一種基于STR計算混合樣本嵌合比例的方法以及系統與流程

文檔序號:18145643發布日期:2019-07-10 11:47

本發明涉及一種基于短串聯重復計算混合樣本嵌合比例的方法及系統。



背景技術:

在利用二代測序技術(NGS)進行胎兒染色體異常的檢測案例中,胎兒樣本中混有母源的樣本時有發生,特別是流產組織樣本極易受到母源的污染。這種情況下,信息分析人員很難判定個該樣本的真實情況是染色體嵌合還是有母源污染,且樣本濃度比例較復雜等問題,使檢驗結果的分析常存在不確定性。因此迫切需要一種能夠鑒別污染、計算嵌合比例的系統以及方法來作為輔助手段,以協助NGS做出正確的判斷。

此外,在對流產組織進行檢測時往往需要判斷該流產組織是否混有母源污染,如果判斷該流產組織混有母源污染則會影響對流產組織的結果評估的可靠性。

STR(短串聯重復(short tandem repeats))作為一種成熟的一代測序技術在親子鑒定領域得到廣泛應用,STR片段分析的基本原理是同一個體的STR基因型一半來自父親,一半來自母親。即在每一處STR,子代的一個等位基因型遺傳自父親,另一個等位基因型遺傳自母親。除同卵雙生外,每個人或生物包含的DNA序列是不同的,獨一無二的?;赟TR的檢測原理是利用熒光標記的引物在PCR擴增STR基因座時,使PCR產物的一條鏈帶上熒光標記。這種帶有熒光分子的DNA片段在凝膠中從陰極端的激光掃描儀的掃描窗口,熒光染料受到激發,發出一定波長的光,按熒光強度記錄下來,每一個帶熒光染料的DNA片段電泳軌跡按各自通過激光掃描窗口的實際時間記錄下來,以熒光吸收峰來表示每一個片段。峰值越高,表示該片段量越多;峰越早出現,片段越小。因此可以利用該原理根據不同大小片段的峰值高低和不同位點峰數量來判定樣本是否為混合樣本。

同時,可以利用AMELOGENIN基因的峰值高低或峰面積比值確定樣本混合或嵌合比例。

參考文獻

非專利文獻

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鄭秀芬,紀貴金,劉超等,二組分混合DNA樣本STR圖譜解釋,中國法醫學雜志,2000,15,4,:203-207



技術實現要素:

混合樣本嵌合比例計算問題在NGS以及在判斷流產組織是否受到母源污染的過程中是經常出現的問題,由于技術偏好性問題不僅耗時長,而且很難分辨出樣本的真實來源與所占比例。

利用本發明的基于AMELOGENIN基因的分析系統可以簡便快速的得到樣本的混合情況。利用本發明可以解決以下問題:確定混合樣本中的各組分的大體比例;根據標準品等位基因的峰面積比來制作標準曲線,然后擬合出回歸方程,將待測樣本等位基因的峰面積比代入該回歸方程,即可得到組分的比例。

如上所述,本發明涉及如下內容:

1.一種基于短串聯重復計算混合樣本嵌合比例的方法,其包括:

基于短串聯重復來判斷待測樣品是否存在樣本嵌合;以及

在判斷存在樣本嵌合后,基于AMELOGENIN基因來計算待測樣品的嵌合比例。

2.根據項1所述的方法,其中,基于短串聯重復來判斷待測樣品是否存在樣本嵌合的步驟包括:

利用用于擴增所述短串聯重復的帶熒光的引物進行所述待測樣品的PCR擴增,基于PCR擴增的結果來判斷是否存在嵌合。

3.根據項1或2所述的方法,其中,基于短串聯重復來計算待測樣品的嵌合比例的步驟包括:

利用用于擴增所述AMELOGENIN基因的帶熒光的引物進行所述待測樣品的PCR擴增,從而獲取針對所述待測樣品的給定數據來計算所述待測樣品的嵌合比例。

4.根據項2或3所述的方法,其中,基于PCR擴增的結果來判斷是否存在嵌合具體為:若同一基因座出現等位基因的數目為3個以上,則待測樣品是兩個以上個體的混合樣本。

5.根據項2或3所述的方法,其中,基于PCR擴增的結果來判斷是否存在嵌合包括:

若同一基因座出現等位基因的數目為3、4,則待測樣品是2個個體的混合樣品;

若同一基因座出現等位基因的數目為5、6,則待測樣品是3個個體的混合樣品;

若同一基因座出現等位基因的數目大于6,則待測樣品是3個或3個以上個體的混合樣品。

通常一個樣本同一基因座出現等位基因的數目為1或2。

6.根據項3或4所述的方法,其中,所述給定數據為來自所述待測樣品的通過PCR擴增得到的條帶并通過毛細管電泳熒光定量法獲得的電泳條帶的峰面積之比。

7.根據項1~6中任一項所述的方法,其還包括:

DNA提取及濃度控制,從待測樣品獲得來自待測樣品的DNA,控制使提取的DNA的濃度在2ng/μL以上。

8.根據項1~7中任一項所述的方法,其中,

所述短串聯重復序列位點選自以下任意三個或三個以上:D21S11,D13S317,D8S1179,D18S51,D5S818,VWA,PENTA E,D7S820,TPOX,D3S1358,D16S539,FGA,TH01,CSFIPO和penta d。

9.根據項1~7中任一項所述的方法,其還包括:制作標準曲線,制作一系列按照給定混合比例混合的標準品混合樣品,利用用于擴增AMELOGENIN基因的帶熒光的引物進行標準品混合樣品的PCR擴增,并獲取針對制備的標準品混合樣品的給定數據來制作標準曲線;

計算結果,利用標準曲線以及所述待測樣品的給定數據來計算所述待測樣品的嵌合比例。

10.根據項8所述的方法,其中,所述標準品混合樣品是利用來自男性和女性的基因組DNA樣品按照給定的比例進行混合來制作的。

11.一種計算混合樣本嵌合比例的系統,其包括:

基于短串聯重復來判斷待測樣品是否存在樣本嵌合的模塊,以及

基于AMELOGENIN基因來計算待測樣品的嵌合比例的模塊。

12.根據項11所述的系統,其中,基于AMELOGENIN基因來計算待測樣品的嵌合比例的模塊包括:利用用于擴增該AMELOGENIN基因的帶熒光的引物進行所述待測樣品的PCR擴增,從而獲取針對所述待測樣品的給定數據來計算所述待測樣品的嵌合比例。

13.根據項12所述的系統,其中,所述給定數據為來自所述待測樣品的通過PCR擴增得到的條帶并通過毛細管電泳熒光定量法獲得的電泳條帶的峰面積之比。

14.根據項11~13中任一項所述的系統,其還包括:

DNA提取及濃度控制模塊,從待測樣品獲得來自待測樣品的DNA,控制使提取的DNA的濃度在2ng/μL以上。

15.根據項11~14中任一項所述的系統,其還包括:

標準曲線制作模塊,制作一系列按照給定混合比例混合的標準品混合樣品,利用用于擴增該AMELOGENIN基因的帶熒光的引物進行標準品混合樣品的PCR擴增,并獲取針對準備的標準品混合樣品的給定數據來制作標準曲線;

結果計算模塊,利用標準曲線以及所述待測樣品的給定數據來計算所述待測樣品的嵌合比例。

16.根據項15所述的系統,其中,所述標準品混合樣品是利用來自男性和女性的基因組DNA樣品按照給定的比例進行混合來制作的。

發明的效果

利用STR計算嵌合比例的方法和系統有以下幾點好處:該方法和系統耗時短,在24h內可以出具嵌合比例的結果。該技術通過測定等位基因的對應的峰面積,發現峰面積比與混合樣本組分比例有密切的關系,不同比例混合的樣本會出現峰面積的不平衡,計算混合樣本等位基因峰面積比值,發現峰面積的比值近似樣本混合比例,因此可以由峰面積比推測樣本的混合比例。

