一種檢測神經管畸形的分子標志物及其應用的制作方法

文檔序號:18145646發布日期:2019-07-10 11:47
一種檢測神經管畸形的分子標志物及其應用的制作方法
本發明涉及生物領域,具體涉及一種檢測神經管畸形的分子標志物及其應用。
背景技術
:神經管畸形(neuraltubedefects,NTDs)是一種高發的出生缺陷性疾病,是出生缺陷中發病率和死亡率最高的類型,也是影響我國乃至世界人口素質最常見和最嚴重的出生缺陷性疾病。NTDs通常發生于懷孕的早期,是由于神經管不閉合或閉合不全而造成的頭部至脊柱部位畸形。從無腦到輕度脊柱裂不同程度的畸形:包括無腦、露腦、小頭畸形、大頭畸形、腦積水、腦脊膜膨出、顱脊柱裂和脊柱裂。新生兒中NTDs畸形率高達0.1-0.5%,其病因和發病機理至今仍不十分清楚。神經管的發育是一個復雜的多步驟過程,是基因-基因,基因-環境和基因-營養共同作用的結果,受基因嚴格控制,環境因素也起重要作用。神經管是體內形成結構最復雜的一個系統,發育最早,結束最晚。在發育過程當中,若受到遺傳因素或環境因素的干擾,超過胚胎的代償能力就可能會發生NTDs。這一時期作為神經管發育的關鍵時期,對孕婦體內生化代謝中物質的增加或少是極為敏感的。根據動物實驗、臨床觀察和流行病學研究認為遺傳因素(多基因遺傳)和環境因素(葉酸維生素缺乏、高熱、酒精及藥物致畸等)都會干擾神經管的閉合。近年來對于人類NTDs的發病機理的研究主要包括基因表達調控的改變(啟動子和調控元件的突變)和表觀遺傳調控的分析,大多關注于基因及特定位點的基因多態性與NTDs的關系。然而,對葉酸通路相關基因的突變位點所進行的關聯分析并未找到造成NTDs的一致風險因子,同一基因的同一位點在某些人群中與NTDs相關,在另外一些人群中卻不相關。神經胚發育過程中有多種信號的參與,作為網狀相連的信號通路,如果有某一環節出問題就可能導致機體代謝失調,基因調控紊亂,進而表現出疾病狀況。近年來,研究人員一直在試圖尋找NTDs的候選基因,研究數據主要來源于生物化學和發育學途徑、動物模型以及定位候選基因三方面,由于小鼠神經管發育機制與人類神經管發育過程十分接近,因而成為了人們研究NTDs發生機制最主要的一種模式動物。近年來,在小鼠模型中已有超過200個基因經研究發現與NTDs相關,NTDs相關基因主要編碼參與細胞信號轉導、調節轉錄、抑制腫瘤生長及染色質重塑相關的蛋白質。目前,研究發現有幾條信號通路無疑是NTDs發生發展過程的重要的調控環節,主要涉及:Wnt/β-catenin信號通路(參與調控胚胎神經管的閉合)、PCP信號通路(參與神經管起始閉合)、Hh/Shh信號通路(過激活導致NTDs,導致神經管閉合不全,形成低位脊柱裂)、BMP信號通路(調控中胚層形成、神經誘導、神經管背腹化的形成)、Notch信號通路(通過調節神經發生參與神經管閉合)。這些通路相關基因可以作為人類NTDs,尤其是顱脊柱裂研究的候選基因。例如,劉陽(劉陽.Wnt/PCP-JNK信號通路在NTDs發生及?;撬犷A防NTDs的介導作用.寧夏醫科大學,2014.)研究發現,Wnt/PCP-JNK信號蛋白通路關鍵蛋白分子DVL表達增高激活下游RhoA同步增高,活化JNK,使JNK發生磷酸化,參與了神經管畸形的發生。上官少方(上官少方,王理,吳麗華等.PCP通路在神經管畸形發生中的作用和研究進展[J].中國優生與遺傳雜志,2010(12):140-142.)等研究發現,PCP信號通路中基因在不同種屬間的高度保守性,及其在匯聚延伸這一細胞極性變化過程中有重要作用,并且動物模型中已經證實,PCP途徑中幾種核心基因的突變引發神經管閉合缺陷,導致嚴重NTDs的發生;因此,研究PCP通路相關基因在NTDs中的變化和作用,對于揭示NTDs的發病機制,了解神經管形成的調控通路,是十分有意義的。雖然現有技術已經發現Wnt、PCP、Notch、Hh/SHH、BMP等信號通路與人類NTDs都有關系,但并沒有對單一特定的蛋白修飾的功能實驗研究,尤其是組蛋白及相關基因與NTDs是否有關的報道,更沒有獲得明確的人類NTDs的分子標志物,以用于人類NTDs的臨床診斷和檢測。