一種檢測草貝母和輪葉貝母成分的方法與流程

文檔序號:18145676發布日期:2019-07-10 11:47
一種檢測草貝母和輪葉貝母成分的方法與流程

本發明屬生物技術領域,涉及中藥成分的檢測方法,具體涉及檢測草貝母和輪葉貝母成分的引物、探針以及檢測方法。



背景技術:

貝母為多年生草本植物,其鱗莖供藥用,因其形狀得名,《本草經集注》說:“形似聚貝子”,故名貝母,能止咳化痰、清熱散結之功。川貝母(Fritillaria cirrhosa)是貝母中的珍品,是百合科多年生草本植物烏花貝母、卷葉貝母、羅氏貝母、甘肅貝母、梭砂貝母等貝母的地下鱗莖。因主產于四川而得名,但在西藏、甘肅、新疆、華北、東北均有出產。川貝母性微寒而味甘苦,止咳化痰之效較強,入心肺經,功能潤肺,臨床常與沙參、麥冬、天冬、桑葉、菊花等配伍用于熱痰、燥痰、肺虛勞嗽、久嗽、痰少咽燥、痰中帶血以及心胸郁結、肺痿、肺癰等病癥的治療?,F代藥理研究證實,川貝母含有川貝母堿等多種生物堿,川貝母堿有降低血壓,興奮子宮等多種藥理作用。

因為川貝母在貝母中藥效最好且無法人工種植,導致川貝價格一直居高不下,而貝母類藥材來源較多,致使一些人用其他與川貝母外觀相似的貝母冒充川貝母銷售,導致市場上出現了眾多的混淆品和偽品,其中主要以浙貝母(Fritillaria thunbergii)、草貝母(Iphigenia indica)和輪葉貝母(Fritillaria maximowiczii)為主。

草貝母為百合科科植物山慈姑的鱗莖,含秋水仙堿、異秋水仙堿等多種生物堿。因秋水仙堿可在人體內被氧化為二秋水仙堿,有劇毒,對消化系統、泌尿系統均可產生嚴重的刺激癥狀,誤食可產生嚴重的腹痛、頻繁的惡心、嘔吐和腹瀉等不良影響,同時也對神經系統有抑制作用,能降低體溫,使觸覺遲鈍,并發生上行性麻痹,如累及膈肌,則可引起呼吸運動障礙,可因呼吸衰竭而死亡,有報道誤食草貝母死亡的案例(昆明醫學院學報,2007,(2B):274-274)。輪葉貝母,又名一輪貝母,其植株通常具一輪葉,頂端具一朵花,果實與川貝母相似,也具有一定毒性。

對川貝母的鑒別,目前主要還是通過品種外觀進行區分,但是貝母間很多品種外觀非常相似,利用常規的外觀鑒定方法很難將它們進行區分,當藥材加工成粉末或其他產品時就更加難以鑒定。利用PCR從基因水平對品種進行鑒定可以解決這個難題,但是現在僅個別貝母品種有PCR鑒別的方法?!吨袊幍洹分写ㄘ惸歌b定使用了聚合酶鏈式反應-限制性內切酶長度多態性方法(《中國藥典2015年版》一部上冊第37頁),通過使用川貝母鑒定引物對供試品進行常規PCR檢測,然后將PCR產物經Sma I酶切后進行電泳檢測,在供試品凝膠電泳圖譜中,與對照藥材凝膠電泳圖譜相應的位置上,在100~250bp有兩條DNA條帶可證明樣品為川貝母。專利“浙貝母PCR鑒定試劑盒及鑒定方法”(申請號:CN201210350761.0)則提供了一種使用常規PCR對浙貝母成分進行檢測的方法。

目前,對于川貝母中易摻假且有毒性的草貝母和輪葉貝母還沒有快速準確的檢測方法,本領域迫切需要開發新的快速簡便地檢測草貝母和輪葉貝母成分的技術。



技術實現要素:

本發明的目的是為了解決現有技術所存在的上述技術問題,提供了一種實時熒光PCR檢測草貝母和輪葉貝母成分的引物探針及檢測方法。

根據草貝母rbcl基因和輪葉貝母ITS2基因的設計特異檢測引物和探針。

實時熒光PCR檢測草貝母源性成分的引物探針,分別為:

上游引物P1:CCAGTCTTGATCGTTACAAAGG

下游引物P2:GAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAAGG

帶有熒光染料的探針序列為:AGCATCGAGAAAGTTATTGGGGAAGAAAATCA

所述的熒光染料,5‘端為FAM標記,3’端為TAMRA標記。

實時熒光PCR檢測輪葉貝母成分的引物探針,分別為:

上游引物P1:CTACTCGGGACCTCGCAAT

下游引物P2:CACCGCAGAGGCATCGAC

帶有熒光染料的探針序列為:TCCTCGGACACTATTT。

所述的熒光染料,5‘端為VIC標記,3’端為MGB標記。

實時熒光PCR檢測草貝母和輪葉貝母成分的方法,其步驟如下:

1、提取待檢樣品基因組DNA

2、將檢測草貝母和輪葉貝母的上游引物、下游引物和探針稀釋至10μmol/L,然后等體積合并為混合引物(探針),以所提取的DNA作為模板,加入上述引物對和熒光染料標記的探針以及酶反應液進行實時熒光PCR反應,記錄樣品反應的Ct值;

所述的實時熒光PCR反應體系為:

3、所述的實時熒光PCR反應條件為95℃10min,1個循環;95℃15s,58℃30s,40個循環,在每次循環的58℃30s時收集熒光,設立FAM和VIC通道。

所述的實時熒光PCR方法還設有空白對照、陰性對照、陽性對照,判定標準為:

空白對照:以ddH2O為模板,按照2和3所述條件,進行實時熒光PCR反應,FAM和VIC通道檢測Ct值大于或等于40;

陰性對照:以非草貝母和輪葉貝母基因組DNA為模板,按照2和3所述條件,進行實時熒光PCR反應,FAM和VIC通道檢測Ct值大于或等于40;

陽性對照:以含有草貝母和輪葉貝母基因組DNA為模板,按照2和3所述條件,進行實時熒光PCR反應,FAM和VIC通道檢測Ct值大于或等于40檢測Ct值小于或等于36;

待測樣品FAM和(或)VIC通道檢測Ct值大于或等于40,陰性對照,陽性對照和空白對照結果正常者,判定該樣品未檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分;

待測樣品FAM和(或)VIC通道檢測Ct值小于或等于36,陰性對照,陽性對照和空白對照結果正常者,判定該樣品檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分;

待測樣品FAM和(或)VIC通道檢測Ct值在36-40之間,重做實時熒光PCR擴增,再次擴增后結果Ct值大于40且陰性對照,陽性對照和空白對照結果正常,判定該樣品未檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分;再次擴增后結果Ct值仍小于40且陰性對照,陽性對照和空白對照結果正常,判定該樣品檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分。

本發明提供了一種實時熒光PCR法檢測草貝母和輪葉貝母成分的引物、探針及具體檢測方法,具有良好的靈敏性和特異性,可用于草貝母和輪葉貝母成分的鑒定,對于加強中藥質量的管理,促進中藥現代化發展方面具有重大意義。

附圖說明

圖1是本發明實施例1檢測草貝母和輪葉貝母成分陽性樣品的熒光PCR擴增圖;其中,1為草貝母;2為輪葉貝母;

圖2是本發明實施例2檢測草貝母、輪葉貝母、川貝母、浙貝母、平貝母樣品的熒光PCR擴增圖;其中,1為草貝母;2為輪葉貝母;3為川貝母;4為浙貝母;5為平貝母。

具體實施方式:

下面對本發明做進一步詳細說明。

實施例1

1.所用引物和探針:

利用GenBank數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查找草貝母(Iphigenia indica)rbcL基因和輪葉貝母(Fritillaria maximowiczii)的ITS2基因,其GenBank Accession登錄號分別為AJ417893和KP712000.1,設計并合成實時熒光PCR特異性擴增引物和探針。

實時熒光PCR檢測草貝母源性成分的引物探針,分別為:

上游引物P1:CCAGTCTTGATCGTTACAAAGG

下游引物P2:GAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAAGG

帶有熒光染料的探針序列為:AGCATCGAGAAAGTTATTGGGGAAGAAAATCA

所述的熒光染料,5‘端為FAM標記,3’端為TAMRA標記。

實時熒光PCR檢測輪葉貝母成分的引物探針,分別為:

上游引物P1:CTACTCGGGACCTCGCAAT

下游引物P2:CACCGCAGAGGCATCGAC

帶有熒光染料的探針序列為:TCCTCGGACACTATTT。

所述的熒光染料,5‘端為VIC標記,3’端為MGB標記。

2.樣品DNA的提取與純化按以下步驟進行:

(1)分別稱取0.5g草貝母和輪葉貝母粉碎后材料放入同一個50mL離心管中;

(2)加入預熱的10mLCTAB抽提裂解緩沖液(使用前加入20μL蛋白酶K、20μL RNA、200μLβ-巰基乙醇),振蕩懸浮后65℃溫浴1h,期間不斷晃動,冷卻至室溫后,5000g離心10min;

(3)取上清950μL加入2mL離心管中,加入等體積氯仿異戊醇(24∶1)輕柔混勻靜置5min,12000rpm離心15min;

(4)取上清750μL加入2mL離心管中,加入等體積氯仿異戊醇(24∶1)輕柔混勻靜置5min,12000rpm離心15min;

(5)取上清500μL加入1.5mL離心管中,加入300μL異丙醇,50μL乙酸鉀溶液,輕輕顛倒混勻,室溫靜置30min,12000rpm離心15min,棄上清;

(6)加入1.0mL70%乙醇溶液,將沉淀懸浮浸泡,并將離心管傾斜,輕輕轉動數圈后室溫靜置2min,12000rpm離心10min,棄上清,如沉淀多重復此步驟一次;

(7)小心棄去上清液,干燥DNA沉淀,加入50-100μL ddH2O,65℃溶解DNA。

也可使用等效的商品化試劑盒提取模板DNA。

3.建立實時熒光PCR擴增反應體系

將檢測草貝母和輪葉貝母的上游引物、下游引物和探針稀釋至10μmol/L,然后等體積合并為混合引物(探針),所述的實時熒光PCR反應體系為:

在各設定的實時熒光PCR反應管中分別加入制備的模板DNA溶液,蓋緊管,瞬離5s-10s。

將加好樣后的反應管放入實時熒光PCR檢測系統內,記錄樣本擺放順序。

循環條件設置:95℃ 10min,1個循環;95℃ 15s,58℃ 30s,40個循環,設立FAM和VIC雙通道,在每次循環的58℃ 30s時收集熒光,檢測完畢后,根據擴增曲線和Ct值判定結果。

4.所述確定質量控制指標

空白對照:以ddH2O為模板,按照2和3所述條件,進行實時熒光PCR反應,FAM和VIC通道檢測Ct值大于或等于40;

陰性對照:以草貝母和輪葉貝母基因組DNA為模板,按照2和3所述條件,進行實時熒光PCR反應,FAM和VIC通道檢測Ct值大于或等于40;

陽性對照:以含有草貝母和輪葉貝母基因組DNA為模板,按照2和3所述條件,進行實時熒光PCR反應,FAM和VIC通道檢測Ct值大于或等于40檢測Ct值小于或等于36;

5.結果判定:

待測樣品FAM和(或)VIC通道檢測Ct值大于或等于40,陰性對照,陽性對照和空白對照結果正常者,判定該樣品未檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分;

待測樣品FAM和(或)VIC通道檢測Ct值小于或等于36,陰性對照,陽性對照和空白對照結果正常者,判定該樣品檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分;

待測樣品FAM和(或)VIC通道檢測Ct值在36-40之間,重做實時熒光PCR擴增,再次擴增后結果Ct值大于40且陰性對照,陽性對照和空白對照結果正常,判定該樣品未檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分;再次擴增后結果Ct值仍小于40且陰性對照,陽性對照和空白對照結果正常,判定該樣品檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分。6.檢測結果:

本發明實施例1將待檢草貝母和輪葉貝母樣品混合提取DNA后,進行實時熒光PCR檢測,含有草貝母和輪葉貝母的樣品顯示如圖1所示的陽性擴增曲線,表明該引物探針能對草貝母和輪葉貝母成分進行良好擴增。

實施例2

1.所用引物和探針:

選擇草貝母和輪葉貝母rbcl基因作為對象,設計并合成實時熒光PCR特異性擴增引物和探針。

實時熒光PCR檢測草貝母源性成分的引物探針,分別為:

上游引物P1:CCAGTCTTGATCGTTACAAAGG

下游引物P2:GAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAAGG

帶有熒光染料的探針序列為:AGCATCGAGAAAGTTATTGGGGAAGAAAATCA

所述的熒光染料,5‘端為FAM標記,3’端為TAMRA標記。

實時熒光PCR檢測輪葉貝母成分的引物探針,分別為:

上游引物P1:CTACTCGGGACCTCGCAAT

下游引物P2:CACCGCAGAGGCATCGAC

帶有熒光染料的探針序列為:TCCTCGGACACTATTT。

所述的熒光染料,5‘端為VIC標記,3’端為MGB標記。

2.樣品DNA的提取與純化按以下步驟進行:

(1)分別稱取0.5g草貝母、輪葉貝母、川貝母、浙貝母和平貝母等樣品粉碎后材料放入不同50mL離心管中;

(2)加入預熱的10mLCTAB抽提裂解緩沖液(使用前加入20μL蛋白酶K、20μL RNA、200μLβ-巰基乙醇),振蕩懸浮后65℃溫浴1h,期間不斷晃動,冷卻至室溫后,5000g離心10min;

(3)取上清950μL加入2mL離心管中,加入等體積氯仿異戊醇(24∶1)輕柔混勻靜置5min,12000rpm離心15min;

(4)取上清750μL加入2mL離心管中,加入等體積氯仿異戊醇(24∶1)輕柔混勻靜置5min,12000rpm離心15min;

(5)取上清500μL加入1.5mL離心管中,加入300μL異丙醇,50μL乙酸鉀溶液,輕輕顛倒混勻,室溫靜置30min,12000rpm離心15min,棄上清;

(6)加入1.0mL70%乙醇溶液,將沉淀懸浮浸泡,并將離心管傾斜,輕輕轉動數圈后室溫靜置2min,12000rpm離心10min,棄上清,如沉淀多重復此步驟一次;

(7)小心棄去上清液,干燥DNA沉淀,加入50-100μL ddH2O,65℃溶解DNA。

也可使用等效的商品化試劑盒提取模板DNA。

3.建立實時熒光PCR擴增反應體系

將檢測草貝母和輪葉貝母的上游引物、下游引物和探針稀釋至10μmol/L,然后等體積合并為混合引物(探針),所述的實時熒光PCR反應體系為:

在各設定的實時熒光PCR反應管中分別加入制備的模板DNA溶液,蓋緊管,瞬離5s-10s。

將加好樣后的反應管放入實時熒光PCR檢測系統內,記錄樣本擺放順序。

循環條件設置:95℃ 10min,1個循環;95℃ 15s,58℃ 30s,40個循環,設立FAM和VIC雙通道,在每次循環的58℃ 30s時收集熒光,檢測完畢后,根據擴增曲線和Ct值判定結果。

4.所述確定質量控制指標

空白對照:以ddH2O為模板,按照2和3所述條件,進行實時熒光PCR反應,FAM和VIC通道檢測Ct值大于或等于40;

陰性對照:以草貝母和輪葉貝母基因組DNA為模板,按照2和3所述條件,進行實時熒光PCR反應,FAM和VIC通道檢測Ct值大于或等于40;

陽性對照:以含有草貝母和輪葉貝母基因組DNA為模板,按照2和3所述條件,進行實時熒光PCR反應,FAM和VIC通道檢測Ct值大于或等于40檢測Ct值小于或等于36;

5.結果判定:

待測樣品FAM和(或)VIC通道檢測Ct值大于或等于40,陰性對照,陽性對照和空白對照結果正常者,判定該樣品未檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分;

待測樣品基因FAM和(或)VIC通道檢測Ct值小于或等于36,陰性對照,陽性對照和空白對照結果正常者,判定該樣品檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分;

待測樣品FAM和(或)VIC通道檢測Ct值在36-40之間,重做實時熒光PCR擴增,再次擴增后結果Ct值大于40且陰性對照,陽性對照和空白對照結果正常,判定該樣品未檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分;再次擴增后結果Ct值仍小于40且陰性對照,陽性對照和空白對照結果正常,判定該樣品檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分。

6.檢測結果:

本發明實施例2將草貝母和輪葉貝母成分檢測引物和探針分別對草貝母、輪葉貝母、川貝母、浙貝母和平貝母等DNA進行實時熒光PCR檢測,結果顯示樣品川貝母、浙貝母和平貝母無擴增信號,只有草貝母和輪葉貝母有擴增信號,實施例2表明本發明的引物和探針具有良好的特異性。

上述實施例僅供說明本發明之用,而并非是對本發明專利的限制;應當指出的是,對于本領域的普通技術人員,在不脫離本發明構思范圍的情況下,還可以作出各種變化和變型,這些都屬于本發明的保護范圍;因此,凡跟本發明權利要求范圍所做的均等變化與修飾,均應屬于本發明權利要求的覆蓋范圍。

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