具體實施方式

本發明的實驗步驟如下。

第一步:從待測樣品獲得來自待測樣品的DNA。

第二步:控制提取的DNA的濃度,使得提取的DNA的濃度在2ng/μL以上。

第三步:標準品混合樣本的制作步驟。

第四步:PCR擴增步驟。

第五步:結果計算步驟。

在第一步DNA的提取步驟中,對于待測樣品提取DNA的方法沒有特別的限定,可以采用任何本領域技術人員已知的DNA提取方法,根據裂解方式的不同,可以分成機械法、物理法、以及化學法。機械法例如有勻漿法、搗碎法、研磨法;物理法例如有超聲法、反復凍融法、冷熱交替法、低滲裂法;化學法例如有利用有機溶劑的方法、利用去垢劑的方法以及利用酶解的方法。根據核酸分離純化的方式的不同可以分為吸附材料結合法、濃鹽法、有機溶劑抽提法、以及密度梯度離心法。

在本發明的一個具體實施方式中,待測樣品例如為羊水或流產組織。

在本發明一個具體實施方式中采用了如下方法,其中裂解采用了酶解的方法,而分離利用了吸附材料進行分離。當然本領域技術人員可以根據自己的需要采用其他合適的DNA提取方法。

在第二步中,可以首先采用檢測DNA濃度的手段來檢測提取的DNA的濃度,如果檢測結果顯示已經滿足在2ng/μL以上,則可以直接用于后續步驟,如果不滿足上述條件則需要對該樣品進行處理以滿足上述濃度要求。例如如果樣品的濃度過高則可以對其進行稀釋,如果樣品的濃度過低則需要對樣品進行濃縮。

在第三步中,將來自于混合樣本組分的標準DNA樣品(標準品)進行混合。將兩種不同來源的標準品(例如,來源于男性或女性的基因組DNA)進行混合時可以根據需要檢測的范圍來進行混合,通常例如按照1:1,2:1,4:1,6:1,8:1,10:1來進行混合。

在第四步中,對在第三步中按照不同比例混合的標準品DNA和第一步提取的DNA分別進行帶熒光標記的引物的PCR擴增。對于PCR的擴增通??梢愿鶕龜U增的目標基因(即短串聯重復)來設定擴增程序進行擴增。

在本發明的一個具體的實施方式中,用于計算嵌合比例的目標基因為AMELOGENIN,即牙釉蛋白基因,其X染色體Amelogenin基因(牙釉質蛋白基因)內含子l區中6bp缺失的特性設計引物,擴增X染色體特異性片段(AMELX)長度為106bp,與其同源的Y染色體特異性片段(AMELY)為112bp。

在第五步中,利用第四步PCR的結果,利用不同濃度下標準品的比例關系制作標準曲線,擬合回歸方程,再將待測樣本能區分出污染情況的峰面積比帶入該回歸方程進行計算,可以得到待測樣本的混合比例。

利用本發明的方法,制備不同混合比例的混合樣本進行DNA分型檢驗,通過對結果的分析,精確計算混合樣本各組分含量。

利用正常男性和女性樣本的性染色體上AMELOGENIN基因座的同源性,單一男性樣本該基因座的等位基因峰面積比約為1,而女性和男性DNA按照1:1混合后的檢測到比例約為2:1,按照2:1混合后的檢測到比例約為3:1,按照4:1混合后的檢測到比例約為5:1,按照6:1混合后的檢測到比例約為7:1,按照8:1混合后的檢測到比例約為9:1,按照10:1混合后很難檢測到女性特征片段,因此擬合5個比例的標準曲線并得到回歸方程,將待測樣本特征峰面積比帶入方程計算,可以得出混合樣本組分比為顯然更接近于樣本中混合組分的真實比例。

實施例

第一步:DNA的提取

提取試劑盒:血液/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)

按照該試劑盒的說明書,使用前請先在該試劑盒的緩沖液GD和漂洗液PW中加入無水乙醇。

a.將羊水轉移到1.5ml離心管,12000rpm離心2分鐘,用200μL GA將沉淀重懸混勻,進行下一步;實驗具體步驟如下:

b.加入20μL Proteinase K溶液,混勻;

c.加入200μL緩沖液GB,充分顛倒混勻,70℃放置10min,溶液應變清亮,簡短離心以除去管蓋內壁的水珠(一般加入緩沖液GB會產生白色沉淀,70℃放置時會消失);

d.加入200μL無水乙醇,充分震蕩混勻15sec,此時可能出現絮狀沉淀,簡短離心以除去管蓋內壁的水珠;