技術實現要素:因此,本發明要解決的技術問題在于提供一種新的檢測神經管畸形的分子標志物及其應用。為此,本發明技術方案如下:一種用于檢測神經管畸形的分子標志物,所述分子標志物包括特異性標志基因和/或蛋白質;其中,所述特異性標志基因為Pax6、Nestin和Bmp4中的至少一種,所述蛋白質為H2AK119、Mdm2和/或編碼H2AK119和Mdm2中至少一種蛋白質的基因。本發明還提供上述用于檢測神經管畸形的分子標志物在制備診斷或檢測神經管畸形的產品中的用途。進一步地,所述產品包括基于所述的用于檢測神經管畸形的分子標志物設計的基因芯片、蛋白芯片或檢測試劑。進一步地,所述基因芯片為包括用于擴增檢測所述的用于檢測神經管畸形的分子標志物的引物或與所述的用于檢測神經管畸形的分子標志物雜交的探針。進一步地,所述蛋白芯片包括與所述的用于檢測神經管畸形的分子標志物特異性結合的抗體。進一步地,所述檢測試劑包括采用Bradford法定量分析蛋白H2AK119、Mdm2含量的試劑。進一步地,所述檢測試劑還包括采用熒光定量PCR法分析特異性標志基因Pax6、Nestin和Bmp4含量的試劑。本發明還提供一種檢測神經管畸形的試劑盒,包括上述用于檢測神經管畸形的分子標志物設計的基因芯片、蛋白芯片或檢測試劑。進一步地,所述試劑盒,包括采用Bradford法定量分析蛋白H2AK119、Mdm2含量的試劑;優選的,還包括采用熒光定量PCR法分析特異性標志基因Pax6、Nestin和Bmp4含量的試劑;優選的,還包括提取H2AK119、Mdm2、的試劑。本發明技術方案,具有如下優點:1、本發明提供一種用于檢測神經管畸形的分子標志物,該分子標志物包括特異性標志基因和/或蛋白質;其中,所述特異性標志基因為Pax6、Nestin和Bmp4中的至少一種,所述蛋白質為H2AK119、Mdm2和/或編碼H2AK119和Mdm2中至少一種蛋白質的基因。Mdm2能夠通過促進H2AK119的泛素-蛋白酶體途徑的上調來調控其蛋白穩定性,H2AK119有抑制下游基因的功能,動物模型研究發現,甲氨蝶呤可以引起DNA雙鏈斷裂發生ATM介導的磷酸化,從而將Mdm2招募到H2AK119位點,發生單泛素化,Mdm2水平上調、促進H2AK119單泛素化從而抑制特異性標志基因的現象,并且人體樣本研究也發現神經管畸形的人體內H2AK119和Mdm2水平上調,特異性標志基因Pax6、Nestin和Bmp4全部下調;因此,通過檢測H2AK119、Mdm2的表達,和特異性標志基因Pax6、Nestin和Bmp4的變化情況,可以實現神經管畸形的早期診斷和干預。2、本發明還提供一種檢測神經管畸形的試劑盒,包含上述分子標志物試劑盒制作工藝簡單、操作安全、實用性強,易于推廣使用。附圖說明為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案,下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹,顯而易見地,下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式,對于本領域普通技術人員來講,在不付出創造性勞動的前提下,還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發明實驗例1中MTX為1uM濃度時小鼠胚胎干細胞RNAsequencing差異基因的表達情況;圖2為本發明實驗例1中MTX誘導后小鼠胚胎干細胞內特異性標志基因mRNA水平的表達;圖3為本發明實驗例1中MTX誘導的小鼠胚胎干細胞的蛋白表達變化情況結果圖;圖4為本發明實驗例1中小鼠胚胎干細胞H2AK119的CHIPqpcr的結果圖;圖5為本發明實驗例1中小鼠胚胎干細胞Mdm2的CHIPqpcr的結果圖;圖6為本發明實驗例1中敲除Mdm2后MTX誘導的小鼠胚胎干細胞的蛋白情況;圖7為本發明實驗例1中敲除Mdm2后MTX誘導的小鼠胚胎干細胞的特異性標志基因的變化情況;