基于高通量測序法篩查和診斷卵巢高級別漿液性癌的方法和裝置與流程

文檔序號:18145652發布日期:2019-07-10 11:47
本發明涉及醫學和生物學領域。具體而言,本發明涉及醫學檢測。更具體而言,本發明涉及通過基因組檢測進行卵巢高級別漿液性癌的診斷、篩查和風險分級。
背景技術
:卵巢癌是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤。由于卵巢癌發病隱匿、無特異性、并且進展迅速,70%的卵巢癌患者發現時已為中晚期,總體5年生存率僅約30%。高級別漿液性癌(HGSC)是最常見的卵巢癌類型,占上皮性卵巢癌的70%~80%,大多數高級別漿液性癌被診斷為晚期(III期或IV期),總體預后較差。因此,提高卵巢高級別漿液性癌的早期發現、早期診斷水平可以提高患癌患者治療機會、生存期及生活質量。卵巢高級別漿液性癌的篩查主要是在高危人群中進行?;悸殉舶┑母呶H巳喊ㄒ韵虑樾危?1)高齡,如年齡大于50歲;(2)有一位或多位血親患卵巢癌;(3)體內存在BRCA1或BRCA2基因突變;(4)患有林奇綜合征或存在林奇綜合征相關基因突變;(5)未孕婦女等。目前篩查和診斷卵巢高級別漿液性癌的主要手段包括檢測腫瘤標記物CA125及經陰道B超。CA125被廣泛地應用于卵巢癌的診斷,但約有30%的卵巢癌患者在診斷卵巢癌時CA125并無異常。另一方面,在婦女妊娠期、腹腔炎癥、子宮內膜異位癥等良性腫瘤情況下,CA125可輕微或明顯增高。因此可見,CA125對于卵巢癌患者篩查并不是一個良好的指標。而經陰道B超,由于操作涉及患者的隱私及侵入性,普通人群的依從性較差,且B超檢查依賴有經驗的醫生,具有一定的主觀性,不適合作為臨床常用的篩查方式。其它檢查方式如盆腹部CT、PET-CT,均具有X射線的輻射,更不適用于普通人群的卵巢癌的篩查。ctDNA(循環腫瘤DNA,circulatingtumorDNA)是一種游離在血漿中的小片段DNA,由凋亡或壞死的腫瘤細胞中的基因組入血產生,因此攜帶有原發瘤或轉移瘤特定的基因特征。ctDNA獲取方便且較為穩定。染色體不平衡是惡性腫瘤的特征之一,是指相對于常見的二倍體基因組發生的基因組結構變異,包括染色體數量的改變,如多倍體或單倍體;也包括染色體局部的改變,如拷貝數增加或拷貝數缺失等。染色體的不平衡可通過基因劑量效應直接改變基因的表達水平,或調控其他基因的表達,因此,染色體的不平衡在腫瘤的發生發展有著重要的意義。通過研究ctDNA來反映染色體的平衡態可能對與腫瘤的定性具有一定的意義。NGS(下一代測序技術)可一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定,同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能,所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。本領域對于卵巢高級別漿液性癌的篩查和診斷的方法存在迫切需求。然而,據了解,迄今為止,尚無通過NGS來對卵巢癌進行快速診斷、尤其是早期診斷的有效方法。本發明人首次發現一種基于NGS方法通過研究ctDNA的重組后的染色體不平衡態,從而進行卵巢高級別漿液性癌的篩查、診斷和風險分級。技術實現要素:本文提供了用于進行卵巢高級別漿液性癌的篩查、診斷和風險分級的系統和方法。特別地,本文提供了用于通過高通量測序進行卵巢高級別漿液性癌的篩查、診斷和風險分級的系統和方法。本發明利用高通量測序技術,從分子生物學層面上解決早期卵巢高級別漿液性癌癥狀隱匿、難以發現;卵巢包塊性質待定;及腫瘤標記物陰性伴盆腔包塊惡性可能的臨床問題。本發明的方法和系統通過一次檢測即能夠發現可能的卵巢高級別漿液性癌。具體而言,本發明涉及以下方面,各方面之間的各技術方案可以根據需要進行組合。在本發明的第一個方面,涉及用于對卵巢高級別漿液性癌進行篩查、診斷或風險分級的一組染色體,該組染色體包含第2、3、5、7、8號染色體中的至少1、2、3、4或5個。在一個優選實施方案中,該組染色體包含第3、5和8號染色體。在一個具體實施方案中,該組染色體為第3、5、8號染色體的組合。在另一個具體實施方案中,該組染色體為第2、3、5、7、8號染色體的組合。在一個進一步的具體實施方案中,該組染色體為分離的。在一個具體實施方案中,所述診斷為早期診斷。在一個更具體的實施方案中,所述診斷為早期診斷,并且卵巢包塊待定。在進一步的具體實施方案中,所述診斷為體外診斷。在本發明的第二個方面,涉及一種計算機可讀介質,其上存儲有指令,其中當所述指令被處理器執行時,使得計算機執行以下操作:判斷來自受試者(例如人)的樣品的第2、3、5、7、8號染色體中至少1條是否存在染色體不平衡(例如染色體長臂拷貝數與短臂拷貝數的差異是否高于或等于閾值,再如染色體長臂覆蓋度與短臂覆蓋度的差異是否高于或等于閾值);例如,將來自受試者的樣品的第2、3、5、7、8號染色體中至少1條的染色體結構信息(例如測定染色體不平衡、染色體長臂拷貝數與短臂拷貝數的差異或染色體長臂覆蓋度與短臂覆蓋度的差異所需的結構信息)與來自健康個體的相應染色體的染色體結構信息進行比較,以確定來自所述個體的樣品中上述染色體是否存在染色體不平衡。