。3、文庫制備:文庫制備一般含4個主要過程(末端修復、加A、加接頭、文庫擴增),兩端接頭含有6~12bp的隨機分子標簽,用于分子校準,接頭為Illumina、ThermoFisher、BGISeq等測序平臺中的任意一種。ctDNA樣本可直接進行建庫,組織樣本需進行片段化,使其長度集中在200~500bp左右,再開始建庫步驟。4、雜交捕獲:制備好的全基因組文庫需先進行探針捕獲。探針為DNA探針,長度在30~150bp之間,覆蓋的區域包括全基因組范圍內至少448個基因(詳細列表見附錄1),含EGFR、ALK等靶向治療藥物相關基因靶點和至少200個MSI位點。確定好基因位置信息后,根據人類基因組參考序列,挑選相應探針序列,探針序列從每個區域的上下游各外延100bp開始挑選,每條探針長度為30~150bp之間,GC含量在20%~80%之間,所有探針呈交疊狀態,重疊區域為3bp-100bp,每個堿基覆蓋的探針條數不超過3條;探針序列設計好后按照0.5-1.5:0.5-1.5比例進行混合。5、捕獲文庫擴增:捕獲后文庫需要再次進行擴增,擴增循環數為8~20個,擴增后文庫總量應>10ng。6、上機測序:測序可以為單端測序或雙端測序,單條模板測序總讀長應不低于2×75bp,組織樣本數據量建議為10Gp以上,要求不低于5Gbp,測序深度在2000×以上;血漿樣本測序數據量建議為20Gbp以上,要求不低于5Gbp,測序深度在2000×以上;若有對照樣本,對照樣本測序深度建議為2Gbp以上,要求不低于0.2Gbp。7、數據分析:分析包括數據質控信息和統計信息、突變位點信息及TMB數值。突變位點判定標準如下:對于組織樣本,單點覆蓋深度應≥100×,與參考序列不一致堿基比例≥5%,若為靶向藥物相關突變,與參考序列不一致堿基比例應≥1%;對于血漿樣本,單點覆蓋深度應≥500×,與參考序列不一致堿基比例≥0.5%。8、結果解讀:若檢測到熱點突變,則記錄突變點;若未檢測到熱點突變,則記錄未檢測到熱點突變,然后進一步計算TMB數值和MSI檢測。9、TMB數值的計算:首先將檢測到的所有位點進行過濾,可使用對照樣本信息或群體數據庫信息,去除待檢樣本中含有的胚系突變信息,得到突變集A。從突變集A中,將熱點突變位點過濾掉,得到突變集B。再進一步將突變集B中位于編碼區以外區域的突變過濾掉,得到突變集C。計算突變集C中點突變、插入缺失突變的個數,除以檢測區域大小,即為該樣本的TMB數值T。T≥10為TMB-H,T<10為TMB-L。10、MSI檢測:本發明涉及MSI位點共57個(附錄2),該算法根據二代高通量測序片段的個數計算微衛星位點對應的重復序列長度覆蓋率mean1和標準差sd1、主要重復單元數mean2和標準差sd2,從而構建參考集。使用參考集對待測樣本的微衛星位點進行判定,若待測樣本微衛星位點平均覆蓋度<mean1-2sd1或待測樣本微衛星位點主要重復單元平均數>mean2+3sd2,則該位點判定為MSI。若待測樣本中判定為MSI的位點數<總MSI位點數的20%,則待測樣本為MSS;若待測樣本中判定為MSI的位點數≥總MSI位點數的40%,則待測樣本為MSI-H;介于20%~40%之間的判定為MSI-L。實施例1:已知熱點突變樣本位點檢測檢測步驟:1、DNA打斷:取檢測合格的FFPE樣本DNA200ng,使用130ul體積打斷管進行打斷,打斷后取125ul打斷產物,分別用100ul磁珠和50ul磁珠進行片段篩選,25ul純化水進行洗脫。2、文庫制備:打斷后DNA進行定量,以熒光定量法為準,取20ng打斷后產物,補水至25ul,加入3.5ul末端修復緩沖液和1.5ul末端修復酶,按照以下程序運行:20℃30min+65℃30min+4℃保存。