圖8為本發明實驗例1中敲除Mdm2后H2AK119的CHIPqPCR的結果圖;圖9為本發明實驗例1中MTX誘導后小鼠胚胎干細胞的ATM磷酸化的蛋白情況;圖10為本發明實驗例1中MTX誘導后小鼠胚胎干細胞的ATM被抑制前后的特異性標志基因情況;圖11為本發明實驗例2中MTX誘導后小鼠神經組織內H2AK119及Mdm2的變化情況;圖12為本發明實驗例2中的神經管畸形小鼠神經組織中特異性標志基因的變化情況;圖13為本發明實施例1中人腦組織中特異性標志基因的變化情況;圖14為本發明實施例1中人腦組織中蛋白H2AK119的變化情況;圖15為本發明實施例1中人腦組織中Mdm2的變化情況。具體實施方式提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發明,并不局限于所述最佳實施方式,不對本發明的內容和保護范圍構成限制,任何人在本發明的啟示下或是將本發明與其他現有技術的特征進行組合而得出的任何與本發明相同或相近似的產品,均落在本發明的保護范圍之內。實施例中未注明具體實驗步驟或條件者,按照本領域內的文獻所描述的常規實驗步驟的操作或條件即可進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者,均為可以通過市購獲得的常規試劑產品。人體正常與畸形組樣本均取自山西省呂梁市家屬知曉并同意由干冰運輸至北京首都兒科研究所保存在-80冰箱。實驗儀器:ThermoForma37℃、二氧化碳培養箱(ThermofisherScientific),TCSSP8共聚焦顯微鏡(GermanyLeica),低溫高速冷凍離心機(Eppendorf),超低溫冰箱(ThermoFisherScientific),水平電泳儀(Bio-Rad),垂直電泳槽(Bio-Rad),全濕轉膜儀(Bio-Rad),QuantStudioTM7FlexPCR儀(TermofisherScientific),Nanodrop1000分光光度計(ThermofisherScientific),NanostringPrepStation(NanostringTechnology),NanostringnCounter(NanostringTech.),Veriti96wellthermalcycler(ABI)。特異性標志基因(Pax6,Nestin,Bmp4)采用Nanostring方法定量檢測或是采用mRNA提取法,用RT-qPCR方法定量。RNA提取法:采用Trizol提取法提取細胞或組織總RNA,按加拿大abm逆轉錄試劑盒操作將總RNA逆轉錄成cDNA,然后用qPCR法檢測特異性標志基因的表達,其中使用的ForwardPrimer和ReversePrimer使用常規的引物設計軟件設計而得;qPCR的反應體系為:總反應體系為20μL/反應EvaGreen2×qPCRMasterMix,10ul;ForwardPrimer(10μM),0.6ul;ReversePrimer(10μM),0.6ul;cDNA模板(100ng/μL),2ul;去離子水,6.8ul;反應條件如下:步驟溫度時間循環Enzymeactivation95℃10min1cycleDenaturation95℃15s35cycleAnnealing/Extension60℃60s35cycleMeltingcurve95℃15s1cycle60℃60s1cycle95℃15s1cycle60℃15s1cycle反應結束后,根據溶解曲線分析和瓊脂糖凝膠電泳驗證引物特異性。每對引物的反應均包括一個無模板陰性對照,并且每份模板的每個基因都設置3個重復孔,反應完成后,根據系統軟件自動推算出每個反應擴增的Thresholdcycle(CT值),計算目的基因和管家基因的CT平均值,以2-△△Ct法進行比較,計算出目的基因的相對表達量,至少3次生物學重復,實驗結果以mean±SD表示。