一種檢測FGFR2融合的FISH探針組及其應用的制作方法

文檔序號:18145654發布日期:2019-07-10 11:47
一種檢測FGFR2融合的FISH探針組及其應用的制作方法

本發明屬于分子檢測技術領域,具體涉及一種檢測FGFR2融合的FISH探針組及其應用。



背景技術:

肝內膽管細胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma ICC)是起源于二級膽管及其分支上皮的腺癌,惡性程度比較高,約占肝臟原發性惡性腫瘤的10-15%,發病率僅次于肝細胞肝癌(Rizvi and Gores,Gastroenterology 2013)。在全球范圍內,ICC屬于較為罕見的腫瘤,但在中國、韓國、泰國等東南亞國家,ICC屬于常見腫瘤,并且近年來發病率呈上升趨勢,我國ICC的發病率約為7.5/10萬(Cardinale et al.Hepatoma Res 2018;4:20)。

ICC早期無明顯臨床癥狀,多數患者發現時已處于晚期,預后極差,5年生存率僅為5%。隨著基因檢測技術的發展,通過對ICC基因譜和表達譜的分析,發現~70%ICC患者存在相關基因突變,如FGFR2融合、KRAS突變、BRAF突變、IDH突變(Sia D et al.Nature Comm 2014),同時越來越多的靶向藥物被開發出來,并用于ICC的臨床研究,取得了不錯的治療效果,給ICC患者帶來了新的希望(Mazzaferro V et al.British Journal of cancer 2018;Javle M et al.ESMO 2018)。

FGFR2(fibroblast growth factor receptor 2)是成纖維生長因子受體家族成員,在胚胎發育、組織創傷修復、血管生成等生理過程中發揮重要作用,近年的研究表明,FGFR2通過誘導分裂、促進腫瘤細胞轉移、促進血管生成等方式參與腫瘤發生、發展,是ICC等腫瘤的驅動基因,也是新的治療靶點。FGFR2在ICC中的主要變異形式是基因融合,已發現FGFR2的融合伙伴基因有30多種,融合方式多種多樣,因此,針對FGFR2融合的檢測有一定的挑戰。



技術實現要素:

本發明的目的在于克服現有技術缺陷,提供一種檢測FGFR2融合的FISH探針組。

本發明的另一目的在于提供一種檢測FGFR2融合的FISH試劑盒。

本發明的技術方案如下:

一種檢測FGFR2融合的FISH探針組,包括

5′端探針組,以FGFR2基因端粒一側的核苷酸序列的不同的二BAC克隆為模板,用隨機引物擴增而得,其中每一探針均修飾有第一報告基團;

3′端探針組,以FGFR2基因著絲粒一側的核苷酸序列的不同的二BAC克隆為模板,用隨機引物擴增而得,其中每一探針均修飾有第二報告基團;

上述隨機引物由9個核苷酸構成,每一核苷酸為A、T、C或G,且從5′端起算的第一和/或第五位的核苷酸通過spacer 9連接修飾有熒光基團。

在本發明的一個優選實施方案中,所述5′端探針組的模板由RP11-78A18和RP11-436E17組成。

在本發明的一個優選實施方案中,所述3′端探針組的模板由RP11-7P17和RP11-984I17組成。

在本發明的一個優選實施方案中,所述第一報告基團為第一熒光報告基團。

在本發明的一個優選實施方案中,所述第二報告基團為第二熒光報告基團。

本發明的另一技術方案如下:

一種檢測FGFR2融合的FISH試劑盒,包括上述FISH探針組。

在本發明的一個優選實施方案中,包括FGFR2基因斷裂探針體系,該FGFR2基因斷裂探針體系由所述FISH探針組、Cot-1DNA、2×雜交液和ddH2O組成,其中2×雜交液的配方中含有50%(V/V)甲酰胺和10%(W/V)硫酸葡聚糖,并以2×SSC溶液為溶劑。

進一步優選的,所述FGFR2基因斷裂探針體系的組成如下表所示:

。

本發明的有益效果是:

1、本發明中的FGFR2基因斷裂探針體系通過對肝內膽管癌組織切片或其他腫瘤組織切片進行常規處理后,采用雙色斷裂探針進行熒光原位雜交,根據觀察到的熒光信號情況判斷是否存在FGFR2基因融合,操作快速、簡便,檢測結果準確可靠,可準確檢測出FGFR2基因所有融合類型(既包括已知的融合類型,也包括未知的融合類型),為肝內膽管癌患者治療方案提供參考依據,有利于患者個體化靶向治療,減少藥物副作用,提高患者生存質量,減輕家庭、社會負擔,適于大規模推廣應用。

