甘藍型油菜開花期和成熟期主效QTL位點的分子標記BrSF0239引物及其應用的制作方法

文檔序號:18167228發布日期:2019-07-13 09:42
甘藍型油菜開花期和成熟期主效QTL位點的分子標記BrSF0239引物及其應用的制作方法

本發明屬于分子生物學及遺傳育種技術領域,更具體涉及甘藍型油菜開花期和成熟期主 效QTL位點的分子標記BrSF0239引物及其應用。



背景技術:

油菜是我國第一大油料作物,約占世界油菜產量的20%(Hu et al.,2016)。菜籽油是 國產食用植物油的第一大來源,占國產食用植物油總量的57.2%,在國家食用油供給中占有 十分重要的地位(范成明等,2018)。我國國產植物油對外依存度已超過60%,且有繼續 增加的趨勢(王漢中等,2014)。另外,菜籽油與柴油有較為相近的脂肪酸構成,是一種綠 色可再生能源。

雖然我國是世界上最大的菜籽油生產國,但植物油的供給量還是嚴重不足,每年仍需大 量進口。導致這一現象的主要原因是油菜的經濟效益不高,雖然我國油菜種植總面積位居世 界第一,但人均種植面積很少,加之近年來油菜與糧棉作物茬口矛盾突出,油菜種植面積持 續降低(官春云等2010)。雙季稻與油菜的季節矛盾是南方雙季稻種植區冬季大量田地閑置 的主要原因,解決這個矛盾的根本途徑是油菜的早熟育種。已有的研究表明早熟油菜一般早 花,早花與早熟成正相關(Campbell and Kondra 1978;高永同1979),因此研究油菜開花 期相關QTL對油菜早熟改良,加快油菜早熟育種具有重要意義。

雖然傳統育種方法曾經為生產提供了許多優良油菜品種,但由于育種周期長、選擇效率 低,已經無法完全滿足當前油菜生產的需要。隨著分子生物學和分子遺傳學的發展,育種家 們對性狀的選擇正在逐漸實現由表型選擇向基因型選擇的過渡。分子標記輔助育種是將分子 遺傳學與傳統的表型選擇有效結合的一種新的育種手段,其基本原理是在油菜育種過程中直 接利用與目標性狀基因緊密連鎖和共分離的分子標記對選擇個體進行目標區域以及全基因 組篩選,以達到提高目標性狀選擇效率、縮短育種年限的目的。分子標記輔助選擇育種技術 的關鍵是鑒定與重要農藝性狀緊密連鎖的DNA分子標記。近年來,美國等發達國家都投入 巨資開展這方面的研究工作。伴隨著水稻、玉米、小麥等重要作物農藝性狀分子標記的開發, 利用篩選到的分子標記進行輔助選擇育種已漸趨成熟,目標性狀也從簡單的單基因質量性狀 擴展到復雜的多基因數量性狀。隨著基因組學和測序技術的高速發展,油菜分子標記研究日 漸受到關注,研究的領域涉及種質遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構建、基因標記和定位、品 種純度鑒定、配合力預測、標記輔助選擇等多方面,并取得了重要進展。但與發達國家相比, 我國油菜分子育種研究還有較大差距,主要體現在:不能有效地發掘和利用種質資源中的有 利基因,缺乏有自主知識產權及育種價值的基因和標記等。

隨著分子標記技術的不斷發展,其在作物中的應用越來越廣泛。Grodzicker等(1974) 創立了限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)標記技術。R FLP是第一代分子標記,具有數量豐富、穩定遺傳、專一性、重復性好、共顯性等特點。但 是,該標記對DNA要求量比較大;且操作程序繁瑣、耗時費力、周期長;還需要使用放射 性同位素對探針進行標記,這些因素都局限了RFLP標記的廣泛使用。AFLP標記結合了P CR和RFLP標記技術,在作物遺傳多樣性研究、細胞學研究、品種純度鑒定和抗病等研究 中得到廣泛的應用(宋順華等,2006;袁素霞,2009;王雪,2004)。但AFLP標記也存在 一些缺點:成本較高,過程復雜,技術難度大;標記大多為顯性標記;對DNA質量和限制 性內切酶質量要求較高。SSR標記,也叫微衛星DNA標記(microsatellite DNA),已經被 廣泛應用于作物的基因定位、分子標記輔助選擇、DNA指紋圖譜、品種純度鑒定、種質資 源的保存及利用和遺傳多樣性分析等研究中(陳燁麗,2010;繆體云,2007;荊贊革,201 0;王冬梅,2011)。SSR標記具有數量豐富、多態性高、操作簡單、成本較低等優點,長期 以來被廣泛引用于分子標記輔助選擇。近十年來,隨著測序技術的持續進步,使得基于基因 組序列信息的分子標記開發成為可能,如SNP標記和InDel標記(Hyten et al.,2010)。目 前,全基因組選擇育種芯片還只在水稻中開始嘗試(Yu et al.,2014),油菜等其他作物仍 以分子標記輔助選擇為主。