rH2AX和H2AK119蛋白的表達水平,由于rH2AX是作為組蛋白DNA雙鏈斷裂的靶蛋白,存在于細胞核里,而H2AK119蛋白作為組蛋白H2A的泛素位點修飾,提取出組蛋白即得到rH2AX和H2AK119蛋白的表達水平,為此,提供了組蛋白的提取方法為:采用EPIGENTEK試劑盒EpiQuikTMTotalHistoneExtractionKit。具體步驟為:以1x107細胞量或100mg組織量為例。將試劑盒內10xpre-lysisbuffer以蒸餾水稀釋成1×pre-lysisbuffer。重懸打碎或勻漿好的細胞置于冰上10分鐘并在每三分鐘輕輕晃動,然后3000rpm、4℃離心5分鐘。如果細胞量和樣本較少可放置于1.5-2mLEP管中在10000rpm、4℃離心1分鐘,棄上清,再用三倍體積的lysisbuffer重懸組織或細胞碎片,冰上孵育30分鐘,12000rpm、4℃離心5分鐘,將上清轉入新的管子中。用DTT溶液和Balancebuffer配置1:500溶液,以300uL體積立即加入到上一步轉入管中的上清,測蛋白濃度。所提取的組蛋白可保存于-80℃。Mdm2可以采用Nanostring方法相對定量檢測Mdm2在mRNA水平的表達,也可以采用RIPA裂解液全蛋白提取法,然后用Bradford法給蛋白定量檢測Mdm2。所述的RIPA裂解液全蛋白提取法,具體步驟為:以1×107細胞量或100mg組織量為例,加入溶解RIPA裂解液,混勻,取出適量細胞裂解液,在使用前2分鐘加入PMSF,使PMSF的最終濃度為1mM;用移液槍將細胞培養基吸取扔掉,加入3ml預冷PBS清洗兩次。以防止酚紅以及培養基中的殘留物質對免疫沉淀,蛋白純化,酶活性分析等實驗的影響。加入500ul裂解液,用槍吹打數下,使裂解液和細胞充分接觸,冰上孵育5分鐘。充分裂解后,4℃離心,14000g,5分鐘,取上清置于新的管中,保存于-80℃備用。所述的用Bradford法給蛋白定量,具體步驟為:將已知濃度的BSA標準品蛋白按照濃度梯度2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0mg/mL稀釋;每個EP管中加入245μL考馬斯亮藍溶液及5μL標準品或樣品;使用酶標儀測每個標準品及樣品在595nm波長處的吸光度;根據標準品的吸光度通過Excel軟件得出標準曲線,最后得到每個樣品的蛋白濃度。蛋白質SDS-PAGE電泳:用蒸餾水清洗玻璃板,晾干后將其放入玻璃夾中,底部對齊卡緊,垂直卡在夾子上準備灌膠;配膠:依據目的蛋白分子量來確定分離膠濃度,按照試劑配方配置8%或者12%的分離膠。灌膠時膠一定要沿一側玻璃板流下,避免產生氣泡。加入7mL分離膠后,緩慢加入蒸餾水封。靜置30min,待分離膠凝固后,將蒸餾水棄去,并用濾紙將殘余水分吸干,將配制好的5%的濃縮膠灌入玻璃板,輕輕插入點樣梳,梳齒底部不可有氣泡。然后在梳子上方再多加一些濃縮膠,靜置30min;上樣:待濃縮膠凝固后,用水沖洗濃縮膠殘渣,將其放入電泳槽中,加入足夠電泳液后,兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出,根據蛋白濃度吸取樣品,一般全蛋白上樣20-30μg,不要吸進氣泡,將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品和5μL蛋白上樣指示劑電泳:電泳選擇恒壓,初始為80V,觀察上樣指示劑越過濃縮膠時,電壓改為110V,當上樣指示劑將要越過分離膠底部時,停止電泳。轉膜:將NC膜浸泡于轉膜緩沖液中平衡5min,將膠剝出,去除濃縮膠,根據膠的大小準備兩張海綿,六張濾紙和一張NC膜,濾紙、膜和膠三者的大小相同,并將其置于轉膜緩沖液中平衡10min,將含有目的蛋白的膠轉移到NC膜上,確保與膜之間沒有氣泡。按照電泳槽中從負極到正極按照海綿+濾紙+凝膠+NC膜+濾紙+海綿“三明治”夾心法放置,再將三者移至轉膜裝置。安裝好濕轉儀,調整電流為恒流250mA,轉膜時間根據目的蛋白大小調整。將整個裝置放置在冰浴中。轉膜完成后,可用麗春紅染色,觀察蛋白條帶,評判轉膜效率,然后用蒸餾水將麗春紅洗凈。