一種檢測NTRK融合的FISH探針組及其應用的制作方法

文檔序號:18145653發布日期:2019-07-10 11:47
一種檢測NTRK融合的FISH探針組及其應用的制作方法

本發明屬于分子檢測技術領域,具體涉及一種檢測NTRK融合的FISH探針組及其應用。



背景技術:

NTRK1、NTRK2、NTRK3屬于神經營養受體酪氨酸激酶(NTRK)家族,分別位于1、9、15號染色體,分別負責編碼原肌凝蛋白受體激酶(TRK)家族蛋白TrkA、TrkB和TrkC,當胞外配體神經營養因子與Trk蛋白受體結合后,可誘導受體形成二聚體并發生磷酸化,激活RAS/MAPK/ERK、P13K、PLCγ等下游信號通路,參與細胞生長、增殖等過程。TRK在正常組織表達量低,但在發生融合(伙伴基因作為5’端與NTRK 3’端激酶區融合)時,可導致TRK的異常表達,造成激酶區持續激活,引發腫瘤。

NTRK融合在包括肺癌、乳腺癌、胃癌、結直腸癌、膽管癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、黑色素瘤、軟組織肉瘤、嬰兒纖維瘤、腦膠質瘤等多種腫瘤中都有發現,雖然在常見腫瘤如肺癌、乳腺癌、結直腸癌中NTRK融合比例低于5%,但在某些腫瘤如乳頭狀甲狀腺癌、先天性中胚層腎瘤、橋腦膠質瘤發生比例較高,在部分罕見腫瘤如唾液腺乳腺樣分泌癌、先天性嬰兒纖維瘤、分泌型乳腺癌中發生比例甚至可大于90%。因此,NTRK融合具有廣譜性,成為了腫瘤靶向治療的熱門靶點。

拜耳公司和LOXO Oncology公司聯合開發的Larotrectinib(拉羅替尼,也稱LOXO-101,商品名Vitrakvi)是一款TRK特異性小分子抑制劑,因其具有的廣泛而顯著的抗腫瘤療效(臨床試驗中,其對17種腫瘤均有效,總體客觀反應率(ORR)高達81%)而于2018年11月26日獲得美國FDA批準上市,用于治療無已知耐藥突變的,廣泛轉移或局部手術治療效果不好的,現有治療方案進展或無可替代治療方案的,NTRK基因融合的成人和兒童實體瘤患者,也就是說,只要具有NTRK1、NTRK2或NTRK3基因融合的患者,不限腫瘤類型,均可以使用拉羅替尼治療。Ignyta生物技術公司開發的Entrectinib(RXDX-101)是一種口服,具中樞神經系統作用活性的,針對NTRK1/2/3,ROS1和ALK驅動基因的酪氨酸激酶抑制劑,2017年5月FDA授予entrectinib突破性療法認定,用于治療NTRK陽性的局部晚期或轉移性實體瘤的成人和兒童患者的治療。臨床試驗數據顯示,entrectinib也是廣譜藥,對19種腫瘤有效,ORR達57.4%,尤其其具有良好的血腦屏障穿透性,對CNS患者的顱內有效性令人驚喜,ORR為54.5%。因此,檢測腫瘤患者NTRK基因融合狀態,有助于篩選出Larotrectinib/Entrectinib的敏感人群,指導臨床用藥。



技術實現要素:

本發明的目的在于提供一種檢測NTRK融合的FISH探針組。

本發明的另一目的在于提供一種檢測NTRK融合的FISH試劑盒。

本發明的技術方案如下:

一種檢測NTRK融合的FISH探針組,包括

NTRK1 5′端探針組,以NTRK1基因著絲粒一側的核苷酸序列的不同的二BAC克隆為模板,用隨機引物擴增而得,其中每一探針均修飾有第一報告基團;

NTRK1 3′端探針組,以NTRK1基因端粒一側的核苷酸序列的不同的二BAC克隆為模板,用隨機引物擴增而得,其中每一探針均修飾有第二報告基團;

NTRK2 5′端探針組,以NTRK2基因著絲粒一側的核苷酸序列的不同的二BAC克隆為模板,用隨機引物擴增而得,其中每一探針均修飾有第一報告基團;

NTRK2 3′端探針組,以NTRK2基因端粒一側的核苷酸序列的不同的二BAC克隆為模板,用隨機引物擴增而得,其中每一探針均修飾有第二報告基團;

NTRK3 5′端探針組,以NTRK3基因著絲粒一側的核苷酸序列的不同的二BAC克隆為模板,用隨機引物擴增而得,其中每一探針均修飾有第一報告基團;

NTRK3 3′端探針組,以NTRK3基因端粒一側的核苷酸序列的不同的二BAC克隆為模板,用隨機引物擴增而得,其中每一探針均修飾有第二報告基團;

