一種適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA石蠟切片原位雜交的方法與流程

文檔序號:18145663發布日期:2019-07-10 11:47
一種適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA石蠟切片原位雜交的方法與流程
本發明屬于原位雜交
技術領域
,具體涉及一種適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA石蠟切片原位雜交的方法。
背景技術
:紅螯螯蝦(Cheraxquadricariratus),俗稱澳洲淡水龍蝦,原產澳大利亞北部熱帶區域和新幾內亞南部,隸屬于光殼蝦屬,具有生長快、抗逆強、肉質細嫩、出肉率高等特點,是世界淡水名貴經濟蝦類之一。和其他淡水十足類動物一樣,紅螯螯蝦雄性個體比雌性生長得更快、體型也更大。紅螯螯奸已經得到了廣泛的養殖尤其是在近十年來由于其生物學特性比較明顯,紅螯螯奸的養殖業發展的速度很快。然而,目前對于該蝦性表型分化和二態性發育的機制尚不清楚。原位雜交組織(或細胞)化學(InsituHybridizationHistochemistry,ISHH)簡稱原位雜交(InSituHybridization),屬于固相分子雜交的范疇,它是用標記的DNA或RNA為探針,在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法,廣泛應用于實驗室分析mRNA在生物組織內的分布和富集程度。因此建立適用于紅螯螯蝦性腺組織的石蠟切片mRNA原位雜交技術,對性別決定相關基因進行組織定位和功能研究,有助于加快揭示與闡明紅螯螯蝦性別決定與分化的分子作用機制,從而推動螯蝦性別控制育種技術的發展。技術實現要素:本發明的目的在于提供一種對dsx基因的顯示有明確的特異性,實現了對dsx基因mRNA水平的顯示作用的適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA石蠟切片原位雜交用探針的方法。本發明為實現上述目的所采取的技術方案為:本發明提供一種適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA石蠟切片原位雜交用探針的方法,按照如下步驟:S1步驟:以逆轉錄得到的紅螯螯蝦性腺組織cDNA為模板,利用引物通過PCR反應擴增得到dsx基因的部分ORF序列,該序列作為dsx基因mRNA特異的探針序列;S2步驟:構建dsx基因mRNA原位雜交的探針質粒,將探針質粒轉化細菌后,細菌培養后進行測序;S3步驟:制備dsx基因mRNA原位雜交探針。紅螯螯蝦的性別決定雙性基因都是dsx的同源基因,雙性基因dsx處于性別決定信號通路最下游,相對上游性別決定重要基因來說,其相當保守,變化的僅僅是其拼接形式;且調控拼接的拼接增強或抑制因子以及與之相結合的反式作用元件,在同一亞目內幾乎沒變化,不同亞目間有規律可循。優選地,dsx基因在精巢中表達,而在卵巢中不表達。優選地,引物的正向引物為:5’-GAATTCTAATACGACTCACTATAGGGA-3’;反向引物為:5’-CCTATAGTGAGTCGTATTAAAGCTT-3’。本發明探針對dsx基因的顯示有明確的特異性,實現了對dsx基因mRNA水平的顯示作用。一種適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA石蠟切片原位雜交用探針,采用上述方法制得。優選地,探針序列為如SEQIDNO.3所示。本發明的另一個目的在于提供一種石蠟切片脫蠟效果佳,酶解效果好,雜交信號強,細胞著色好,能夠清晰地描述翹嘴鲌性別相關基因在性腺中的表達定位,準確性高的適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA冰凍切片原位雜交的方法。本發明為實現上述目的所采取的技術方案為:本發明提供一種適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA石蠟切片原位雜交的方法,包括性腺組織包埋、石蠟切片、原位雜交和拍照記錄,原位雜交采用上述探針。優選地,原位雜交包括如下步驟:1)石蠟切片脫蠟:將切片依次用二甲苯、無水乙醇、85%酒精、75%酒精、DEPC水洗進行脫蠟;2)消化:將水洗后切片于修復液中煮沸,自然冷卻后基因筆畫圈,根據不同組織不同指標特性,滴加蛋白酶K消化,沖洗;3)預雜交:將消化后切片上滴加預雜交液,孵育;4)雜交:傾去預雜交液,滴加含探針雜交液,雜交過夜后洗滌;3)封閉:滴加封閉血清BSA,傾去封閉液,然后滴加anti-DIG-HRP,孵育;4)DAB顯色:切片稍甩干后,在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下控制顯色時間,陽性為棕黃色,純水沖洗切片終止顯色;5)復染細胞核:用蘇木素染液復染,水洗后經1%鹽酸酒精分化,水洗,氨水返藍,沖洗;6)封片:中性樹膠封片。優選地,二甲苯中含有0.03-0.06%三氯乙醛和2.8-3.0%苯芴醇。