免疫反應封閉:將膜移至含5%脫脂牛奶中,室溫搖床上封閉1小時;孵育一抗:將一抗用5%脫脂牛奶稀釋至適當濃度(按照抗體說明書),將膜轉移至含有一抗的孵育盒中,4℃孵育過夜;3)洗膜:室溫,1×TBST洗膜,水平搖床洗3次,每次10min;孵育二抗:根據一抗的種屬來源選擇相應的二抗用5%脫脂牛奶進行稀釋(按抗體說明書),室溫孵育45-60min;5)洗膜:室溫,1×TBST洗膜,水平搖床洗3次,每次10min;6)ECL發光顯色:將A液和B液按照1:1等體積混合,將膜浸泡在發光液中約2min,在全自動曝光儀上進行曝光,用凝膠成像系統對曝光后條帶的灰度值進行分析。在本發明中,當樣品為細胞和小鼠組織時采用的是Westernblot方法檢測Mdm2蛋白表達量的變化,而當樣品為人組織時通過Nanostring技術檢測Mdm2在mRNA的水平來相對定量Mdm2在人神經組織中的表達量。實驗例1胚胎干細胞為小鼠胚胎干細胞Sv/129,來自于北京宣武醫院,凍存于北京首都兒科研究所細胞庫,甲氨蝶呤(MTX)購自Pfizer(Perth)PtyLimited,貯存液濃度為500mg/20mL。所述小鼠胚胎干細胞于37℃、二氧化碳培養箱中在DMEM高糖培養基中培養,培養基配方(小鼠胚胎干細胞(mESC)Sv/129維持在Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM,Gibco,USA)中,培養基中含有0.1mMβ-巰基乙醇(Invitrogen,Carlsbad,USA),0.1mMnon-essentialaminoacid(NEAA)(Invitrogen,Carlsbad)美國),0.1mM谷氨酸(Invitrogen,Carlsbad,USA),15%胎牛血清(Gibco,USA)和1000U/ml小鼠白血病抑制因子(Millipore,Billerica,USA),0.2%明膠(Invitrogen,Carlsbad,USA))。將細胞置于加濕培養箱中,37℃、5%CO2條件下培養,每2-3天傳代一次。培養后,分為實驗組和對照組,實驗組培養基中加入MTX(甲氨蝶呤),使得培養基中MTX濃度為1μm;對照組添加等量生理鹽水;培養12個小時,檢測實驗組和對照組胚胎干細胞的蛋白和特異性標志基因的變化情況。(1)MTX誘導的胚胎干細胞的RNAsequencing使用Trizol試劑(Invitrogen)提取實驗組和對照組胚胎干細胞總RNA。通過Bioanalyzer2200(Aligent)檢查RNA質量并將RNA于-80℃下保存。檢測RNA質量RNAintegritynumberRIN>8.0的RNA可以用于后期RNAsequencing。同樣RNAintegritynumberRIN>8.0的RNA適用于miRNA純化。使用miRNeasyMiniKit(Qiagen)純化miRNA,并通過凝膠電泳驗證純化結果。cDNA文庫構建根據制造商的說明書,使用VAHTSTMTotalRNA-seq(H/M/R)為每個合并的RNA樣品構建cDNA文庫。通常,該方案由以下步驟組成:rRNA耗盡并使用二價陽離子在94℃下片段化為150-200bp,持續8分鐘。將切割的RNA片段逆轉錄成第一鏈cDNA,第二鏈cDNA合成,末端修復片段,A尾并用索引銜接子連接。通過VAHTSTMDNACleanBeads獲得目標條帶。通過PCR純化和富集產物以產生最終的cDNA文庫并通過Agilent2200定量。將標記的cDNA文庫以相等比例合并,并在NovelBioCorp.Laboratory,Shanghai的IlluminaHiSeqXten的單個泳道中用于150bp配對末端測序。使用IonTotalRNA-SeqKitv2.0(LifeTechnologies)根據制造商的說明制備用于單端測序的互補DNA(cDNA)文庫。通過PAGE凝膠電泳對cDNA文庫進行大小選擇以進行miRNA測序。然后根據市售方案處理cDNA文庫用于質子測序過程。