上述隨機引物由9個核苷酸構成,每一核苷酸為A、T、C或G,且從5′端起算的第一和/或第五位的核苷酸通過spacer 9連接修飾有熒光基團。

在本發明的一個優選實施方案中,所述NTRK1 5′端探針組的模板由RP11-1054F3和RP11-66D17組成。

在本發明的一個優選實施方案中,所述NTRK1 3′端探針組的模板由RP11-1038N13和RP11-110J1組成。

在本發明的一個優選實施方案中,所述NTRK2 5′端探針組的模板由RP11-324L15和CTD-2509D1組成。

在本發明的一個優選實施方案中,所述NTRK2 3′端探針組的模板由RP11-152D13和CTD-2339E11組成。

在本發明的一個優選實施方案中,所述NTRK3 5′端探針組的模板由RP11-110O23和RP11-97012組成。

在本發明的一個優選實施方案中,所述NTRK3 3′端探針組的模板由RP11-113C11和CTD-2526N1組成。

在本發明的一個優選實施方案中,所述第一報告基團和第二報告基團分別為第一熒光報告基團和第二熒光報告基團。

本發明的另一技術方案如下:

一種檢測NTRK融合的FISH試劑盒,包括上述FISH探針組。

在本發明的一個優選實施方案中,包括

NTRK1基因斷裂探針體系,由所述NTRK1 5′端探針組、NTRK1 3′端探針組、Cot-1 DNA、2×雜交液和ddH2O組成;

NTRK2基因斷裂探針體系,由所述NTRK2 5′端探針組、NTRK2 3′端探針組、Cot-1 DNA、2×雜交液和ddH2O組成;

NTRK3基因斷裂探針體系,由所述NTRK3 5′端探針組、NTRK3 3′端探針組、Cot-1 DNA、2×雜交液和ddH2O組成;

其中,2×雜交液的配方中含有50%(V/V)甲酰胺和10%(W/V)硫酸葡聚糖,并以2×SSC溶液為溶劑。

本發明的有益效果是:

1、本發明中的NTRK基因斷裂探針體系通過對腫瘤石蠟組織切片進行常規處理后,分別采用3種斷裂探針進行熒光原位雜交,根據觀察到的熒光信號情況判斷是否存在NTRK1或NTRK2或NTRK3基因融合,操作快速、簡便,檢測結果準確可靠,可準確檢測出NTRK1、NTRK2、NTRK3基因所有融合類型(既包括已知的融合類型,也包括未知的融合類型),為腫瘤患者治療方案提供參考依據,有利于患者個體化靶向治療,減少藥物副作用,提高患者生存質量,減輕家庭、社會負擔,適于大規模推廣應用。

2、本發明的FISH探針設計巧妙、周全,5′端探針和3′端探針分別由2個BAC克隆標記得到,避免了單個BAC克隆導致的信號強度弱和3個或以上BAC克隆導致的信號背景高的缺點,探針特異性和敏感性高。同時3種NTRK基因斷裂探針的5′端探針均標記為同一報告基團,3′端探針均標記為同一報告基團,使得3種NTRK基因斷裂探針的結果判讀方法一致,因此整個判讀流程特別簡潔、方便,利于使用。

3、本發明的FISH探針的5′端探針組和3′端探針組均采用了特定設計的隨機引物法進行標記,與常規方法不同,本發明所用的隨機引物經過了特殊的修飾,特殊的修飾指在隨機引物的5′端第一個堿基或第五個堿基修飾一個熒光基團,并且熒光基團與被修飾的堿基之間通過Spacer9隔開,以避免修飾對標記反應的影響,通過這一修飾,使得標記得到的探針具有更高的熒光標記效率(即探針上每100bp所摻入的熒光染料更多),常規的隨機引物法標記效率在2-4個染料/100bp,本發明探針的標記效率在3-5個染料/100bp,標記效率提高約40%,從而產生更強的熒光信號。