大多數重要的農藝性狀(如產量、品質、抗性等)均表現數量性狀的遺傳特點,表型連 續分布且易受環境條件的影響,因此基于表型選擇的常規育種方法對復雜數量性狀的選擇效 果不好,致使育種效率低下,育種周期延長。由于分子標記技術和數量遺傳學的發展和結合, 人們已可將復雜的數量性狀分解為單個的數量性狀基因位點(quantitative trait loci,QTL), 然后像研究質量性狀一樣對控制數量性狀的多個基因進行研究。QTL定位就是在遺傳分離 群體的基礎上,借助分子標記和遺傳圖譜,利用QTL作圖軟件對分離群體的數量性狀表型 數據進行分析,從而確定數量性狀基因在染色體上的位置和效應。甘藍型油菜開花期的遺傳 研究結果均表明開花期是由多基因控制且存在主基因效應的數量性狀(Zaman et al.,1995; Lagercrantz et al.,1996;Osborn et al.,1997;蔡長春等,2007)目前對油菜開花期和成熟 期的QTL定位研究也有一些報道,但通常檢測出的QTL效應值較小且重復性不好,較難在 油菜育種中應用。Raman等(2013)利用兩個春油菜品種Skipton和Ag-Spectrum為親本的 DH群體,研究表明開花期是一個復雜的性狀,調控開花期QTL分布在10條不同染色體上, 由至少20個QTL位點參與調控,單個表型變異率為2.4%-28.6%;比較QTL位置和已測序 白菜基因組注釋的開花相關基因的物理位置,結果顯示位于A02、A03、A07和C06上的開 花期相關QTL可能代表擬南芥中已知與開花期相關基因的同源基因。Wei等(2014)進行 開花期QTL定位,檢測到17個與開花期相關QTL;同時在A02連鎖群上發現兩個與開花 期相關QTL,單個QTL的表型變異貢獻率3.29%-5.17%。本研究通過QTL定位,旨在篩選 到油菜早花早熟相關QTL位點,用于油菜早花早熟性狀的標記輔助選擇。



技術實現要素:

本發明目的是在于提供了甘藍型油菜開花期和成熟期主效QTL位點的分子標記BrSF02 39引物,所述的引物為:TGTGTGGAACAGTGTTTGGAA和TCTCTGGCTCTCTT TCGCTC。

本發明的另一個目的在于提供了甘藍型油菜開花期和成熟期主效QTL位點的分子標記B rSF0239引物的應用,所述的QTL位點的效應值和貢獻率都較高,對油菜開花期的調控起 著關鍵作用,該引物可用作圖位克隆、油菜高產育種、分子標記輔助選擇。

為了實現上述目的,本發明采用以下技術措施:

油菜開花期性狀的QTL位點的獲得,它包括如下步驟:

(1)利用在開花期上有極顯著差異的油菜品種中雙11號和73290雜交,雜種F1代自交 產生F2群體及其F2:3家系。

(2)采用CTAB法(Doyle et al.1987)提取親本中雙11和73290及F2分離群體的葉 片總DNA。

(3)合成油菜公開(http://www.ukcrop.net/Brassica DB)和自主開發的SSR和InDel引 物,并對親本DNA進行PCR擴增,產物在變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,染色和顯影后對 條帶的大小進行判別,篩選多態性引物。

