血漿外泌體分子標志物has-miR-219a-5p及應用的制作方法

文檔序號:18145651發布日期:2019-07-10 11:47
血漿外泌體分子標志物has-miR-219a-5p及應用的制作方法
本發明屬于醫學分子生物學領域,具體涉及一種血漿外泌體has-miR-129-5p分子標志物在的制備及其在妊娠滋養細胞腫瘤患者甲氨蝶呤單藥化療耐藥性早期預測方面的應用。技術背景妊娠滋養細胞腫瘤(gestationaltrophoblasticneoplasia,GTN),是一種來源于胚胎滋養細胞的惡性腫瘤,可繼發于任何類型的妊娠。世界范圍內的GTN發生率差異明顯,且亞洲和拉丁美洲的發生率明顯高于歐洲和北美洲。GTN惡性程度極高,發生轉移早而廣泛,在化療藥物問世前,其死亡率可高達90%以上。自從甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、放線菌素D(dactinomycin,ACT-D)、等一系列化療藥物有效應用于治療GTN后,其治愈率已達80%~90%,使其成為通過化療能治愈的首個人類實體腫瘤,因而化療是其主要治療手段,但仍有約10%-20%的GTN患者因發生耐藥而達不到治愈目的。目前GTN的臨床治療多以FIGO2000妊娠滋養細胞腫瘤分期與預后評分系統為指導,但對于GTN化療效果的評估,特別是化療耐藥性的預測仍難以令人滿意。隨著分子醫學的發展,尋找GTN早期診斷及耐藥性預測的分子標志物,以便對GTN患者進行分層精準治療,從而提高其治愈率,已成為GTN研究的關注點。外泌體(exosome),最初是指網織紅細胞分化過程中分泌的由多囊泡內體(MV)與質膜融合形成的直徑為40-100nm的囊泡樣結構。隨后大量研究發現各種類型的細胞均能釋放外泌體,并廣泛分布于唾液、血漿和乳汁等各種體液當中。外泌體內攜帶有蛋白、RNA、DNA、細胞因子等多種生物活性物質,并能傳遞重要的信號分子,形成了一種全新的細胞間信息傳遞系統,影響細胞的生理狀態并與疾病的發生發展密切相關。近年來,尋找以外泌體為依托的分子標志物已成為研究的熱點,特別是外泌體來源的microRNA,由于其比血漿游離microRNA具有更好的穩定性,且在外泌體中靶向富集,其作為分子標志物的巨大潛力日益顯現。本發明即是首次提出發現了一種血漿外泌體microRNA可以作為GTN患者甲氨蝶呤單藥化療耐藥性預測的分子標志物。技術實現要素:本發明的目的在于提供一種血漿外泌體分子標志物has-miR-219a-5p,可用于對GTN患者甲氨蝶呤單藥化療耐藥性早期預測方面的應用方法及制備的試劑盒。血漿外泌體分子標志物has-miR-219a-5p在制備GTN患者早期預測甲氨蝶呤單藥化療耐藥性的試劑盒中的應用,所述的has-miR-219a-5p的序列是:UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU。所述的GTN早期預測甲氨蝶呤單藥化療耐藥性的試劑盒為用于定量檢測血漿外泌體分子標志物has-miR-219a-5p的試劑盒,具體是實時熒光定量PCR檢測試劑盒。一種具有GTN早期甲氨蝶呤單藥化療耐藥性早期預測能力的試劑盒,包括血漿外泌體提取系統、外泌體microRNA提取系統、反轉錄系統、擴增系統和相對定量內參標準化系統。所述的試劑盒是通過定量檢測血漿外泌體分子標志物has-miR-219a-5p來早期預測GTN患者對甲氨蝶呤單藥化療耐藥性;所述的has-miR-219a-5p的序列是:UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU。所述的相對定量內參標準化系統由has-miR-129-5p組成;所述的has-miR-129-5p的序列是:CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC。所述的血漿外泌體提取系統包括:ExoQuickTMExosomePrecipitationSolution;所述的外泌體microRNA提取系統包括:QIAzolTMLysisReagent(RNA裂解液)、三氯甲烷、BufferRWT和BufferRPE(RNA清洗液)、RNase-FreeWater(無酶水)。所述的反轉錄系統包括:5×miScriptBuffer(5×反轉錄緩沖液)、10×NucleicsMix(10×核苷酸混合物)、miScriptReverseTranscriptaseMix(反轉錄酶)、RNase-FreeWater(無酶水)。