在一個具體實施方案中,在染色體不平衡(例如染色體長臂拷貝數與短臂拷貝數的差異高于或等于閾值,再如染色體長臂覆蓋度與短臂覆蓋度的差異高于或等于閾值)的情況下,判斷為受試者患有卵巢高級別漿液性癌或者存在患卵巢高級別漿液性癌的風險)在一個具體實施方案中,所述受試者為哺乳動物,優選人。在進一步的具體實施方案中,所述受試者中存在腫瘤標記物CA125增高。在另一個進一步的具體實施方案中,其中所述受試者中不存在腫瘤標記物CA125增高。在一個具體實施方案中,通過以下方式進行判斷染色體不平衡:將受試者(例如人)的全基因組數據序列(例如高通量測序技術獲得的全基因組數據序列)比對到參考基因組(例如人類參考基因組Hg19),并例如按照10~1000k/bin(優選200k/bin),平均分成多個段(例如bin);分別計算第i號染色體長臂覆蓋到的段(例如bin)的讀出序列(reads)的平均數(covChrip)和染色體短臂覆蓋到的段(例如bin)的讀出序列(reads)的平均數(covChriq);根據下列公式,計算R值:或其中p代表長臂,q代表短臂,chr為染色體(chromosome)的縮寫,i選自2、3、5、7和8。在進一步的具體實施方案中,基于R值,根據公式(2)計算第i號染色體的Z-score:其中μRChri是健康人群所對應的R值的平均數,σRChri是健康人群所對應的R值的標準偏差;任選地,選擇Z-score的絕對值大于等于3的染色體,根據公式(3),求CScore值:在進一步的具體實施方案中,其中所述樣品來自受試者的外周血,優選外周靜脈血。更具體地,所述樣品為外周靜脈血血漿中的游離DNA,。在進一步的具體實施方案中,當滿足以下條件之一時,將認為受試者存在染色體不平衡:-某一條染色體的Z-score絕對值≥3;或-CScore>0;當滿足以下條件之一時,將認為受試者不存在染色體不平衡:-所有染色體的Z-score絕對值<3;或-CScore=0。在進一步的具體實施方案中,在任何染色體的Z-score的絕對值大于等于3和/或CScore≥0的情況下,判斷為受試者患有卵巢高級別漿液性癌或者存在患卵巢高級別漿液性癌的風險。本發明的第三方面涉及一種計算設備,其包含:本發明的計算機可讀介質;和處理器。本發明的第四方面涉及一種系統,其包含:測序裝置,其用于接收來自試驗樣品的核酸以提供來自該樣品的核酸序列信息(例如,通過高通量測序技術獲得的全基因組數據序列);以及本發明的計算設備。在一個具體實施方案中,所述測序裝置為高通量測序儀,優選包括IlluminaMiSeq、NextSeq、HiSeq、X10、NovaSeq。在進一步的具體實施方案中,所述高通量測序技術為下一代測序技術。本發明的第五方面涉及檢測第2、3、5、7、8號染色體中的至少1條的染色體不平衡(優選染色體長臂拷貝數與短臂拷貝數的差異,更優選染色體長臂覆蓋度與短臂覆蓋度的差異)的試劑在制備對卵巢高級別漿液性癌進行篩查、診斷或風險分級的診斷劑中的用途。本發明的第六方面涉及檢測第2、3、5、7、8號染色體中的至少1條的染色體不平衡(優選染色體長臂拷貝數與短臂拷貝數的差異,更優選染色體長臂覆蓋度與短臂覆蓋度的差異)的裝置在制備對卵巢高級別漿液性癌進行篩查、診斷或風險分級的設備中的用途。在本發明的第八方面,涉及一種檢測受試者中染色體不平衡的方法,其包括:判斷來自受試者(例如人)的樣品的第2、3、5、7、8號染色體中至少1條是否存在染色體不平衡(優選染色體長臂拷貝數與短臂拷貝數的差異,更優選染色體長臂覆蓋度與短臂覆蓋度的差異);例如,將來自受試者的樣品的第2、3、5、7、8號染色體中至少1條的染色體結構信息(例如測定染色體拷貝數變異所需的結構信息)與來自健康個體的相應染色體的染色體結構信息進行比較,以確定來自所述個體的樣品中上述染色體是否存在染色體不平衡。在本發明的第九方面,涉及一種用于對卵巢高級別漿液性癌進行篩查、診斷或風險分級的方法,其包括以下步驟:在一個具體實施方案中,所述方法包括以下步驟:將通過高通量測序技術獲得的人類受試者的全基因組數據序列比對到人參考基因組Hg19,并按照200k/bin,分成多個bin;分別計算第i號染色體長臂覆蓋到的段(例如bin)的讀出序列(reads)的平均數(covChrip)和染色體短臂覆蓋到的段(例如bin)的讀出序列(reads)的平均數(covChriq);根據下列公式,計算R值:或其中p代表長臂,q代表短臂,chr為染色體(chromosome)的縮寫,i選自2、3、5、7和8;基于R值,根據公式(2)計算第i號染色體的Z-score:其中μRChri是對應于健康人群的R值的平均數,σRChri是對應于健康人群的R值的標準偏差;任選地,選擇Z-score的絕對值大于等于3的染色體,根據公式(3),求CScore值:當某一染色體的Z-score絕對值≥3時,則認為該染色體存在不平衡;當某一染色體的Z-score絕對值<3時,則認為該染色體為正常染色體;進一步,當滿足以下條件之一時,將受試者診斷為卵巢高級別漿液性癌患癌高風險患者:-所選染色體中至少一條染色體的Z-score絕對值≥3;或-CScore>0;當滿足以下條件之一時,將受試者診斷為卵巢高級別漿液性癌患癌低風險患者:-所選染色體中所有染色體的絕對值<3;或-CScore=0。