將樣品稀釋并混合,將混合物在OneTouch2儀器(LifeTechnologies)上處理并在OneTouch2ES工作站(LifeTechnologies)上富集以根據IonPITM制備模板陽性離子PITM離子SphereTM顆粒(LifeTechnologies)模板OT2200Kitv2.0(LifeTechnologies)。富集后,加載混合的模板陽性離子PITM離子球粒子樣品顆粒到1個P1v2質子芯片上根據來自NovelBioCorp.Laboratory,Shanghai的IonPISequencing200Kitv2.0(LifeTechnologies)進行測序并在質子測序儀上測序。如圖1所示為不同條件下胚胎干細胞的RNAsequencing,圖1(a)表示實驗組和對照組兩組之間的差異倍數,而圖1(b)顯示了實驗組和對照組相比上調有差異的基因是1642個,而下調的是有672個,貼近于45度深色部分為差異不足的取對數后2倍的基因。(2)MTX誘導后小鼠胚胎干細胞后特異性標志基因的變化情況實驗結果如圖2所示,可以看出,MTX誘導后小鼠胚胎干細胞內特異性標志基因Pax6、Nestin和Bmp4相對于正常胚胎干細胞,表達下調。(3)MTX誘導的小鼠胚胎干細胞的蛋白表達變化情況用western方法檢測實驗組和對照組胚胎干細胞蛋白含量的變化,檢測H2AK119蛋白以H2A為內參,檢測Mdm2蛋白以GAPDH為內參,如圖3所示,可以看出,MTX誘導后,H2AK119和Mdm2蛋白表達上調。如圖4所示,為H2AK119CHIPqpcr,可以看出,特異性標志基因與H2AK119的結合明顯加強。圖4中的IgG為negativecontrol。如圖5所示,為Mdm2CHIPqpcr,可以看出,特異性標志基因與Mdm2的結合明顯加強。(4)敲除Mdm2,MTX誘導的胚胎干細胞的蛋白表達情況用westernblot檢測敲除Mdm2后H2AK119的變化,如圖6所示,可以看出MTX誘導前后,以H2A作為內參,蛋白H2AK119變化不明顯,說明蛋白H2AK119的上調依賴于Mdm2。用qPCR方法檢測特異性標志基因的變化情況,如圖7所示,可以看出,敲除Mdm2基因,MTX誘導前后,特異性標志基因的變化不明顯。H2AK119CHIPqPCR,如圖8所示,可以看出,MTX誘導的小鼠胚胎干細胞,敲除mdm2基因,特異性標志基因變化不明顯。在上述附圖6-8中,si-Mdm2表示敲除Mdm2基因;MTX+表示實驗組,CON-表示對照組。NC是negativecontrol,在反應中不會被敲除.因此可以比對Mdm2的敲除效率。(5)MTX誘導的胚胎干細胞的ATM磷酸化的檢測如圖9-10所示,在低葉酸的狀態下DNA發生雙鏈斷裂,Mdm2被招募到DNA受損位點并發生了ATM激酶誘導的磷酸化,ATM激酶的活性與被招募到受損位點的Mdm2一起誘導了H2AK119泛素化發生。圖9表示DNA雙鏈斷裂是倚賴于ATM激酶介導的磷酸化而并非ATR激酶。圖10表示在ATM被抑制后,特異性標志基因沒有下調,因此,特異性標志基因也是通過ATM磷酸化的發生而被抑制的。綜上,MTX誘導的小鼠胚胎干細胞,會導致H2AK119和Mdm2的表達上調,特異性標志基因Nestin、Pax6和Bmp4下調。MTX誘導前后,敲除Mdm2基因,蛋白H2AK119表達水平變化不明顯;特異性標志基因Nestin、Pax6和Bmp4變化不明顯,與蛋白H2AK119結合程度變化不明顯??梢缘贸?,MTX誘導小鼠胚胎干細胞,招募Mdm2到H2AK119位點,發生單泛素化,從而抑制特異性標志基因表達。實驗例21、實驗動物和材料SPF級成年C57BL/6J小鼠,雌雄各半,7~8周齡,體重17~19g。購自北京金牧羊實驗動物養殖責任公司。甲氨蝶呤(MTX)購自Pfizer(Perth)PtyLimited,貯存液濃度為500mg/20mL。2、小鼠模型制備購入的小鼠適應性喂養2天后,隨機分組。分組后的雌鼠與同一批雄鼠按2:1的比例合籠過夜,第二天早晨發現陰道栓被定為孕0.5天。實驗組在懷孕7.5天給予不同劑量的MTX腹腔注射;對照組給予等體積的生理鹽水。