所述的擴增系統包括:2×SYBRGreenPCRMasterMix(2×轉錄混合液)、10×MiScriptUniversalPrimer(10×通用引物)、10×Primer(10×引物)、RNase-FreeWater(無酶水)。本發明的有益效果在于:本發明所提供的血漿外泌體分子標志物has-miR-219a-5p能夠用于GTN患者對甲氨蝶呤單藥化療耐藥性的早期預測。通過對10例正常早期妊娠婦女(用NP代表)、10例GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感(用SP代表)和10例GTN甲氨蝶呤單藥化療耐藥患者(用RP代表)的血漿外泌體進行高通量二代測序發現has-miR-219a-5p的表達在正常早期妊娠婦女和GTN患者之間存在差異性表達(p<0.001),且在GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感和耐藥患者之間也存在差異性表達(p<0.01)(圖3)。后又進一步對50例正常早期妊娠婦女、37例GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感和22例GTN甲氨蝶呤單藥化療耐藥患者的血漿外泌體進行實時熒光定量PCR檢測,確認了其在不同病人群體中差異性的存在(p<0.001)(圖4)。本發明通過檢測各人群中血漿外泌體分子標志物has-miR-219a-5p的水平,能對妊娠女性做出GTN患者則可進行早期甲氨蝶呤單藥化療耐藥預測,從而將對針對GTN患者個體化治療方案的準確性提高至一個新的水平。同時,通過實時熒光定量PCR檢測技術對GTN患者血漿外泌體has-miR-219a-5p水平的檢測,取材便利,創傷性小,定量準確,相較于芯片技術、高通量測序等技術,此方法更簡單快速,經濟實用,適合臨床開展。附圖說明圖1A是透射電鏡拍攝的所提取的血漿外泌體的鑒定圖。圖1B是WesternBlot所示的血漿外泌體膜表面蛋白分子的條帶圖。圖2是Agilent2100生物分析儀分析的所提取的血漿外泌體RNA的鑒定圖。圖3是通過高通量二代測序技術分析所提取的血漿外泌體microRNA種類,其中NP代表正常妊娠組,SP代表GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感組,RP代表GTN甲氨蝶呤單藥化療耐藥組。圖4A是本發明所提供的相對定量內參標準化系統has-miR-129-5p在正常妊娠組和GTN患者組的樣本中經qRT-PCR采用原始Ct值的分析圖,其中NP代表正常妊娠組,PP代表GTN患者組。圖4B是本發明中血漿外泌體分子標志物has-miR-219a-5p在正常妊娠組和GTN患者組的樣本中經qRT-PCR相對定量分析圖,其中NP代表正常妊娠組,PP代表GTN患者組;圖4C是本發明中血漿外泌體分子標志物has-miR-219a-5p在GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感組和GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感組的樣本中經qRT-PCR相對定量分析圖,其中SP代表GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感組,RP代表GTN甲氨蝶呤單藥化療耐藥組;圖5是本發明中血漿外泌體分子標志物has-miR-219a-5p在GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感組和耐藥組的樣本中的ROC診斷分析圖。具體實施方式以下結合附圖說明和具體實施方式進一步闡述本發明,而非限制本發明的保護范圍。實施例1:檢測GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感組、耐藥組和正常妊娠組血漿樣本中外泌體microRNA的表達。具體實驗過程及結果如下:1、標本的收集及分組(1)、標本的來源:本實例選取GTN化療患者血漿樣本20例,依據國際婦產科聯盟妊娠滋養細胞腫瘤臨床分期與預后評分系統(FIGO2000),均是首次診斷為GTN,危險評分為低危,且未經化療的患者。另外選取正常妊娠女性血漿樣本10例,均來自于人工流產的自愿者。