附圖說明

圖1為本發明的NTRK1、NTRK2、NTRK3的FISH探針的設計原理圖。

圖2為本發明實施例3中的NTRK1基因斷裂探針體系的陰性結果圖,可見細胞內有1個或2個融合信號(或紅綠緊鄰)。

圖3為本發明實施例3中的NTRK1基因斷裂探針體系的陽性結果圖,可見細胞內有1個融合信號(或紅綠緊鄰)和1對紅、綠分離信號。

圖4為本發明實施例3中的NTRK2基因斷裂探針體系的陽性結果圖,可見細胞內有1個融合信號(或紅綠緊鄰)和1對紅、綠分離信號。

圖5為本發明實施例3中的NTRK3基因斷裂探針體系的陽性結果圖之一,可見細胞內有1個融合信號(或紅綠緊鄰)和1對紅、綠分離信號。

圖6為本發明實施例3中的NTRK3基因斷裂探針體系的陽性結果圖之二,可見細胞內有1個融合信號(或紅綠緊鄰)和1個單獨的3′端紅色信號。

具體實施方式

以下通過具體實施方式結合附圖對本發明的技術方案進行進一步的說明和描述。

實施例1

如圖1所示,NTRK1 5′端探針組(NTRK1基因著絲粒一側)以2個BAC克隆(RP11-1054F3和RP11-66D17)為模板,NTRK1 3′端探針組(NTRK1基因端粒一側)以2個BAC克隆(RP11-1038N13和RP11-110J1)為模板;NTRK2 5′端探針(NTRK2基因著絲粒一側)以2個BAC克隆(RP11-324L15和CTD-2509D1)為模板,NTRK2 3′端探針(NTRK2基因端粒一側)以2個BAC克隆(RP11-152D13和CTD-2339E11)為模板;NTRK3 5′端探針(NTRK3基因端粒一側)以2個BAC克隆(RP11-110O23和RP11-97O12)為模板,NTRK3 3′端探針(NTRK3基因著絲粒一側)以2個BAC克隆(RP11-113C11和CTD-2526N1)為模板。3個基因的5′端探針均使用FITC(第一熒光報告基團)標記為綠色信號,3′端探針均使用Tetramethyl-rhodamine(第二熒光報告基團)標記為紅色信號,上述BAC克隆均購自美國奧克蘭兒童醫院研究所。

以NTRK1基因斷裂探針為例,探針組的制作和標記步驟如下:

(1)在2個200μL PCR反應管中,分別按如下體系加入反應原料進行5′端探針組和3′端探針組的制作和標記:

上述隨機引物由9個核苷酸構成,每一核苷酸為A、T、C或G,且從5′端起算的第一和/或第五位的核苷酸通過spacer 9連接修飾有熒光基團;上述5×Buffer的配方為:10mM Tris-HCl、25mM MgCl2(氯化鎂),用ddH2O配制。

吹打混勻后,于PCR儀上95℃變性10min,立即置于冰上5min,然后瞬時離心。

(2)避光環境下,加入如下體系反應原料:

注:熒光素最后加,剩余的熒光素于-20℃避光保存。

吹打混勻后,于PCR儀上37℃反應3.5h,加入2.5μL 0.5M EDTA,pH7.4)終止反應。

(3)沉淀探針:向(2)加入2.75μL(1/10體積)3M乙酸鈉(pH 5.2),再加入70μL -20℃預冷凍的無水乙醇(約2.5倍體積),充分混勻后,用錫箔紙包住,-20℃沉淀2h或沉淀過夜(12-16h)。

(4)從-20℃取出探針,4℃、13000rpm離心20min,用移液槍小心吸棄上清,再加入200μL75%乙醇(-20℃預冷凍),混勻,4℃、13000rpm離心20min,用移液槍小心吸棄乙醇,避光、室溫通風櫥中吹干10min。

(5)重懸探針:加入5μL ddH2O重懸探針沉淀(視沉淀量而定,若沉淀量較多,也可用10μL ddH2O溶解),分別得到5′端探針組和3′端探針組。

(6)標記效率和濃度測定:使用紫外分光光度分別檢測5′端探針組和3′端探針探針組的標記效率和濃度。

(7)NTRK1基因斷裂探針體系配制體系如下:

-20℃避光保存。

上述2×雜交液的配方中含有50%(V/V)甲酰胺和10%(W/V)硫酸葡聚糖,并以2×SSC溶液為溶劑。

使用同樣的方法制備NTRK2基因斷裂探針體系和NTRK3基因斷裂探針體系。

實施例2

使用紫外分光光度計測定上述探針組中的探針的標記效率和濃度的步驟如下:

(1)打開紫外分光光度計(NanoDrop),選擇全波長模式,并選擇對應的波長,在空白校準后,分別測定5′端探針組的A260nm、ADye(FITC:A494nm)和3′端探針組的A260nm、ADye(Tetramethyl-rhodamine:A560nm)。

(2)由于熒光染料在260nm處也有一定的吸光值,為使探針在260nm處的吸光值更準確,使用以下公式校正A260的值:ABase=A260-(ADye×CF260),CF260指校正因子,是一個常數,每種熒光染料都有確定的CF260值,如Tetramethyl-rhodamine的CF260值是0.06、FITC是0.32。(3)通過以下公式計算探針標記效率和濃度:探針標記效率=100×(ADye×εBase)÷(ABase×εDye),探針濃度=(ABase×MWbase)/(εBase×光徑)×50ng/μL,其中ε指摩爾消光系數,如dsDNA的值為6600(cm-1·M-1)、Tetramethyl-rhodamine為89000(cm-1·M-1)、FITC為78000(cm-1·M-1),dsDNA MWbase為330,本實驗中,光徑為0.1cm。