e.將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入到一個吸附柱CB3中,12000rpm(13400xg)離心30sec,倒掉廢液,將吸附柱CB3放回收集管中;

f.向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前先檢查是否加入無水乙醇),12000rpm(13400xg)離心30sec,倒掉廢液,將吸附柱CB3放回收集管中;

g.向吸附柱CB3中加入600μL緩沖液PW(使用前先檢查是否加入無水乙醇),12000rpm(13400xg)離心30sec,倒掉廢液,將吸附柱CB3放回收集管中;

h.重復操作步驟g;

i.將吸附柱CB3放回收集管中,12000rpm(13400×g)離心2min,倒掉廢液,將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液;

j.將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位懸空滴加50μL洗脫緩沖液TE(可根據實際需求選擇EB或者水),室溫放置2-5min,12000rpm(13400×g)離心2min,將溶液收集到離心管中;

k.將離心管中收集的溶液再次懸空滴加到吸附膜的中間部位,室溫放置2-5min,12000rpm(13400×g)離心2min,將溶液收集到離心管中,置于-20℃保存。

第二步:控制提取的DNA的濃度

使用Qubit 2.0BR定量提取組織的DNA濃度,檢測結果顯示濃度為12.9ng/μL,在進行PCR之前,將樣品稀釋至2ng/μL。

第三步:標準品混合樣本的制備

將兩組標準品DNA,即購買自Promega的2800M和K562分別用Qubit3.0HS定量,然后稀釋至2ng/μL,按照兩組標準品的混合比例為1:1,2:1,4:1,6:1,8:1,10:1來進行混合,然后用于下一步的PCR擴增步驟。

第四步:PCR擴增

采用16HS System試劑盒(購自promega)對STR基因座和Amelogenin基因進行PCR的擴增,擴增程序采用試劑盒提供的擴增程序。其中PCR的混合物為使用5μL的HS 5X Master Mix,2.5μL的PowerPlexR 16HS10X Primer Pair Mix(均為帶熒光標記的引物),以及1μL的DNA樣品,該DNA樣品分別是上述標準品的混合樣品以及從待測樣品中提取的DNA,以及超純水16.5μL。對STR基因座和Amelogenin基因的擴增可以同步完成也可以分步完成。

PCR的程序為:在96℃,2分鐘,ramp設置為4(表示降溫速度4℃/s),然后進行10個以下的循環:94℃,30秒鐘,ramp設置為4,60℃,30秒鐘,ramp設置為0.6(表示降溫速度0.6℃/s),72℃,45秒鐘,ramp設置為0.3(表示降溫速度0.3℃/s),然后進行22個以下的循環:90℃,30秒鐘,ramp設置為4(表示降溫速度4℃/s),60℃,30秒鐘,ramp設置為0.6(表示降溫速度0.6℃/s),72℃,45秒鐘,ramp設置為0.3(表示降溫速度0.3℃/s),然后保持在60℃,20分鐘,ramp設置為4(表示降溫速度4℃/s),最后保持在4℃。

PCR產物避光-20攝氏度保存,外送檢測時要保持4℃。

第五步:計算步驟

利用不同濃度下K562基因組DNA和2800M基因組DNA混合樣本標準品X\Y染色體的比例關系制作標準曲線,擬合回歸方程,再將待測樣本能區分出污染情況的峰面積比帶入方程計算,可以得到待測樣本的混合比例。

表2給出了標準品在PCR擴增中檢測到的峰面積比,該峰面積比是通過對在PCR擴增中得到的條帶進行毛細管電泳熒光定量,然后使用GeneMarker軟件分析電泳條帶的峰面積,并分析吸收峰的峰面積之比而求算出的。根據表2中給出的數據可以將濃度比與峰面積比進行擬合,獲得混合比例與峰面積比的標準曲線。

表2 K562和2800M混合樣本組分比與峰面積比

表3待測混合樣本組分比與峰面積比

根據表2的數據擬合標準曲線,并得到回歸方程y=1.082x-1.038(R2=0.996),其中,y表示峰面積比,x表示混合比例。將待測樣本該基因座的峰面積比2.175582帶入方程計算,可以得出混合樣本組分比為1.30994,結果為56.7%,與NGS檢出比例較為相近。

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