以下為納入標準:1)GTN患者組入組標準(符合下列全部條件):①簽署知情同意書;②臨床診斷為妊娠滋養細胞腫瘤;③沒有接受放、化療的初治病人(包括預防性化療);④年齡20-45歲;⑤體力分級:ECOG評分≥60分;⑥血象(3天內):WBC≥3.5×109/L,ANC≥1.5×109/L,Pt≥80×109/L,血清膽紅素≤正常值高限的1.5倍,轉氨酶≤正常值高限的1.5倍,BUN、Cr≤正常值高限;⑦無嚴重內科合并癥;⑧患者能按方案要求接受隨訪。排除標準(符合一下任何一條):①臨床未明確診斷妊娠滋養細胞腫瘤;②病理診斷為中間型滋養細胞腫瘤,包括PSTT和ETT;③已進行放、化療者(包括預防性化療);④有嚴重的或不能控制的內科疾患,不適合化療者;⑤1年內接受過異體輸血、移植手術、細胞治療或接受過免疫治療者。2)正常對照組的入組標準(符合下列全部條件):①簽署知情同意書;②孕周8-12周入院要求終止妊娠者;③年齡20-45歲;④無內科合并癥。(2)標本的分組根據FIGO2000首診評定為低危的GTN患者,首次選用甲氨蝶呤(MTX)進行單藥化療。在每一療程化療結束后,至少每周一次檢測血hCG,并結合影像學檢查。在每療程化療結束至18日內,血hCG下降至少1個對數為有效(即敏感);若連續2次檢測血HCG水平呈平臺(±10%)或上升(>10%)為無效(即耐藥)。經長期隨訪后得到其化療結局,在20例GTN單藥化療患者中,10例為甲氨蝶呤敏感,10例為甲氨蝶呤耐藥。2、血漿樣本的處理(1)采集管抗凝劑為EDTA或檸檬酸鈉(即枸櫞酸鈉),不能用肝素抗凝。(2)采集操作按照外周血標準采集操作進行,采血后充分顛倒混勻,避免凝固,采血后標本放置在4℃冰箱。(3)血漿的分離在采血后2小時內完成,4℃下4000g離心15min,收集上層血漿,采用1.5mlEP管分裝,-80℃凍存,直至使用。3、血漿外泌體的提取與鑒定①將-80℃儲存的血漿樣品置于冰上融化,取250ml血漿至潔凈1.5mlEP管內。②4℃下16000g離心10min,以去除冷凝蛋白和細胞碎片,取其上清。③加入等體積STAGOTM凝血酶原時間測定試劑(REF00667),室溫下放置10-15min后10000g離心5min,以去除血漿中的纖維蛋白原等。④取上清于RNA-free潔凈EP管中按1/4標本總體積加入ExoQuickTMExosomePrecipitationSolution(Catalog#EXOQ20A-1)試劑,充分混勻。⑤加入RNaseA使混合物的終濃度為10ug/ml,在4℃冰箱內放置至少12h。⑥加入Rnaseinhibitormurine,150units/ml,使濃度為40000units/ml,充分混勻。⑦室溫下1500g離心30min,吸棄上清。⑧剩余物室溫下1500g離心5min,再次棄去剩余上清。⑨用200ulPBS清洗沉淀。⑩用20ul滅菌PBS重懸外泌體沉淀,使外泌體充分溶解于PBS中。4、外泌體microRNA的提取與質檢所有血漿外泌體microRNA的提取均按照QiagenmiRNeasyMicroKit(Cat.No.217084)試劑盒所提供的操作步驟。提取完成后保存于-20℃,直至檢測。所提取的血漿外泌體microRNA使用InvitrogenTMQubit2.0Fluorometer配合QubitmicroRNAAssayKit(Cat.No.Q32880)測定外泌體內microRNA濃度。所提取的血漿外泌體microRNA使用Agilent2100生物分析儀配合AgilentSmallRNAKit(reorder-no5067-1548)進行質檢。5、外泌體miRNA文庫的建立與測序實驗流程按照Illumina公司提供的標準步驟執行。小RNA測序文庫制備采用TruSeqSmallRNASamplePrepKits(Illumina,SanDiego,USA)試劑盒。對構建好的文庫采用Illumina·HiSeq2000/2500進行測序。6、數據分析通過高通量二代測序技術得到血漿外泌體樣本中microRNA的表達譜。測序結果分析采用Bedtools2.20.0進行,統計學分析采用SPSS20.0進行,當p<0.05時,認為結果在統計學上具有顯著性差異。分析內容為microRNA在各組血漿外泌體中表達的差異性分析。實驗結果如下:(1)所提取的血漿外泌體的鑒定;如圖1,通過透射電鏡觀察鑒定可知,所提取的血漿外泌體符合外泌體典型的大小(直徑30~150nm)與結構(雙凹圓盤狀或杯狀)。(2)所提取的外泌體microRNA的質檢;如圖2,通過Agilent2100生物分析儀分析表明,血漿外泌體所提總RNA內主要是smallRNA,其中microRNA約占80%左右,濃度在1~10ng/ul。