2、本發明的FISH探針設計巧妙、周全,5′端探針組和3′端探針組分別均由2個BAC克隆標記得到,避免了單個BAC克隆導致的信號強度弱和3個或以上BAC克隆導致的信號背景高的缺點,探針特異性和敏感性高。

3、本發明的FISH探針的5′端探針組和3′端探針組均采用了特定設計的隨機引物法進行標記,與常規方法不同,本發明所用的隨機引物經過了特殊的修飾,特殊的修飾指在隨機引物的5′端第一個堿基或第五個堿基修飾一個熒光基團,并且熒光基團與被修飾的堿基之間通過Spacer隔開,以避免修飾對標記反應的影響,通過這一修飾,使得標記得到的探針具有更高的熒光標記效率(即探針上每100bp所摻入的熒光染料更多),常規的隨機引物法標記效率在2-4個染料/100bp,本發明探針的標記效率在3-5個染料/100bp,標記效率提高約40%,從而產生更強的熒光信號。

附圖說明

圖1為本發明實施例3中的FGFR2基因融合檢測的陰性結果圖,可見細胞內有2個融合信號(或紅綠緊鄰)。

圖2為本發明實施例3中的FGFR2基因融合檢測的陽性結果圖之一,可見細胞內有1個融合信號(或紅綠緊鄰)和1對紅、綠分離信號。

圖3為本發明實施例3中的FGFR2基因融合檢測的陽性結果圖之二,可見細胞內有1個融合信號(或紅綠緊鄰)和1個單獨的5′端綠色信號。

具體實施方式

以下通過具體實施方式結合附圖對本發明的技術方案進行進一步的說明和描述。

實施例1

FGFR25′端探針組以2個BAC克隆(RP11-78A18和RP11-436E17)為模板,3′端探針組以2個BAC克隆(RP11-7P17和RP11-984I17)為模板,上述BAC克隆均購自美國奧克蘭兒童醫院研究所。探針組的制作和標記步驟如下:

(1)在2個200μL PCR反應管中,分別按如下體系加入反應原料進行5′端探針組和3′端探針組的制作和標記:

上述隨機引物由9個核苷酸構成,每一核苷酸為A、T、C或G,且從5′端起算的第一和/或第五位的核苷酸通過spacer9連接修飾有熒光基團;上述5×Buffer的配方為:10mM Tris-HCl、25mM MgCl2(氯化鎂),用ddH2O配制。

吹打混勻后,于PCR儀上95℃變性10min,立即置于冰上5min,然后瞬時離心。

(2)避光環境下,在步驟(1)所得的物料中加入如下體系反應原料:

注:熒光素最后加,剩余的熒光素于-20℃避光保存。5′端所用熒光基團與3′端所用熒光基團可以互換,相應的隨機引物修飾的熒光基團也需要互換。

吹打混勻后,于PCR儀上37℃反應3.5h,加入2.5μL 0.5M EDTA,pH7.4終止反應。

(3)沉淀探針:向(2)加入2.75μL(1/10體積)3M乙酸鈉(pH 5.2),再加入70μL-20℃預冷凍的無水乙醇(約2.5倍體積),充分混勻后,用錫箔紙包住,-20℃沉淀2h或沉淀過夜(12-16h)。

(4)從-20℃取出探針,4℃、13000rpm離心20min,用移液槍小心吸棄上清,再加入200μL 75%乙醇(-20℃預冷凍),混勻,4℃、13000rpm離心20min,用移液槍小心吸棄乙醇,避光、室溫通風櫥中吹干10min。

(5)重懸探針組:加入5μL ddH2O重懸探針沉淀(視沉淀量而定,若沉淀量較多,也可用10μL ddH2O溶解),分別得到5′端探針組和3′端探針組。

(6)標記效率和濃度測定:使用紫外分光光度分別檢測5′端探針組和3′端探針組的標記效率和濃度。

(7)FGFR2基因斷裂探針體系配制體系如下:

-20℃避光保存。

上述2×雜交液的配方中含有50%(V/V)甲酰胺和10%(W/V)硫酸葡聚糖,并以2×SSC溶液為溶劑。

實施例2

使用紫外分光光度計測定上述探針組中的探針的標記效率和濃度的步驟如下:

(1)打開紫外分光光度計(NanoDrop),選擇全波長模式,并選擇對應的波長,在空白校準后,分別測定5′端探針組的A260nm、ADye(FITC:A494nm)和3′端探針組的A260nm、ADyc(Tetramethyl-rhodamine:A560nm)。

(2)由于熒光染料在260nm處也有一定的吸光值,為使探針在260nm處的吸光值更準確,使用以下公式校正A260的值:ABase=A260-(ADye×CF260),CF260指校正因子,是一個常數,每種熒光染料都有確定的CF260值,如Tetramethyl-rhodamine的CF260值是0.06、FITC是0.32。(3)通過以下公式計算探針標記效率和濃度:探針標記效率=100×(ADye×εBase)÷(ABase×εDye),探針濃度=(ABase×MWbase)/(εBase×光徑)×50ng/μL,其中ε指摩爾消光系數,如dsDNA的值為6600(cm-1·M-1)、Tetramethyl-rhodamine為89000(cm-1·M-1)、FITC為78000(cm-1·M-1),dsDNAMWbase為330,本實施例中,光徑為0.1cm。

使用本實施例的標記方法和常規隨機引物標記方法標記得到的5′端探針組和3′端探針組的標記效率和濃度如下表所示:

由上表可以看出,使用本實施例的標記的探針濃度與常規隨機引物標記法沒有明顯差別,但探針的標記效率更高,平均可提高42%,因此可以產生更強的熒光信號。

實施例3

使用實施例1制得的FGFR2基因斷裂探針體系對由醫院提供的50例已知FGFR2基因融合結果的肝內膽管癌樣本進行檢測,檢測步驟如下:

(1)樣本脫蠟、復水:將組織切片樣本依次浸入3缸二甲苯中脫蠟,每次10min,然后依次在100%、100%、100%、85%和70%乙醇中浸泡3min,最后浸入去離子水中3min。

(2)樣本預處理和消化:將組織切片樣本在100℃水中煮20min,取出樣本用胃蛋白酶消化10min,轉移到2×SSC溶液中浸泡3min,取出樣本依次浸入70%、85%和100%乙醇脫水,每次3min,取出樣本自然晾干。

(3)樣本與探針雜交:用移液槍取10μL FGFR2基因斷裂探針體系加到樣本上,蓋上蓋玻片,注意避免產生氣泡,用封片膠封住蓋玻片。置于原位雜交儀中,85℃變性5min,37℃雜交過夜(12-16h)。

(4)洗滌:取出樣本,用鑷子小心移去蓋玻片,將樣本浸入2×SSC溶液中浸泡5min,再浸入46℃的0.1%NP-40洗滌液中洗滌7min,然后將樣本依次浸入70%、85%和100%乙醇脫水,每次3min,取出樣本自然晾干。

(5)復染:取10μL DAPI復染液加到樣本上,蓋上蓋玻片,復染15min。

(6)鏡下分析:在熒光顯微鏡下,分別用FITC濾光塊和羅丹明濾光塊觀察綠色信號和紅色信號,利用雙通道濾光塊觀察紅綠信號分離情況。選擇細胞輪廓清晰、背景良好、雜交信號強的區域的50個腫瘤細胞進行結果判讀,并記錄和拍照。

(7)結果判讀:如圖1至3所示,在正常的細胞中,可見兩個或多個融合信號(或紅綠信號緊鄰),在異常的細胞中,有三種信號模式,第一種是可見零個或一個或多個融合信號(或紅綠信號緊鄰),以及一對或多對紅、綠分離信號(紅綠信號距離≥2個信號直徑視為分離,否則視為融合信號),第二種是可見一個或多個融合信號(或紅綠信號緊鄰),以及單獨的5′端信號,第三種是可見零個或一個或多個融合信號(或紅綠信號緊鄰),以及單獨的5′端信號伴一對或多對紅、綠分離信號。當異常細胞比例≥15%時判為陽性。

檢測結果加下表所示:

使用實施例1制得的FGFR2基因斷裂探針體系檢測了50例已知FGFR2基因融合結果的肝內膽管癌樣本,結果均一致,說明本發明的特異性和靈敏性均為100%。

以上所述,僅為本發明的較佳實施例而已,故不能依此限定本發明實施的范圍,即依本發明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾,皆應仍屬本發明涵蓋的范圍內。

再多了解一些
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