末端修復產物加入0.3ul接頭、15ul連接緩沖液和0.5ul增強子,20℃15min,然后4℃保存。連接產物使用44ul磁珠進行純化,25ul純化水進行洗脫。取23ul連接純化產物,加入25ul擴增反應液、1ulP5引物和1ulP7引物,按照以下程序進行擴增。擴增產物再用40ul磁珠純化,25ul純化水進行洗脫。3、文庫質控:濃度>30ng/ul,片段在300-500bp之間且無二聚體(170bp)為合格。4、雜交反應:待雜交文庫按照所需數據量比例進行混合,總量為1000ng,加入含7ul封閉劑的PCR管中,濃縮蒸干(60℃)。往PCR管中加入雜交液等,95℃5min+47℃16h雜交過夜。試劑取用量(ul)2×捕獲緩沖液7.5雜交組分A3Probelibrary(探針庫)4.5所述的探針庫,建立方法如下:確定好基因位置信息后,根據人類基因組參考序列,挑選相應探針序列,探針序列從每個區域的上下游各外延100bp開始挑選,每條探針長度為30~150bp之間,GC含量在20%~80%之間,所有探針呈交疊狀態,重疊區域為3bp-100bp,每個堿基覆蓋的探針條數不超過3條;探針序列設計好后按照1:1比例進行混合。5、磁珠捕獲:取100ul鏈霉素磁珠于1.5ml離心管內,去上清,加入200洗滌緩沖液洗一次,重復一次,再加入100ul洗滌液,轉移至PCR管中,磁力架上棄上清。雜交文庫加入到磁珠中混勻,ABI2720PCR儀上,48℃45min,15min混勻一次。6、洗滌準備:洗滌液從冰箱中取出后放金屬浴預熱,待完全澄清后,按表格稀釋洗滌液,將②取110ul出來,與①一起放48℃30min。按照洗滌順序:②→①→①→②→③→④進行洗滌。7、洗滌操作:取預熱的100ul②加入到含雜交液和磁珠的PCR管中,小心吹吸10次,轉移至1.5ml離心管中,棄上清。加入預熱的①200ul,迅速吹打混勻,防止溫度下降,48℃5min,磁力架上棄上清,重復一次。后面分別用200ul②→③→④進行洗滌,每次震蕩混勻時間從2min開始逐漸縮短30s。8、帶磁珠擴增:加入50ul純化水混勻,加入擴增試劑后進行擴增,程序如下:9、捕獲后純化:產物轉移至1.5ml離心管中,30ul+20ul磁珠雙篩,25ul純化水洗脫。10、捕獲后文庫質控:濃度>10ng/ul,片段在300-500之間為合格。11、上機測序:每個子文庫上機數據量之和為捕獲后文庫總的數據量,測序讀長為2×150bp。12、數據質控:Q30>80%,比對率>90%,目標區域覆蓋度>90%,樣本數據量高于預期數據量,滿足以上條件為數據合格,可進行后續分析,詳見附錄一附表3。13、數據分析:使用廈門艾德生物信息分析系統進行分析,突變信息如下,與預期結果一致。實施例2:37例樣本進行TMB檢測,操作步驟同實施例1,TMB分析結果與WES結果對比,一致性較高。數據質控結果見附錄一附表4,TMB數值結果見附錄一附表5。實施例3:20例樣本進行MSI檢測,操作步驟同實施例1,MSI檢測結果與Sanger檢測的結果對比,一致性較高。數據質控結果見附錄一附表6。附錄1表1用于檢測點突變與插入缺失突變的基因列表表2同時檢測點突變、插入缺失及融合突變的基因列表表3測序數據質控信息表1表4測序數據質控信息表2表5TMB數值信息表表6測序數據質控信息表3附錄二表2微衛星位點信息當前第1頁1 2 3 
再多了解一些
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