(3)microRNA在血漿外泌體中的特異性表達如圖3,通過Illumina·HiSeq/MiSeq進行高通量二代測序技術分析,表明在GTN甲氨蝶呤單藥化療耐藥組(用RP代表)、GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感組(用SP代表)和正常妊娠組(用NP代表)所提取的血漿外泌體中均檢測到has-miR-219a-5p存在表達。通過標準化分析后得到has-miR-219a-5p的表達量在正常妊娠組和GTN患者之間存在統計學顯著性差異(p=0.0007),在GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感組和耐藥組之間也存在統計學顯著性差異(p=0.0015),說明其可作為區分正常妊娠和GTN患者及GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感和耐藥患者的生物標志物,為后續實驗提供基礎。通過標準化分析后得到has-miR-129-5p(has-miR-129-5p的序列是:CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC)在正常妊娠組和GTN患者之間表達恒定,說明其具有作為相對定量內參的能力,為后續實驗提供基礎。由此可知,has-miR-219a-5p在GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感組、耐藥組和正常妊娠組血漿樣本的外泌體中的表達存在顯著統計學差異,可作為對GTN的早期診斷和對甲氨蝶呤單藥化療耐藥性的預測分子標志物。實施例2:驗證has-miR-219a-5p在GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感組、化療耐藥組和正常妊娠組血漿樣本中外泌體的表達差異和診斷效能。具體實驗過程及結果如下:1、標本的收集及分組本實例選取GTN化療患者血漿樣本79例,依據國際婦產科聯盟妊娠滋養細胞腫瘤臨床分期與預后評分系統(FIGO2000),均是首次診斷為GTN,危險評分為低危,且未經化療的患者。經長期隨訪后得到其化療結局,其中47例為甲氨蝶呤敏感,32例為甲氨蝶呤耐藥。另外選取正常妊娠女性血漿樣本60例,均來自于人工流產的自愿者。2、血漿樣本的處理(1)采集管抗凝劑為EDTA或檸檬酸鈉(即枸櫞酸鈉),不能用肝素抗凝。(2)采集操作按照外周血標準采集操作進行,采血后充分顛倒混勻,避免凝固,采血后標本放置在4℃冰箱。(3)血漿的分離在采血后2小時內完成,4℃下4000g離心15min,收集上層血漿,采用1.5mlEP管分裝,-80℃凍存,直至使用。3、血漿外泌體的提?、賹?80℃儲存的血漿樣品置于冰上融化,取250ml血漿至潔凈1.5mlEP管內。②4℃下16000g離心10min,以去除冷凝蛋白和細胞碎片,取其上清。③加入等體積STAGOTM凝血酶原時間測定試劑(REF00667),室溫下放置10-15min后10000g離心5min,以去除血漿中的纖維蛋白原等。④取上清于RNA-free潔凈EP管中按1/4標本總體積加入ExoQuickTMExosomePrecipitationSolution(Catalog#EXOQ20A-1)試劑,充分混勻。⑤加入RNaseA使混合物的終濃度為10ug/ml,在4℃冰箱內放置至少12h。⑥加入Rnaseinhibitormurine,150units/ml,使濃度為40000units/ml,充分混勻。⑦室溫下1500g離心30min,吸棄上清。⑧剩余物室溫下1500g離心5min,再次棄去剩余上清。⑨用200ulPBS清洗沉淀。⑩用20ul滅菌PBS重懸外泌體沉淀,使外泌體充分溶解于PBS中。4、外泌體microRNA的提取和質檢所有血漿外泌體microRNA的提取均按照QiagenmiRNeasyMicroKit(Cat.No.217084)試劑盒所提供的操作步驟。提取完成后保存于-20℃,直至檢測。所提取的血漿外泌體microRNA使用InvitrogenTMQubit2.0Fluorometer配合QubitmicroRNAAssayKit(Cat.No.Q32880)測定外泌體內microRNA濃度。所提取的血漿外泌體microRNA使用Agilent2100生物分析儀配合AgilentSmallRNAKit(reorder-no5067-1548)進行質檢。