在一個具體實施方案中,所述方法與用于診斷卵巢癌的其他方法組合。所述其他方法包括陰道B超、腫瘤標記物CA125水平測定、影像學診斷。更具體而言,所述影像學診斷包括CT、MRI?!颈景l明的有益效果】本發明至少在以下方面取得了出人意料的有益效果:1.本發明從分子生物學水平上進一步提高卵巢高級別漿液性癌的篩出率,減少假陽性和假陰性。2.本發明的方法具備敏感性和特異性高的優點。3.本發明提出高通量測序法用于血漿cfDNA測序,能夠有效地檢測腫瘤的染色體平衡狀態。4.本發明提出了用一次檢測,避免ca125假陽性、假陰性高的難題,陰道B超的侵入性及CT等影像學檢查的輻射等問題。5.本方法適用于測序深度0.01以上的所有測序深度和測序量?!景l明詳述】下面將結合具體實施方式對本發明的實施方案進行詳細描述,但是,本領域技術人員將理解,下列實施例僅用于說明本發明,而不是對本發明的范圍的限定。根據優選實施方案的下列詳細描述,本發明的各種目的和有利方面對于本領域技術人員來說將變得明顯?!径x】在本發明中,除非另有說明,否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。并且,本文中所涉及的實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時,為了更好地理解本發明,下面提供相關術語的定義和解釋。如本文中使用的,術語“染色體”是指是細胞核中載有遺傳信息的物質,在顯微鏡下呈圓柱狀或桿狀,主要由DNA和蛋白質組成。從著絲粒到染色體兩端之間的部分稱為染色體臂,如果著絲粒不在染色體的中央,則可區分為長臂(q)和短臂(p)。兩臂的長度對于鑒別染色體是重要的。如本文中使用的,術語“DNA”即脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid),是染色體的主要組成成分,同時也是主要遺傳物質。如本文中使用的,術語“ctDNA”即是一種游離在血漿中的小片段DNA,由凋亡或壞死的腫瘤細胞中的基因組入血產生,因此攜帶有原發瘤或轉移瘤特定的基因特征。如本文中使用的,術語“高通量測序(High-throughputsequencing)”(又被稱為下一代測序(Next-generationsequencing))是指能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定的測序技術。如本文中使用的,術語“讀出序列(reads)”,也稱為讀長,是指測序反應所能測得序列的長度。如果DNA序列長度高于讀出序列,那么必須把DNA序列分割成長度在讀出序列以內短序列才能測序。如本文中使用的,術語“序列比對”是指使讀出序列(reads)通過序列一致性原則對齊到標準參考基因組(例如標準人參考基因組)上。如本文中使用的,術語“通量”是指單位時間內所能產生的數據量,是測序速度、測序數量的綜合體現。如本文中使用的,術語“CA125”是一種卵巢癌生物標記物。1981年由Bast等從上皮性卵巢癌抗原檢測出可被單克隆抗體OC125結合的一種糖蛋白,來源于胚胎發育期體腔上皮。血清中CA125正常參考范圍<35U/mL。如本文所用,術語“體外”是指人造環境以及在人造環境內發生的過程或反應。體外環境可以由試管和細胞培養物組成但不限于試管和細胞培養物。術語“體內”是指天然環境(例如動物或細胞)以及在天然環境中發生的過程或反應。如本文中使用的,術語“敏感性”是指患者中得出陽性檢測的樣本占患者總數的百分比。在醫學診斷中,敏感性可通過如下公式表示,反映正確判斷患者的比率:敏感性=真陽性人數/(真陽性人數+假陰性人數)×100%。如本文中使用的,術語“特異性”是指健康人中得出陰性檢測的樣本占健康人總數的百分比。在醫學診斷中,特異性可通過如下公式表示,反映正確判斷非患者的比率:特異性=真陰性人數/(真陰性人數+假陽性人數)×100%。如本文中使用的,術語“漏診率”又稱假陰性率,是指在一個群體中進行某疾病的篩檢或診斷時,實際有病的受試者,按診斷標準被定為非患者的百分率。在醫學診斷中,漏診率可通過如下公式表示:漏診率=假陰性人數/(真陽性人數+假陰性人數)×100%。如本文中使用的,術語“誤診率”又稱假陽性率,是指在一個群體中進行某疾病的篩檢或診斷時,實際沒有病的受試者,按診斷標準被定為患者的百分率。在醫學診斷中,誤診率可通過如下公式表示:誤診率=假陽性人數/(真陰性人數+假陽性人數)×100%。