三氯乙醛和苯芴醇的存在一方面促進甲苯快速溶解用于支撐組織和細胞的石蠟,在石蠟切片脫蠟效果佳的同時避免組織收縮和細胞變形,使得組織仍保持在原位,組織形態保持完完整;另一方面能夠增加抗體對細胞膜的通透性,在DAB顯色和蘇木素染液復染的過程中,使得細胞著色好,核質分明,結構清晰,組織、細胞更加透明清晰,便于觀察,提高原位雜交的準確性;此外,還能增加DNA鏈的韌性,避免DNA鏈與蛋白質形成復合物而阻礙蛋白酶的消化,提高酶解效果,最終提高原位雜交的準確性。優選地,探針雜交液的濃度為50ng/ul。優選地,性腺組織包埋包括如下步驟:將組織取出洗凈后立即放入固定液中固定2-12h,固定完成后經梯度酒精脫水后浸蠟,包埋。與現有技術相比,本發明的有益效果為:本發明探針對dsx基因的顯示有明確的特異性,實現了對dsx基因mRNA水平的顯示作用;本發明在紅螯螯蝦中建立了石蠟切片mRNA原位雜交的方法來研究相關基因在性腺中的表達模式,能夠清晰地描述紅螯螯蝦性別相關基因在性腺中的表達定位,對于性別調控基因的鑒定具有重要的意義;本發明方法在石蠟切片脫蠟效果佳的同時避免組織收縮和細胞變形,使得組織仍保持在原位,組織形態保持完完整,還能提高酶解效果,使得細胞著色好,核質分明,最終提高原位雜交的準確性。本發明采用了上述技術方案提供一種適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA石蠟切片原位雜交的方法,彌補了現有技術的不足,設計合理,操作方便。附圖說明圖1是本發明實施例1中紅螯螯蝦dsx基因在性腺組織中的石蠟切片原位雜交分析的示意圖。具體實施方式下面,結合具體實施例對本發明一實施方式的一種適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA石蠟切片原位雜交的方法作進一步說明。實施例1:一種適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA石蠟切片原位雜交用探針的方法,按照如下步驟:S1步驟:根據翹嘴鲌dsx基因編碼區序列設計構建dsx探針載體的引物序列,正反向引物分別帶有EcoRI和Xhol酶切位點,如下所示:正向引物為:5’-GAATTCTAATACGACTCACTATAGGGA-3’,反向引物為:5’-CCTATAGTGAGTCGTATTAAAGCTT-3’;S2步驟:以逆轉錄得到的紅螯螯蝦性腺組織cDNA為模板,利用引物通過PCR反應擴增得到dsx基因的部分ORF序列,該序列作為dsx蛋白特異的探針序列,PCR方法為94℃4min;94℃30s、55℃30s、72℃1min,32cycle;72℃延伸7min,利用Axygen凝膠回收試劑盒純化目的片段;S3步驟:將目的片段和pBluescriptIISK載體用EcoRI和Xhol進行雙酶切處理,反應體系如表1所示,加完試劑后混合充分,37℃水浴中消化4h,結束后進行純化;表1雙酶切反應體系組分體積目的片段或載體3μg10×HBuffer7μlEcoRI3.5μlXhol3.5μlddH2O補充至70μlS4步驟:將酶切后的載體和目的片段于16℃水浴中連接,隨后轉化、測序,通過序列分析鑒定到正確的重組質粒;S5步驟:選擇EcoRI或Xhol對質粒進行單酶切,37℃水浴酶切4h,得到線性化的重組質粒,并用Axygen的Cleanup試劑盒進行純化。隨后以此為模板,轉錄帶地高辛標記的反義RNA探針,具體體系如表2所示,加完試劑后混合均勻,37℃水浴反應2.5h,緊接著加入2μlRNA酶free的DNaseI消化質粒模板,37℃孵育20min,之后加入2μl的0.2MEDTA,冰上靜置待消化反應終止;表2轉錄RNA探針反應體S6步驟:消化結束后,使用MiniQuickSpinRNAColumns(Roche)對RNA探針進行純化,并對純化產物進行電泳和濃度檢測,最后剩余樣品加入等體積去離子甲酰胺,輕混分裝后置于-80℃保存,制得dsx基因的mRNA原位雜交探針。紅螯螯蝦的性別決定雙性基因都是dsx的同源基因,雙性基因dsx處于性別決定信號通路最下游,相對上游性別決定重要基因來說,其相當保守,變化的僅僅是其拼接形式;且調控拼接的拼接增強或抑制因子以及與之相結合的反式作用元件,在同一亞目內幾乎沒變化,不同亞目間有規律可循。上述dsx基因在精巢中表達,而在卵巢中不表達。一種適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA石蠟切片原位雜交用探針,采用上述方法制得。上述探針序列為如SEQIDNO.3所示,具體為:GAATTCTAATACGACTCACTATAGGGATGGCTATGGCGCCTAAGAAGAAATTCGATTTTTTCAATGGTGGTCGGGGAATTGTCCTGACCGACACAACTGATGTGGAAGAATCGTCTGTAGAGCAGCAGCCACCAGAGCCCAAGGTAGTGCAGGAGTCTTATGGTTATGGAGGCGACTATGGGCGCTACTCTGGTTCTTCCGAGGGCTACGTAACCCCCAGCTCTCCTGGGGGCTATATGCCTCCAGGGGGCTATGTCCCCCCCAGATCTCCAGGGGGCTATGTCGTCCCCAGATCTCCAGGGGGCTGTGTGTCCTCTAGATCTCCAGGGGAGTATGTGCCCCCTGACAGCCCGAATGTTCATCAGTACCACGGTGACCCTATAGTGAGTCGTATTAAAGCTT。