5、microRNA的逆轉錄采用通用加尾法進行逆轉錄,具體操作參照QiagenmiScriptⅡRTKit(cat.nos.218161)試劑盒所提供的說明書。①配制miRNA樣本成分體積/量microRNA10ngRNase-freewaterUpto12ml總體積12ul②配制逆轉錄反應體系20ul逆轉錄反應體系如下:成分體積/量5XmiScriptHiflexBuffer4ul10XmiScriptNucleicsMix2ulmiScriptReverseTranscriptaseMix2ul第1步miRNA樣本12ul總體積20ul③進行逆轉錄反應程序如下:第一步:37℃60min;第二步:95℃5min;第三步:冰上靜置。儀器:48wellgeneAmpPCRsystem9700。④配制cDNA樣本向第③步反應產物加入200ulRNase-freewater,得到稀釋的cDNA樣本。保存于-20℃,直至使用。6、實時熒光定量PCR①根據上海生工生物工程有限公司提供的加尾法上游引物,濃度為10uM。名稱hsa-miR-219a-5phsa-miR-129-5p物種Humanhuman編號MIMAT0000276MIMAT0000242序列UGAUUGUCCAAACGCAAUUCUCUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC引物序列AGTGATTGTCCAAACGCAATTCTCTTTTTGCGGTCTGGGCTT②配制qRT-PCR反應體系具體操作參照GreenPCRKit(cat.nos.218076)試劑盒所提供的說明書。25ulPCR反應體系如下:成分反應體系(96孔)2×SYBRGreenPCRMasterMix12.5ul10×miScriptUniversalPrimer2.5ulSpecificForwardPrimer(c=10uM)2.5ulRNase-freeWater5ulDilutedcDNA2.5ul總體積25ul③進行實時熒光定量PCR反應程序如下:第一步:95℃15min;第二步:94℃15sec55℃30sec70℃30sec共40個循環,終點采集熒光。儀器:Appliedbiosystems7900HT。7、數據分析qRT-PCR檢測microRNA相對表達量的計算公式為RQ=2-ΔΔCt,所有反應均做3個副孔,如Ct值差異較大(>0.5),則重復一次。統計學分析采用GraphPadPrism6.0和SPSS20.0進行,當p<0.05時,認為結果在統計學上具有顯著性差異。分析內容為microRNA在各組血漿外泌體中表達的差異性分析和ROC診斷分析。實驗結果如下:本實例通過以上實驗方法驗證了has-miR-219a-5p在GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感組、化療耐藥組和正常妊娠組血漿樣本的外泌體中的表達存在顯著統計學差異,可作為對GTN甲氨蝶呤單藥化療耐藥性的預測分子標志物。1、相對定量內參hsa-miR-129-5p的確認:結合實例1中的測序結果,通過對隨機選取的79例GTN組和隨機選取的60例正常妊娠組標本的檢測結果進行分析可得(如圖4A),在各種標本之間表達恒定,確認可作為相對定量內參。所述的has-miR-129-5p的序列是:CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC。2、has-miR-219a-5p在各組間差異性表達的驗證:結合實例1中的測序結果,通過對隨機選取的79例GTN組和隨機選取的60例正常妊娠組標本的檢測結果進行分析可得,has-miR-219a-5p在GTN組血漿樣本外泌體中的表達量明顯低于正常妊娠組樣本,結果具有顯著統計學差異(如圖4A);通過對隨機選取的47例GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感組和隨機選取的32例GTN甲氨蝶呤單藥化療耐藥組的檢測結果進行分析可得,has-miR-219a-5p在甲氨蝶呤單藥化療耐藥組血漿樣本外泌體中的表達量明顯低于甲氨蝶呤單藥化療敏感組樣本,結果具有顯著統計學差異(如圖4B)。以上結果說明has-miR-219a-5p可作為對GTN患者甲氨蝶呤單藥化療耐藥性的早期預測分子標志物。