如本文中使用的,術語“健康人群”是指未患有卵巢高級別漿液性癌風險也不存在患卵巢高級別漿液性癌風險的個體。如本文中使用的,術語“Z-score”,也稱為Z分數或標準分數(standardscore),是一個數與平均數的差再除以標準差的過程。在統計學中,標準分數是一個觀測或數據點的值高于被觀測值或測量值的平均值的標準偏差的符號數。在統計學中,Z-score通過如下公式進行表示:其中μ為總體平均值,X-μ為離均差,σ表示總體標準偏差。如本文中使用的,術語“分離的”是指使被檢測對象離開受試者(例如人)的體內環境。如本文中使用的,術語“約”應該被本領域技術人員理解,并將隨其所用之處的上下文而有一定程度的變化。如果根據術語應用的上下文,對于本領域技術人員而言,其含義不是清楚的,那么“約”的意思是偏差不超過所述特定數值或范圍的正負10%。除非上下文另外清楚地指示,否則單數形式“一個”、“一種”以及“所述”包括復數形式的指代物。類似地,除非上下文另外清楚地指示,否則詞語“或”意圖包括“和”?!靖咄繙y序技術】高通量測序技術又稱“下一代”測序技術,是相對于傳統的桑格測序(SangerSequencing)而言的,以能夠一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀出序列較短等為標志。同時,高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能,所以又被稱為“深度測序”。隨著高通量測序技術的迅猛發展,科學界也開始越來越多地應用高通量測序技術來解決生物學和醫學問題。比如在基因組水平上對還沒有參考序列的物種進行從頭測序,獲得該物種的參考序列,為后續研究和分子育種奠定基礎;對有參考序列的物種,進行全基因組重測序,在全基因組水平上掃描并檢測突變位點,發現個體差異的分子基礎。在轉錄組水平上進行全轉錄組測序,從而開展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態性(cSNP)等研究;或者進行小分子RNA測序(smallRNAsequencing),通過分離特定大小的RNA分子進行測序,從而發現新的microRNA分子。在轉錄組水平上,與染色質免疫共沉淀(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技術相結合,從而檢測出與特定轉錄因子結合的DNA區域和基因組上的甲基化位點。高通量測序技術的誕生可謂基因組學研究領域一個具有里程碑意義的事件。高通量測序一般通過以下步驟進行:1.樣本準備2.文庫構建3.測序反應4.數據分析在本發明的方法中,總體上涉及以下步驟:1.收集血漿(1)采集受試者外周血12ml(6ml×2)置于EDTA抗凝管中,立即輕柔顛倒混合采血管10次,獲得新鮮血液。(2)在采集新鮮血液4小時之內,將其于4℃、1600g離心10分鐘。(3)離心后將上清液(血漿)分裝到多個1.5ml離心管中。(4)將步驟(3)中收集的上清液于4℃、16000g離心10分鐘,去除殘余細胞;將上清液(即血漿)分裝到新的1.5ml離心管中。2.提取cfDNA可以通過本領域已知的方式提取cfDNA。KapaDNA打斷酶(如實施例中所述的蛋白酶K)可以有效地將雙鏈DNA進行片段化,而且不限DNA種類和起始量(1ng~1μg),片段化的程度由酶切的時間和溫度控制。打斷后的DNA可以直接用于二代測序的文庫構建,效果和Covaris機器打斷效果相當;–15℃以下儲存,有效期6個月。盡量避免反復凍融,凍融次數應不能超過5次。運輸過程中試劑盒采用冰袋加干冰包裝進行運輸。3.建庫測序DNA文庫的建立和染色體測序可通過本領域已知的方式進行。在本發明的具體事實方案中,通過以下方式進行:(1)純化用磁珠室溫放置30分鐘備用;(2)磁珠渦旋混勻,每個樣品中加入0.6X磁珠(加每個樣品前都要再次混勻磁珠)。用200μl移液器吸打10次,混勻樣品。樣品室溫混合5分鐘;(3)樣品放在磁力架上,室溫靜置5分鐘,直到液體變清澈;(4)用200μl移液器將上清液轉移到新的1.5ml離心管中,標記相應編號;(5)磁珠渦旋混勻,每個新離管心中加入初始樣本體積0.3X磁珠(加每個樣品前都要再次混勻磁珠)。用200μl移液器吸打10次,混勻樣品。樣品室溫混合5分鐘;(6)用200μl移液器移除上清液(注意:不要攪動磁珠),并立刻加入200μl80%乙醇,吹打兩次,磁力架上靜置1分鐘;(7)將乙醇吸出后,再次加入200μl80%乙醇,吹打兩次,磁力架上靜置30秒;(8)吸干樣品中的液體,在磁力架上晾干10分鐘;(9)加入32μl無核酸酶水,取下樣品管,槍頭吹打至磁珠全部混勻;(10)室溫放置2分鐘后,再次放置在磁力架上5分鐘,直到液體變清澈;(11)吸出30μl液體至1.5mlL離心管中;(12)使用IlluminaMiSeq、NextSeq、HiSeq、X10、NovaSeq以及任何讀出序列超過30bp的測序平臺產生測序數據。