使用本實施例的標記方法和常規隨機引物標記方法標記得到的5′端探針組和3′端探針組的標記效率和濃度如下表所示:

由上表可以看出,使用本實施例標記的探針濃度與常規隨機引物標記法沒有明顯差別,但探針的標記效率更高,平均可提高41.7%,因此可以產生更強的熒光信號。

實施例3

使用實施例1制得的NTRK1基因斷裂探針體系和NTRK3基因斷裂探針體系檢測由醫院提供的50例乳頭狀甲狀腺癌樣本,NTRK3基因斷裂探針體系檢測10例唾液腺乳腺樣分泌癌樣本,NTRK2基因斷裂探針體系檢測20例橋腦膠質瘤樣本,同時使用美國帝國基因公司(Empire Genomics)的NTRK探針對這些樣本進行檢測,檢測步驟如下:

(1)樣本脫蠟、復水:將組織切片樣本依次浸入3缸二甲苯中脫蠟,每次10min,然后依次在100%、100%、100%、85%和70%乙醇中浸泡3min,最后浸入去離子水中3min。

(2)樣本預處理和消化:將組織切片樣本在100℃水中煮20min,取出樣本用胃蛋白酶消化10min,轉移到2×SSC溶液中浸泡3min,取出樣本依次浸入70%、85%和100%乙醇脫水,每次3min,取出樣本自然晾干。

(3)樣本與探針雜交:用移液槍取10μL探針加到樣本上,蓋上蓋玻片,注意避免產生氣泡,用封片膠封住蓋玻片。置于原位雜交儀中,85℃變性5min,37℃雜交過夜(12-16h)。

(4)洗滌:取出樣本,用鑷子小心移去蓋玻片,將樣本浸入2×SSC溶液中浸泡5min,再浸入46℃的0.1%NP-40洗滌液中洗滌7min,然后將樣本依次浸入70%、85%和100%乙醇脫水,每次3min,取出樣本自然晾干。

(5)復染:取10μL DAPI復染液加到樣本上,蓋上蓋玻片,復染15min。

(6)鏡下分析:在熒光顯微鏡下,分別用FITC濾光塊和羅丹明濾光塊觀察綠色信號和紅色信號,利用雙通道濾光塊觀察紅綠信號分離情況。選擇細胞輪廓清晰、背景良好、雜交信號強的區域的50個腫瘤細胞進行結果判讀,并記錄和拍照。

(7)結果判讀:如圖2至6所示,在正常的細胞中,可見兩個或多個融合信號(或紅綠信號緊鄰),在異常的細胞中,有三種信號模式,第一種是可見零個或一個或多個融合信號(或紅綠信號緊鄰),以及一對或多對紅、綠分離信號(紅綠信號距離≥2個信號直徑視為分離,否則視為融合信號),第二種是可見一個或多個融合信號(或紅綠信號緊鄰),以及單獨的3′端信號,第三種是可見零個或一個或多個融合信號(或紅綠信號緊鄰),以及單獨的3′端信號伴一對或多對紅、綠分離信號。當異常細胞比例≥15%時判為陽性。

本發明探針和帝國基因公司探針的檢測結果如下表1-3所示:

表1 50例乳頭狀甲狀腺癌NTRK1基因斷裂探針檢測結果

表2 20例橋腦膠質瘤NTRK1基因斷裂探針檢測結果

表3 10例唾液腺乳腺樣分泌癌和50例乳頭狀甲狀腺癌NTRK3基因斷裂探針檢測結果

使用實施例1的NTRK1至3基因斷裂探針體系檢測這80例樣本,以美國帝國基因公司的檢測結果作為對照,計算本發明檢測結果的符合率。實施例1的NTRK1基因斷裂探針檢測50例乳頭狀甲狀腺癌樣本,檢測結果與帝國基因公司檢測結果的符合率為100%,實施例1的NTRK2基因斷裂探針檢測20例橋腦膠質瘤樣本,檢測結果與帝國基因公司檢測結果的符合率為100%,實施例1的NTRK3基因斷裂探針檢測10例唾液腺乳腺樣分泌癌樣本和50例乳頭狀甲狀腺癌樣本,檢測結果與帝國基因公司檢測結果的符合率均為100%,說明實施例1的所提供的NTRK1至3基因斷裂探針體系可準確地檢測出NTRK1、NTRK2和NTRK3基因融合。此外,由于實施例1的NTRK1、NTRK2、NTRK3探針組設計時統一將5′端探針組標記為綠色,3′端探針組標記為紅色,因此,實施例1所提供的NTRK1至3基因斷裂探針體系的結果判讀方法完全一致,具有判讀簡便的優點,方便使用。

以上所述,僅為本發明的較佳實施例而已,故不能依此限定本發明實施的范圍,即依本發明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾,皆應仍屬本發明涵蓋的范圍內。

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