RNA結合蛋白Rbm24基因在心肌病和心律失常中的應用的制作方法

文檔序號:18145645發布日期:2019-07-10 11:47
RNA結合蛋白Rbm24基因在心肌病和心律失常中的應用的制作方法

本發明涉及基因的功能與應用,尤其是涉及RNA結合蛋白Rbm24(RNA binding motif protein 24)基因在心肌病和心律失常中的應用,具體是Rbm24在診斷、預防、緩解和/或治療心肌病和心律失常中的應用。



背景技術:

遺傳性心肌病是各年齡階段心臟病的主要原因之一,病人通常在青少年或成年早期發病。從臨床診斷角度,遺傳性心肌病分為肥厚型心肌病、擴張型心肌病(Dilated Cardiomyopathy,DCM)、限制性心肌病和其它類型心肌病[1]。其中DCM是臨床診斷中最常見的心肌病,是繼冠心病和高血壓之后心力衰竭的第三位原因,其5年病死率為15%~50%[2],最終的治療方法是進行心臟移植,給社會和家庭帶來嚴重負擔。

DCM是以心肌壞死,纖維化為主要病理特征,心室內腔擴大,繼以心室收縮功能減退為主要特征的心肌疾病。臨床常表現為進行性充血性心力衰竭、心律失常、血栓栓塞甚至猝死。研究發現,有相當部分的DCM患者有家族聚集現象。對DCM病人的一級親屬進行詳細病史采集與檢查常能發現新的DCM病人,家族性DCM發生率遠遠高于以前所估計的數值,據報道,臨床上約有近25%~35%DCM患者是由遺傳因素所致[2],提示遺傳性因素在DCM發生中起著重要作用。至今已發現超過30個基因與DCM相關,其中基因大部分編碼心肌細胞骨架和心肌收縮蛋白,例如Titin、Tnnt2、Myh6、Myh7等[1,3](圖1)。DCM的病因和發病機制尚未明確。

心律失常(arrhythmia)是由于竇房結激動異?;蚣赢a生于竇房結以外,激動的傳導緩慢、阻滯或經異常通道傳導,即心臟活動的起源和(或)傳導障礙導致心臟搏動的頻率和(或)節律異常。心律失常是心血管疾病中重要的一組疾病。它可單獨發病,亦可與其他心血管病伴發。其預后與心律失常的病因、誘因、演變趨勢及是否導致嚴重血流動力障礙有關,可突然發作而致猝死,亦可持續累及心臟而致其衰竭。后天獲得性心律失??梢娪诟鞣N器質性心臟病,其中以冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病),心肌病,心肌炎和風濕性心臟病(簡稱風心病)為多見,尤其在發生心力衰竭或急性心肌梗死時。

近年來的研究發現,RNA結合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)家族對心臟功能有重要的調控作用[4]。RNA結合蛋白家族在對基因表達模式進行轉錄后(post-transcription)調節的過程中發揮重要作用,RBPs家族基因與遺傳性疾病的作用關系是目前研究的熱點,最近研究發現Rbm20是新的DCM的致病基因[5,6],調節肌聯蛋白(Titin)的剪切(splicing)。Rbm20突變的大鼠心室擴大,心律失常,猝死率增加,并伴隨泛纖維化與人類的心肌病表型相似。此項研究提示了功能不同的基因家族在人類心肌病的作用,尋找新的DCM發生的相關基因[1],將有助于深入理解DCM的發生的致病機制和調控規律,了解心臟功能和衰竭背后的分子學機制,發現DCM更有效的分子學診斷方法,并為心肌病的患者來設計新的治療策略。我們團隊之前通過轉錄譜技術分析人胚胎干細胞(hESC)分化的心肌細胞,發現一種RNA結合蛋白Rbm24(RNA binding motif protein 24,Rbm24)富集在hESC來源的純化心肌細胞中。申請人進一步在斑馬魚模型中對該基因的功能特征進行分析,首次闡明了Rbm24在心臟早期發育中的重要作用。我們近期的研究結果表明Rbm24對維持一系列心臟相關基因的表達和正常心臟功能是必需的,對心臟細胞肌絲形成及維持心臟節律性收縮是不可或缺的。

參考文獻:

[1]Olivotto,I.,et al.,Defining phenotypes and disease progression in sarcomeric cardiomyopathies:contemporary role of clinical investigations.Cardiovascular Research,2015.105(4):p.409-423.

[2]Hershberger,R.E.,A.Morales,and J.D.Siegfried,Clinical and genetic issues in dilated cardiomyopathy:A review for genetics professionals.Genetics in Medicine,2010.12(11):p.655-667.

[3]Kamisago,M.,et al.,Mutations in sarcomere protein genes as a cause of dilated cardiomyopathy.New England Journal of Medicine,2000.343(23):p.1688-1696.