(4)利用多態性引物對F2分離群體進行分子標記分析,獲得基因型數據。

(5)把F2分離群體的基因型數據輸入Joinmap4.0軟件(商業途徑獲得),進行遺傳連 鎖圖譜的構建;

(6)F2群體的基因型數據(僅限于定位到遺傳圖譜上的標記)以及F2群體及其F2:3 家系的開花期和成熟期性狀數據輸入WinQTLcart2.5軟件進行QTL定位。其中,位于A2 連鎖群上的QTL在三個群體中能重復檢測到,而且效應值和貢獻率較大。

利用上述技術措施,申請人最終獲得了一個同時控制甘藍型油菜開花期和成熟期多效性 主效QTL位點,與申請人自主開發的SSR標記BoSF0239緊密連鎖,針對BoSF0239F設計 其引物序列為5’-TGTGTGGAACAGTGTTTGGAA-3’;BoSF0239R:5’-TCTCTGG CTCTCTTTCGCTC-3’。利用WinQTLCart2.5軟件分析測得其對油菜開花期的貢獻率為17. 2%,加性效應為2.1,顯性效應為0.9;對油菜成熟期的貢獻率為9.4%,加性效應為0.6, 顯性效應為0.4。

甘藍型油菜開花期和成熟期主效QTL位點的分子標記BrSF0239引物的應用,包括利 用本發明提供的引物,利用該引物可用于甘藍型油菜的育種,包括篩選早花早熟單株,用于 甘藍型油菜的圖位克隆或是用于甘藍型油菜分子標記輔助選擇。

與現有技術相比,本具有以下優點:

本發明定位了油菜品種中雙11號控制開花期的重要QTL位點,該標記與離主效基因位 點的遺傳距離很近(<2cM)且是基于基因組序列信息的共顯性SSR標記,因而可靠且使用 方便,這給今后中雙11號衍生品系的選育提供了極大的便利??煞謩e解釋17.2%和9.4%的 表型方差。在常規育種方法中,開花期和成熟期性狀表型鑒定要等到成熟考種,費時費力且 選擇效率低下(開花期和成熟期表型受環境影響較大)。通過檢測開花期和成熟期性狀主效 基因位點,可以在苗期進行淘汰,不僅節約生產成本而且大大提高選擇效率。本發明中主效 基因位點位置明確,主效基因位點的檢測方法方便快速,不受環境影響。利用該標記對兩親 本衍生的后代群體進行檢測,證明其效應,檢測方法方便快速,不受環境影響。通過檢測與 開花期成熟期性狀相關的分子標記,即可預測開花期和成熟期的長短,進而準確快速篩選早 花早熟品種。

附圖說明

圖1為F2:3家系在不同環境種植時開花期的頻率分布圖;

結果表明開花期表型呈正態分布,且變異范圍很寬,證明開花期屬于數量性狀。

圖2為F2:3家系在不同環境種植時成熟期的頻率分布圖;

結果表明成熟期表型呈正態分布,且變異范圍很寬,證明成熟期屬于數量性狀。

具體實施方式

本發明所述技術方案,如未特別說明,均為本領域的常規方案,所述試劑或材料,如未 特別說明,均來源于商業渠道。

實施例1:

油菜開花期分離群體的構建及性狀測定:

本實施例中使用油菜測序品種中雙11和另一個遺傳差異大的油菜品種73290雜交,雜種F 1代自交產生F2群體及其F2:3。其中,中國農科院油料所陽邏綜合試驗基地,于2009年種植F 2群體,2010,2011和2012年種植F2:3家系群體。兩親本和分離群體的開花期和成熟期表型 在成熟期收獲后經考種鑒定??挤N數據表明:開花期和成熟期在3個環境下的均值均呈正態 分布,表明開花期和成熟期性狀的數量遺傳特征(圖1、圖2)。

實施例2:

引物的開發和合成:

申請人利用的SSR引物包括兩類:一類是已發表文章和蕓苔屬數據庫中公開引物序列 (http://www.brassica.info/resource/markers/ssr-exchange.php);另一類是申請人根據白菜和甘 藍scaffold序列開發的,分別命名為BrSF和BoSF系列,具體的開發方法是先利用SSR Hu nter軟件在每個scaffold搜索SSR,然后用Primer3.0軟件設計SSR引物。自主開發的InDe l引物則是通過比對73290的重測序序列和中雙11的參考基因組序列而來,首先,利用BW A軟件把73290的重測序序列定位到中雙11的全基因組參考序列上,然后利用samtools軟 件查找InDel。