在本申請實施例中,將進一步詳細描述具體操作步驟。目前市場上高通量測序平臺的代表及其原理如下表所示:【表1】公司名稱技術原理ApplyBiosystems(ABI)基于磁珠的大規模并行克隆連接DNA測序法Illumina合成測序法Roche大規模并行焦磷酸合成測序法Helicos大規模并行單分子合成測序法CompleteGenomicsDNA納米陣列與組合探針錨定連接測序法任何適宜的高通量測序平臺均可用于本發明。優選地,在本發明中所用的測序技術為由Illumina提供的測序平臺,包括但不限于MiSeq、NextSeq、HiSeq、X10、NovaSeq。Illumina測序采用邊合成邊測序技術(Sequencingbysythesis,SBS)?!救旧w不平衡】染色體不平衡,又稱染色體失衡。染色體不平衡是惡性腫瘤的特征之一,是指相對于常見的二倍體基因組發生的基因組結構變異。廣義上的染色體不平衡包括染色體數量的改變,如多倍體或單倍體;也包括染色體局部的改變,如拷貝數增加或拷貝數缺失等。狹義的染色體不平衡則指非整倍性。在二倍體中,非整倍體變異有四種主要類型。1.非整倍性缺體性丟失一對同源染色體,即細胞的染色體數為2n-2。2.非整倍性單體性丟失單條染色體,即細胞的染色體數為2n-1。3.非整倍性三體性增加一條額外的染色體,即染色體組中有一條染色體具有三個拷貝。即細胞的染色體數為2n+1。4.非整倍性四體性增加一對額外的染色體,使染色體組中有一條染色體具有四個拷貝。即細胞的染色體數為2n+2。染色體的不平衡可通過基因劑量效應直接改變基因的表達水平,或調控其他基因的表達,因此,染色體的不平衡在腫瘤的發生發展有著重要的意義。通過研究ctDNA來反映染色體的平衡態可能對與腫瘤的定性具有一定的意義。在本申請中,染色體不平衡可表現為染色體長臂拷貝數與短臂拷貝數之間存在差異導致的染色體不平衡。染色體不平衡可以通過高通量測序技術測得的染色體長臂覆蓋度與短臂覆蓋度之間的差異來進行判斷,所述差異可以為兩者之間的比值或者兩者之間的差值。在染色體不平衡(例如染色體長臂拷貝數與短臂拷貝數的差異高于或等于閾值,再如染色體長臂覆蓋度與短臂覆蓋度的差異高于或等于閾值)的情況下,判斷為受試者患有卵巢高級別漿液性癌或者存在患卵巢高級別漿液性癌的風險。在現有技術中,通過無創DNA、染色體原位雜交(FISH)、微陣列、基因芯片、染色體核型等方式來獲得染色體結構信息,分析染色體不平衡。在本申請中,本發明人出人意料地發現,判斷特定的染色體是否存在不平衡,能夠用于對卵巢高級別漿液性癌進行診斷、篩查或風險分級。本發明人還出人意料地發現,通過特定的計算模型,計算Z-score和CScore的值,來判斷受試者中是否存在染色體不平衡,進而對卵巢高級別漿液性癌進行診斷、篩查或風險分級。具體而言,首先,將通過高通量測序技術獲得的人類受試者的全基因組數據序列比對到人參考基因組Hg19,并按照10~1000k、優選200k/bin,平均分成多個bin;分別計算第i號染色體長臂覆蓋到的段(例如bin)的讀出序列(reads)的平均數(covChrip)和染色體短臂覆蓋到的段(例如bin)的讀出序列(reads)的平均數(covChriq);根據下列公式,計算R值:或其中p代表長臂,q代表短臂,chr為染色體(chromosome)的縮寫,i選自2、3、5、7和8。其次,基于R值,根據公式(2)計算第i號染色體的Z-score:其中μRChri是對應于健康人群的R值的平均數,σRChri是對應于健康人群的R值的標準偏差;任選地,選擇Z-score的絕對值大于等于3的染色體,根據公式(3),求CScore值:再次,當某一染色體的Z-score絕對值≥3時,則認為該染色體存在不平衡;當某一染色體的Z-score絕對值<3時,則認為該染色體為正常染色體。進一步,當滿足以下條件之一時,將受試者診斷為卵巢高級別漿液性癌患癌高風險患者:-所選染色體中至少一條染色體的Z-score絕對值≥3;或-CScore>0;當滿足以下條件之一時,將受試者診斷為卵巢高級別漿液性癌患癌低風險患者:-所選染色體中所有染色體的絕對值<3;或-CScore=0?!韭殉舶柯殉舶┦菋D科惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤。在西方國家中,卵巢癌是所有婦科癌癥之中引起死亡的主導原因。這種高死亡率是由大多數患者在晚期進行診斷所致。由于卵巢癌發病隱匿、無特異性、并且進展迅速,70%的卵巢癌患者發現時已為中晚期,總體5年生存率僅約30%,而早期的卵巢癌患者5年生存期可達到90%。卵巢癌包括卵巢漿液性癌、粘液性癌、透明細胞癌、子宮內膜樣癌。卵巢高級別漿液性癌是卵巢漿液性癌中的一種類型,也最常見的卵巢癌類型,占上皮性卵巢癌的70%~80%。卵巢癌的分期主要是跟瘤體大小,有無侵犯到別的器官,有無淋巴轉移,有無遠處轉移。卵巢癌分期主要可分為以下四期,即第一期、第二期、第三期和第四期。