所述的has-miR-129-5p的序列是:CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC。3、外泌體miR-219a-5p的ROC診斷分析:結合實例1中的測序結果,通過對隨機選取的47例GTN甲氨蝶呤單藥化療敏感組和隨機選取的32例GTN甲氨蝶呤單藥化療耐藥組的檢測結果進行ROC診斷分析可得(如圖5),當外泌體miR-219a-5p的相對表達量≤0.215時,提示該患者可能對甲氨蝶呤單藥化療耐藥,ROC曲線下面積AUC=0.723,敏感度為81.3%,特異性為66.0%。實施例3:血漿外泌體分子標志物has-miR-219a-5p試劑盒的應用方法本發明的試劑盒包括血漿外泌體提取系統、外泌體microRNA提取系統、反轉錄系統、擴增系統和相對定量內參標準化系統。該試劑盒通過定量檢測GTN患者血漿外泌體has-miR-219a-5p的水平來早期預測GTN患者甲氨蝶呤單藥化療的耐藥情況。具體內容包括如下:血漿外泌體提取系統包括:ExoQuickTMExosomePrecipitationSolution;外泌體microRNA提取系統包括:QIAzolTMLysisReagent(RNA裂解液)、三氯甲烷、BufferRWT和BufferRPE(RNA清洗液)、RNase-FreeWater(無酶水)。反轉錄系統包括:5×miScriptBuffer(5×反轉錄緩沖液)、10×NucleicsMix(10×核苷酸混合物)、miScriptReverseTranscriptaseMix(反轉錄酶)、RNase-FreeWater(無酶水)。擴增系統包括:2×SYBRGreenPCRMasterMix(2×轉錄混合液)、10×MiScriptUniversalPrimer(10×通用引物)、10×Primer(10×引物)、RNase-FreeWater(無酶水)。其中has-miR-219a-5p的序列為UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU,其PCR上游引物序列為AGTGATTGTCCAAACGCAATTCT。相對定量內參標準化系統由has-miR-129-5p組成。has-miR-129-5p的序列為CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC,其PCR上游引物序列為CTTTTTGCGGTCTGGGCTT。本發明的試劑盒的使用步驟如下:1、獲取來源于被檢測者的血漿樣本;2、提取血漿外泌體microRNA并質檢;3、利用特異性檢測技術檢測樣本中分子標志物的表達;4、對于檢測者的甲氨蝶呤單藥化療耐藥性進行早期預測。具體操作如下:1、血漿樣本的采集與處理(1)采集患者初次化療前血樣5ml,采集管抗凝劑為EDTA或檸檬酸鈉(即枸櫞酸鈉),不能用肝素抗凝。(2)采集操作按照外周血標準采集操作進行,采血后充分顛倒混勻,避免凝固,采血后標本放置在4℃冰箱。(3)血漿的分離在采血后2小時內完成,4℃下4000g離心15min,收集上層血漿,采用1.5mlEP管分裝,-80℃凍存,直至使用。2、血漿外泌體microRNA的提取和質檢具體操作采用實施例2中步驟3和步驟4。3、檢測樣本中分子標志物的表達具體操作采用實施例2中步驟5和步驟6。4、數據分析qRT-PCR檢測microRNA相對表達量的計算公式為RQ=2-ΔΔCt,所有反應均做3個副孔,如Ct值差異較大(>0.5),則重復一次。統計學分析采用GraphPadPrism6.0和SPSS20.0進行。如圖5所示,當檢測樣本中has-miR-219a-5p≤0.215時,預測絨毛膜癌患者可為甲氨蝶呤單藥化療耐藥。值得注意的是,具體實施方式僅是對本發明的說明,不應將其視為對本發明的技術方案的限制和限定,因此,采用本發明的實質內容而僅做局部改變,仍應落入本發明的保護范圍內。序列表<120>血漿外泌體分子標志物has-miR-219a-5p及應用<160>2<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>21<212>DNA/RNA<213>未知(Unknown)<400>1ugauuguccaaacgcaauucu21<210>2<211>21<212>DNA/RNA<213>未知(Unknown)<400>2cuuuuugcggucugggcuugc21當前第1頁1 2 3 
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