實施例3:

引物多態性的篩選,其流程如下:

(1)從親本中各隨機選擇10株DNA等量混合,作為篩選引物的模板。

(2)利用溶解后的引物對親本DNA進行PCR擴增,

反應體系:

PCR反應程序:

(3)凝膠電泳帶型判讀

實施例4:

F2群體基因型分析、遺傳連鎖圖譜構建和QTL定位,其步驟如下:

(1)采用CTAB法提取F2群體179個單株的DNA;

(2)挑選出多態性引物對F2群體179個單株的DNA進行PCR擴增,然后對PCR產物 進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、顯影、染色和帶型判讀。本發明涉及到的分子標記為共顯性標記, 即差異條帶表現為位置上(既擴增產物大小)的變異,分離群體的帶型依情況分別讀作A、 B和H,分別表示來源于中雙11號、73290和雜合帶型。

(3)通過對染色后獲得的分子標記帶型進行判讀,獲得分子標記基因型數據。

(4)利用Joinmap4.0軟件對F2群體的分子標記基因型數據進行連鎖分析以構建分子標 記遺傳連鎖圖譜,獲得19個連鎖群(含805個分子標記),恰好對應甘藍型油菜的19條染 色體。

(5)基于該遺傳圖譜、F2群體的基因型數據,以及F2群體及其F2:3家系的開花期和 成熟期性狀數據,利用QTLCart2.5軟件進行QTL檢測,在A2染色體SSR標記BoSF0239 附近(表1)檢測到了兩個重復性很好的主效QTL位點,其LOD值和貢獻率都較大(表2), 其中一個對油菜開花期的貢獻率為17.2%,加性效應為2.1,顯性效應為0.9;另一個位點對 油菜成熟期的貢獻率為9.4%,加性效應為0.6,顯性效應為0.4。

針對BoSF0239分子標記設計的引物為表1所示,利用該引物,在中雙11號中擴增得到 一個條帶,大小為148bp,在本發明中記為A;在73290中擴增得到的一個條帶,大小為1 52bp,在本發明中記為B;在雜合子中擴增得到的兩個條帶,大小為148bp和152bp。

表1 A2連鎖群開花期和成熟期主效QTL連鎖標記BoSF0239的引物序列

表2 A2連鎖群開花期和成熟期主效QTL的基本信息

實施例5:

開花期和成熟期主效QTL連鎖標記BoSF0239的有效性驗證,其步驟是:

(1)田間種植中選F2單株的F3代種子,在多年多點進行種植。

(2)在定苗后對F3單株掛牌取樣,并提取葉片總DNA,利用分子標記BoSF0239對其進 行開花期主效QTL基因型的分析。

(3)對F3單株開花期和成熟期進行記錄。結果表明,分子標記輔助選擇挑選出來的732 90背景單株其開花期均值(171.6天)短于中雙11號背景單株均值(177.1天),且73290背 景單株其開花期短于中雙11號背景群體均值的單株占群體的比率為91.7%(表3);同時7 3290背景單株其成熟期均值(232.9天)短于中雙11號背景單株均值(233.4天),且73290 背景單株其成熟期短于中雙11號背景群體均值的單株占群體的比率為61.5%(表4)??梢?在苗期進行淘汰,不僅節約生產成本而且大大提高選擇效率,進而可以快速篩選出早花早熟 株系用于油菜育種。

表3利用SSR標記BoSF0239輔助選擇得到的F3單株的開花期調查數據

注:A、B分別代表來源于親本中雙11和73290的分子標記帶型

表4利用SSR標記BoSF0239輔助選擇得到的F3單株的成熟期調查數據

注:A、B分別代表來源于親本中雙11和73290的分子標記帶型。

序列表

<110> 中國農業科學院油料作物研究所

<120> 甘藍型油菜開花期和成熟期主效QTL位點的分子標記BrSF0239引物及其應用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtgtggaac agtgtttgga a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctctggctc tctttcgctc 20

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