I期:病變局限于卵巢a期:病變局限于一側卵巢,包膜完整,表面無腫瘤,無腹水;b期:病變局限于雙側卵巢,包膜完整,表面無腫瘤,無腹水;c期:Ⅰa或Ⅰb期病變已穿出卵巢表面,或包膜破裂,或在腹水中或腹腔洗液中找到惡性細胞。II期:病變累及一側或雙側卵巢,伴盆腔轉移a期:病變擴展或轉移至子宮或輸卵管;b期:病變擴展至其他盆腔組織;c期:Ⅱa或Ⅱb期病變,腫瘤穿出卵巢表面;或包膜破裂;或在腹水或腹腔洗液中找到惡性細胞。III期:病變累及一側或雙側卵巢,伴盆腔以外種植或腹膜后淋巴結轉移a期:病變大體所見局限于盆腔,淋巴結陰性,但鏡下腹腔腹膜面有種植瘤;b期:腹腔腹膜種植瘤直徑<2cm,淋巴結陰性;c期:腹腔腹膜種植瘤直徑≥2cm,或伴有腹膜后或腹股溝淋巴結轉移。IV:遠處轉移腹水存在時需找到惡性細胞;肝轉移(累及肝實質)?!綾fDNA和ctDNA】cfDNA(cell-freeDNA)是血漿中的游離DNA,以高濃度在癌癥患者的外周血中循環。而ctDNA(腫瘤循環DNA)代表cfDNA的一小部分,由凋亡或壞死的腫瘤細胞中的基因組入血產生,因此攜帶有原發瘤或轉移瘤特定的基因特征?!驹噭┖小坑糜谶M行本文所描述的方法的試劑、工具和/或說明書可以被提供于試劑盒中。例如,試劑盒可以包含用于確定癌癥患者的適當療法的試劑、工具以及說明書。這種試劑盒可以包括用于從患者收集組織(如血液)的試劑,和用于處理所述組織的試劑。所述試劑盒還可以包括用于測定的適當的緩沖液。還可以包括這些測定中的任一種所需的檢測試劑。本文所表征的試劑盒還可以包括一份說明書,它描述了如何進行這些測定。試劑盒中所包括的信息材料可以是涉及本文所描述的方法和/或用于本文所描述的方法的試劑的使用的描述性、指導性、銷售或其它材料。例如,試劑盒的信息材料可以包含聯系信息,例如物理地址、電子郵件地址、網站或電話號碼,其中試劑盒的使用者可以獲得關于進行基因表達分析和解釋結果的大量信息?!静±碓\斷和篩查標準】在病理診斷和篩查中,通常采用敏感性、特異性、漏診率、誤診率和準確度作為診斷標準?!懊舾行浴笔侵富颊咧械贸鲫栃詸z測的樣本占患者總數的百分比。在醫學診斷中,敏感性可通過如下公式表示,反映正確判斷患者的比率:敏感性=真陽性人數/(真陽性人數+假陰性人數)×100%?!疤禺愋浴笔侵附】等酥械贸鲫幮詸z測的樣本占健康人總數的百分比。在醫學診斷中,特異性可通過如下公式表示,反映正確判斷非患者的比率:特異性=真陰性人數/(真陰性人數+假陽性人數)×100%?!奥┰\率”又稱假陰性率,是指在一個群體中進行某疾病的篩檢或診斷時,實際有病的受試者,按診斷標準被定為非患者的百分率。在醫學診斷中,漏診率可通過如下公式表示:漏診率=假陰性人數/(真陽性人數+假陰性人數)×100%?!罢`診率”又稱假陽性率,是指在一個群體中進行某疾病的篩檢或診斷時,實際沒有病的受試者,按診斷標準被定為患者的百分率。在醫學診斷中,誤診率可通過如下公式表示:誤診率=假陽性人數/(真陰性人數+假陽性人數)×100%。簡而言之,如果真陽性、假陽性、真陰性和假陰性分別以a、b、c、d來表示,則敏感性、特異性、漏診率、誤診率和準確度的關系可以如下所示?!颈?】采用本方法篩查結果為陽性的病例數中,真陽性(a)表示病理診斷為患病,同時本方法結果也為陽性的病例數;假陽性(b)表示病理診斷為無病,同時本方法結果也為陽性的病例數;假陰性(c)表示病理診斷為患病,本方法結果也為陰性的病例數;真陰性(d)表示病理診斷為無病,同時本方法結果也為陰性的病例數。敏感性sen=a/(a+c);特異性sep=d/(b+d);漏診率=c/(a+c);誤診率=b/(b+d);準確度=(a+d)/(a+b+c+d)如本領域技術人員所知曉,敏感性和特異性的值越高越好;漏診率和誤診率值越低越好?!揪唧w實施方式】下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述,但是本領域技術人員將會理解,下列實施例僅用于說明本發明,而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者,按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者,均為可以通過市購獲得的常規產品?!緦嵤├俊緦嵤├?.收集血漿】通過以下方式收集血漿:(1)采集受試者外周血12ml(6ml×2)置于EDTA抗凝管中,立即輕柔顛倒混合采血管10次,獲得新鮮血液。(2)在采集新鮮血液4小時之內,將其于4℃、1600g離心10分鐘。(3)離心后將上清液(血漿)分裝到多個1.5ml離心管中。(4)將步驟(3)中收集的上清液于4℃、16000g離心10分鐘,去除殘余細胞;將上清液(即血漿)分裝到新的1.5ml離心管中?!緦嵤├?.提取血漿中的cfDNA】采用標準Qiagen游離DNA提取試劑盒(QIAGEN,QiaAmpDNABloodMiniKit,55114),按照說明書操作,每4mL外周血提取1~50ngDNA。