實施例2:一種適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA石蠟切片原位雜交的方法,包括性腺組織包埋、石蠟切片、原位雜交和拍照記錄,原位雜交采用上述探針。上述原位雜交包括如下步驟:1)組織固定:組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h;2)脫水:組織固定完成后經梯度酒精脫水后浸蠟,包埋;3)切片:石蠟經切片機切片,攤片機撈片,62℃烤箱烤片2h;4)石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗;5)消化:根據組織固定時間長短,切片于修復液中煮沸10-15分鐘,自然冷卻后基因筆畫圈,根據不同組織不同指標特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml)37℃消化30min,純水沖洗后PBS洗3次×5min;6)預雜交:滴加預雜交液,37℃孵育1h;7)雜交:傾去預雜交液,滴加含探針雜交液,濃度50ng/ul,恒溫箱37℃度雜交過夜;8)雜交后洗滌:洗去雜交液,2×SSC,37℃洗10min,1×SSC,37℃洗2×5min,0.5×SSC室溫洗10min,若非特異雜交體較多,可以增加甲酰胺洗滌;9)滴加封閉液:滴加封閉血清BSA,室溫30min;10)滴加鼠抗地高辛標記過氧化物酶(anti-DIG-HRP):傾去封閉液,滴加anti-DIG-HRP。37℃孵育40min,后PBS洗4次×5min;11)DAB顯色:切片稍甩干后,在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下控制顯色時間,陽性為棕黃色,純水沖洗切片終止顯色;12)復染細胞核:蘇木素復染3min左右,自來水洗,1%鹽酸酒精分化數秒,自來水洗,氨水返藍,流水沖洗;13)封片:中性樹膠封片;14)顯微鏡檢,圖像采集分析,結果如圖1所示,圖1中左圖為精巢,右圖為卵巢,信號在精巢,由此可知,dsx基因在精巢中信號較強,而在卵巢未能檢測到信號,表明dsx基因在精巢中表達,而在卵巢中不表達。實施例3:為了提高石蠟切片脫蠟效果,進一步的優化方案為:石蠟切片脫蠟至水步驟中二甲苯中含有0.03-0.06%三氯乙醛和2.8-3.0%苯芴醇。三氯乙醛和苯芴醇的存在一方面促進甲苯快速溶解用于支撐組織和細胞的石蠟,避免組織收縮和細胞變形,使得組織仍保持在原位,組織形態保持完完整;另一方面能夠增加抗體對細胞膜的通透性,在DAB顯色和蘇木素染液復染的過程中,使得細胞著色好,核質分明,結構清晰,組織、細胞更加透明清晰,便于觀察,提高原位雜交的準確性;此外,還能增加DNA鏈的韌性,避免DNA鏈與蛋白質形成復合物而阻礙蛋白酶的消化,提高酶解效果,最終提高原位雜交的準確性。上述實施例中的常規技術為本領域技術人員所知曉的現有技術,故在此不再詳細贅述。以上實施方式僅用于說明本發明,而并非對本發明的限制,本領域的普通技術人員,在不脫離本發明的精神和范圍的情況下,還可以做出各種變化和變型。因此,所有等同的技術方案也屬于本發明的范疇,本發明的專利保護范圍應由權利要求限定。序列表<110>浙江省淡水水產研究所<120>一種適于紅螯螯蝦性腺組織mRNA石蠟切片原位雜交的方法<160>3<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1gaattctaatacgactcactataggga27<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>2cctatagtgagtcgtattaaagctt25<210>3<211>402<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>3gaattctaatacgactcactatagggatggctatggcgcctaagaagaaattcgattttt60tcaatggtggtcggggaattgtcctgaccgacacaactgatgtggaagaatcgtctgtag120agcagcagccaccagagcccaaggtagtgcaggagtcttatggttatggaggcgactatg180ggcgctactctggttcttccgagggctacgtaacccccagctctcctgggggctatatgc240ctccagggggctatgtcccccccagatctccagggggctatgtcgtccccagatctccag300ggggctgtgtgtcctctagatctccaggggagtatgtgccccctgacagcccgaatgttc360atcagtaccacggtgaccctatagtgagtcgtattaaagctt402當前第1頁1 2 3 
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