懷孕13.5天時,對孕鼠進行摘眼球采血。采血后的小鼠斷頸處死,腹部向上置于手術臺上,75%酒精消毒。沿腹中線剖腹取出妊娠子宮,將子宮成串取下置于盛有PBS的培養皿中,體視顯微鏡下小心取出胚胎,并仔細觀察每窩胚胎,觀察體視顯微鏡下可見的畸形情況,并對胚胎進行拍照。取部分正常胚胎和畸形胚胎固定于體積濃度為10%中性甲醛中,用于做組織切片。取畸形胚胎,測小鼠體內基因和蛋白含量的變化。3、實驗方法和實驗結果(1)MTX誘導后小鼠體內特異性標志基因的變化情況實驗結果如圖12所示,可以看出,神經管畸形小鼠特異性標志基因Pax6、Nestin和Bmp4相對于正常小鼠,全部下調。(2)MTX誘導的神經管畸形小鼠神經組織中蛋白含量的變化實驗結果如圖11所示,可以看出,小鼠腦組織中Mdm2、H2AK119和rH2AX上調,rH2AX的上調說明小鼠神經組織中發生DNA雙鏈斷裂,圖中con表示正常小鼠,NTD表示MTX誘導產生的神經管畸形小鼠;Brain表示腦組織,Spine表示脊髓組織。綜上,可知,神經管畸形小鼠的發生是由于MTX誘導的DNA雙鏈斷裂發生了ATM介導的磷酸化招募Mdm2到DNA受損位點發生了H2AK119單泛素化從而抑制分化基因的表達而致畸;即神經管畸形小鼠的Mdm2、H2AK119水平上調,特異性標志基因Pax6、Nestin和Bmp4下調。實施例1本實施例提供了一種檢測神經管畸形的方法,包括以下步驟:1)提取待測樣本的H2AK119、Mdm2;2)定量分析H2AK119、Mdm2,特異性標志基因Pax6、Nestin、Bmp4的含量;3)與對照樣本比對,若H2AK119、Mdm2水平上調,且特異性標志基因Pax6、Nestin、Bmp4全部下調,則神經管畸形發生。其中待測樣本為神經管畸形患者的腦組織,對照樣本為正常人體的腦組織。上述組織取自山西省呂梁市家屬知曉并同意由干冰運輸至北京首都兒科研究所保存在-80冰箱。H2AK119的提取方法為:采用EPIGENTEK試劑盒EpiQuikTMTotalHistoneExtractionKit。采用Nanostring方法定量檢測Mdm2水平變化情況。特異性標志基因(Cdx2,Gata4,Bmp4)是采用mRNA提取法,采用Nanostring方法定量檢測。結果如圖13所示,為人腦組織中特異性標志基因的變化情況,可以看出,NTDs患者體內特異性標志基因明顯低于正常人體。如圖14所示,為人腦組織中蛋白H2AK119的變化情況,可以看出,NTDs患者體內H2AK119明顯高于正常人體,圖中的NTDs1-NTDs8表示神經管畸形患者的腦組織樣本1-8,圖中的Normal1-Normal8表示正常人體的腦組織樣本1-8。如圖15所示,為人腦組織中Mdm2變化情況,可以看出,NTDs患者體內Mdm2明顯高于正常人體。實施例2本實施例提供了一種檢測神經管畸形的試劑盒以特異性標志基因Pax6、Nestin和Bmp4,蛋白質H2AK119和Mdm2為分子標志物,包括提取H2AK119、Mdm2的試劑,H2AK119、Mdm2的定量分析試劑,和熒光定量PCR反應試劑。實施例3本實施例提供了一種檢測神經管畸形的試劑盒的使用方法(1)提取待測樣品的H2AK119、Mdm2;(2)檢測H2AK119、Mdm2中及特異性標志基因Pax6、Nestin和Bmp4的含量;(3)與對照樣本比對,若H2AK119、Mdm2水平上調,且特異性標志基因Pax6、Nestin和Bmp4全部下調,則神經管畸形發生。顯然,上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例,而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說,在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明創造的保護范圍之中。當前第1頁1 2 3 
再多了解一些
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