具體操作步驟如下:(1)取1管血漿冰上融解后,加入100mL的QIAGEN蛋白酶K。(2)加入0.8mLBufferACL(事先加入1.0ygcarrierRNA)蓋上管蓋,渦旋30s,直至管內液體呈均相。(3)60℃孵育分鐘。(4)加入1.8mL的BufferACB,渦旋混勻冰置5分鐘。(5)將QIAamp微柱插入置于QIAvac24Plus的Vac連接器內,將20mL管擴展器插入QIAamp微柱內。(6)將第(4)步所得的裂解混合液小心加入QIAamp微柱的管擴展器內,打開真空泵,待所有裂解液均從管內完全滲下,關閉真空泵,釋壓至Ombar,小心取出管擴展器并棄去。(7)向管內加入600yLBufferACW1,保持管蓋打開,打開真空泵,讓BufferACW1完全滲透過QIAamp微柱,關閉真空泵,釋壓至Omba。(8)向QIAamp微柱內加入750mLBufferACW2;保持管蓋打開,開啟真空泵,讓ACW2buffer完全滲過QIAamp微柱,關閉真空泵,釋壓至Ombars。(9)加入750此乙醇(96~100%)至QIAamp微柱,保持管蓋開啟,打開真空泵使所有乙醇完全滲下,關閉真空泵,釋壓至Ombars。(10)關閉管蓋;將QIAamp微柱從真空歧管上取下,丟棄Vac連接器;將QIAamp微柱放置于新的2mL連接管上,全速離心(20,000×g;14,000rpm)3分鐘。(11)將QIAamp微柱放置于新的2mL收集管,打開管蓋,56℃孵育10分鐘。(12)將QIAamp微柱放置于新的1.5mL洗脫管上,棄去上一步的收集管;小心向膜中間加入的BufferAVE。關上管蓋,室溫孵育3分鐘。(13)全速離心(20,000×g;14,000rpm)1分鐘以洗脫核酸,收集得到血漿游離雙鏈DNA?!緦嵤├?.建立測序文庫】(1)純化用磁珠室溫放置30分鐘備用;(2)磁珠渦旋混勻,每個樣品中加入0.6X磁珠(加每個樣品前都要再次混勻磁珠)。用200μl移液器吸打10次,混勻樣品。樣品室溫混合5分鐘;(3)樣品放在磁力架上,室溫靜置5分鐘,直到液體變清澈;(4)用200μl移液器將上清液轉移到新的1.5ml離心管中,標記相應編號;(5)磁珠渦旋混勻,每個新離管心中加入初始樣本體積0.3X磁珠(加每個樣品前都要再次混勻磁珠)。用200μl移液器吸打10次,混勻樣品。樣品室溫混合5分鐘;(6)用200μl移液器移除上清液(注意:不要攪動磁珠),并立刻加入200μl80%乙醇,吹打兩次,磁力架上靜置1分鐘;(7)將乙醇吸出后,再次加入200μl80%乙醇,吹打兩次,磁力架上靜置30秒;(8)吸干樣品中的液體,在磁力架上晾干10分鐘;(9)加入32μl無核酸酶水,取下樣品管,槍頭吹打至磁珠全部混勻;(10)室溫放置2分鐘后,再次放置在磁力架上5分鐘,直到液體變清澈;(11)吸出30μl液體至1.5mlL離心管中?!緦嵤├?.高通量測序】使用IlluminaX10測序儀,對于在實施例2中得到的經擴增的DNA片段文庫,自該DNA片段文庫的一端或兩端開始進行測序,從測得的序列減去接頭(Adapter)和樣本標簽(barcode),并且去除噪音(如低質量區域)而得到樣品DNA片段的序列,即有效讀出序列(reads)?!緦嵤├?.序列比對】(1)有效讀出序列(reads)與標準人參考基因組的比對使用BWA-MEM軟件(http://bio-bwa.sourceforge.net),將實施例3中得到的有效讀出序列(reads)比對到標準人參考基因組,并將該比對結果以每段200kb的大小分別寫入多個*.bin格式的文件中。(2)對比對到標準人參考基因組的讀出序列(reads)的個數的統計從(1)中得到諸多*.bin文件中選取人i號染色體(Chri)的長臂和短臂所覆蓋的多個*.bin文件,并計算所選取的*.bin文件中比對到標準人參考基因組上的有效讀出序列(reads)的個數的平均數(covChrip和covChriq,其中p代表長臂,q代表短臂)?!緦嵤├?.判斷染色體不平衡的存在與否】使用計算模型如下計算染色體平衡態分值(Z-score和CScore)。(1)將受試者的全基因組數據序列比對到人參考基因組,并按照200k/bin分成多個bin;(2)分別計算染色體長臂和短臂覆蓋到的bin的讀出序列(reads)的平均數(cov);(3)根據公式(1),通過長臂reads平均數除以短臂reads平均數,計算R值:或其中p代表長臂,q代表短臂,chr為染色體(chromosome)的縮寫,i代表某條染色體;(4)利用上一步驟得出的R值,計算每條染色體的Z-score:其中μ為由健康人群計算得出的R的平均數,σ為由健康人群計算得出的標準差;(5)任選地,利用公式(2)計算得出的Z-score的絕對值大于等于3的染色體,通過公式(3),求CScore值:【實施例7.染色體不平衡以及患卵巢高級別漿液性癌的風險判斷】在實施例6的基礎上,通過計算得到的染色體平衡態分值,判斷染色體是否存在異常、患者是否存在患卵巢癌的風險、以及風險高低。1.異常染色體:某一染色體Z-score絕對值≥32.正常染色體:某一染色體Z-score絕對值<33.患癌高風險當滿足以下條件之一時,將受試者診斷為卵巢癌患癌高風險患者:-某一條染色體的Z-score絕對值≥3;或-CScore>0。4.患癌低風險當滿足以下條件之一時,將受試者診斷為卵巢癌患癌低風險患者:-所有染色體的Z-score絕對值<3;或-CScore=0?!緦嵤├?.CA125正常受試者中卵巢高級別漿液性癌的篩查與診斷】受試者情況:接受檢測的受試者為一名59歲中年女性,因“發現盆腔包塊半年”入院。檢查CA125為6.96U/ml,出于正常值范圍內。婦科檢查可捫及6×6cm腫物,腫塊性質不明。篩查對象:第2、3、5、7、8號染色體通過本發明所述的方法,針對該受試者計算得出的各染色體Z-score分別如下表所示:【表3】染色體編號Z-score211.5237.2456.9788.37鑒于第2、3、5、8號染色體中任一條的Z-score≥3,判斷該患者患卵巢癌風險高。對該受試者的包塊進行手術切除,術后腫塊組織進行病理檢查,確定為卵巢高級別漿液性癌(FIGOIc期)。本實施例表明:通過本發明的方法,對上述染色體的篩查,能夠對卵巢高級別漿液性癌進行早期診斷?!緦嵤├?.CA125升高受試者中卵巢高級別漿液性癌的篩查與診斷】受試者情況:接受檢測的受試者為一名47歲中年女性,因“發現盆腔包塊半年”入院。檢查CA125水平為312U/ml,遠超出正常參考值。經陰道B超顯示:右附件區囊實型包塊(13.2cm×7.8cm),包塊性質不明。篩查對象:第2、3、5、7、8號染色體根據本發明的方法,計算上述染色體的Z-score,均低于3(數據未顯示),未發現有染色體出現不平衡。由此,判斷該受試者患卵巢高級別漿液性癌的風險低。對該受試者的包塊進行手術切除,術后腫塊組織進行病理檢查,確定為良性腫瘤(漿液性囊腺瘤)。本實施例表明:通過本發明的方法,對上述染色體的篩查,有利于確定受試者患卵巢高級別漿液性癌的風險高低?!緦嵤├?0.CA125升高受試者中卵巢高級別漿液性癌的篩查與診斷】受試者情況:接受檢測的受試者為一名46歲中年女性,因“腹脹20+天,盆腔包塊5天”入院。檢查CA125水平為205.8U/ml,CT檢查顯示左側附件區囊性包塊,性質不明。篩查對象:第3、5、8號染色體通過本發明所述的方法,針對該受試者計算得出的各染色體Z-score分別如下表所示:【表4】染色體編號Z-score34.1384.84鑒于第3、8號染色體中任一條的Z-score≥3,判斷該患者患卵巢癌風險高。對該受試者的包塊進行手術切除,術后腫塊組織進行病理檢查,確定為卵巢高級別漿液性卵巢癌(FIGOIIIc期)。本實施例表明:通過本發明的方法,對第3、5、8號染色體的篩查,能夠有效地判斷受試者患卵巢高級別漿液性癌的風險高低,當卵巢高級別漿液性卵巢癌處于中晚期時,尤為如此?!緦嵤├?1.數據統計和診斷分析】本研究納入總計52名受試者。對這些受試者根據本發明的方法計算Z-score和CScore,列示于下表5?!颈?】注:上表中,i表示染色體編號。如i=2,則表示第2號染色體。結果表明:根據本發明的方法,當篩查對象為第3、5、8號染色體時,第1~17號受試者均被診斷為卵巢高級別漿液性癌高風險(Z-score≥3,或CScore>0)。病理證實,第1~18號(18位)受試者均為卵巢高級別漿液性癌患者,第18~52號(34位)受試者非癌患者。本研究方法對于高級別漿液性癌的篩查,敏感性為94.4%(17/18),特異性為100%(34/34)。準確性為%(52/52),漏檢率為5.56%(1/18),誤診率為0%(0/34)。進一步地,結果表明:根據本發明的方法,當篩查對象為第2、3、5、7、8號染色體時,第1~18號受試者均被診斷為卵巢高級別漿液性癌高風險(Z-score≥3,或CScore>0)。病理證實,第1~18號(18位)受試者均為卵巢高級別漿液性癌患者,第19~52號(34位)受試者非癌患者。本研究方法對于高級別漿液性癌的篩查,敏感性為100%(18/18),特異性為100%(34/34)。準確性為100%(52/52),漏檢率為0%(0/18),誤診率為0%(0/34)。以上結果表明,本發明的方法可以簡便、高效地診斷和篩查卵巢高級別漿液性癌,具備敏感性、特異性和準確性都非常高以及漏檢率和誤診率低的優點,相對于現有技術取得了出人意料的技術效果。盡管本發明的具體實施方式已經得到詳細的描述,但本領域技術人員將理解:根據已經公開的所有教導,可以對細節進行各種修改和變動,并且這些改變均在本發明的保護范圍之內。本發明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。當前第1頁1 2 3 
再多了解一些
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