[4]Lee,M.H.and Schedl,T.,RNA-binding proteins.WormBook,2006:p.1-13.

[5]Beraldi,R.,et al.,Rbm20-deficient cardiogenesis reveals early disruption of RNA processing and sarcomere remodeling establishing a developmental etiology for dilated cardiomyopathy.Human Molecular Genetics,2014.23(14):p.3779-3791.

[6]Guo,W.,et al.,Rbm20,a gene for hereditary cardiomyopathy,regulates titin splicing.Nature Medicine,2012.18(5):p.766-U162.

[7]Poon,K.L.,et al.RNA-binding protein Rbm24is required for sarcomere assembly and heart contractility.Cardiovasc Res,2012.94:p.418-427.

[8]Xu,X.Q.,et al.Global expression profile of highly enriched cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.Stem Cells,2009.27:p.2163-2174.



技術實現要素:

本發明的目的在于提供RNA結合蛋白Rbm24(RNA binding motif protein 24)基因在心肌病和心律失常中的應用。

Rbm24基因表達的試劑在制備心肌病和心律失常輔助診斷或預后產品中的應用;Rbm24基因或Rbm24基因所編碼的Rbm24蛋白及其下游靶基因在心肌病或心律失常藥物中的應用。

所述Rbm24基因表達試劑包括檢測Rbm24基因mRNA表達水平的試劑,和/或檢測Rbm24蛋白表達水平的試劑。

所述Rbm24基因mRNA表達水平的試劑包括QPCR中使用的引物,和/或探針。

所述檢測Rbm24蛋白表達水平的試劑,包括針對Rbm24蛋白的抗體。

所述抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、針對位點的特異性抗體。

所述Rbm24基因用于心肌病和心律失常輔助診斷或預后產品中的應用,所述產品包括權利要求1所述檢測Rbm24基因表達的試劑。

所述產品包括試劑盒、芯片或試紙。

所述Rbm24基因或Rbm24基因所編碼的Rbm24蛋白及其下游靶基因在心肌病或心律失常的應用,所述藥物靶向Rbm24基因。

所述藥物靶向Rbm24蛋白。

所述藥物靶向Rbm24蛋白的活性。

所述藥物靶向Rbm24基因的下游靶基因,如Mfn2,Slc25a3,Abcc9,Tpm2,Titin,Nebl,Fhod3,Enah,Obscn,Map4,Lmo7,Tpm1,Atp5c,Actn2,Tnnt2,Myh6,Myh7,Ldb3,Pdlim3,Ankrd1,Nrap,Myl3。

本發明的目的通過下述技術方案實現:采用條件敲除小鼠模型(knock out,KO)研究Rbm24在出生后個體心臟中的作用。通過建立了Rbm24-loxp轉基因小鼠,與使用雌激素他莫昔酚(tamoxifen)誘導性的Cre-Ert小鼠交配,可以在出生不同階段誘導產生Rbm24特異性敲除小鼠,研究Rbm24基因敲除對出生后成體心臟結構和功能的影響。發現誘導Rbm24敲除兩周后,與正常小鼠心臟對比,Rbm24敲除小鼠的射血分數下降,心室壁變薄,心室腔變大,表現出擴張型心肌病的形態學變化;Rbm24敲除小鼠心電圖表現出QRS波變寬,傳導阻滯,表明Rbm24的基因缺失導致了DCM和心律失常,RT-PCR結果還證明Rbm24調控了Titin等下游基因的表達,為診斷、預防、緩解和/或治療心肌病和心律失常提供新的方法。

附圖說明

圖1為野生小鼠和Rbm24敲除小鼠的Rbm24蛋白鑒定。

圖2為野生型和Rbm24敲除小鼠的心臟形態比較。

圖3為野生小鼠心臟超聲圖。

圖4為Rbm24敲除小鼠的心臟超聲圖。

圖5為野生小鼠和Rbm24敲除小鼠的心率。

圖6為野生小鼠和Rbm24敲除小鼠的舒張期室間隔厚度。

圖7為野生小鼠和Rbm24敲除小鼠的收縮期室間隔厚度。

圖8為野生小鼠和Rbm24敲除小鼠的舒張期左室內徑。

圖9為野生小鼠和Rbm24敲除小鼠的收縮期左室內徑。

圖10為野生小鼠和Rbm24敲除小鼠的收縮期左室后壁厚度。

圖11為野生小鼠和Rbm24敲除小鼠的舒張期左室后壁厚度。

圖12為野生小鼠和Rbm24敲除小鼠的射血分數。

圖13為野生小鼠和Rbm24敲除小鼠的收縮期左室容積。

圖14為野生小鼠和Rbm24敲除小鼠的舒張期左室容積。

圖15為野生小鼠的心電圖。

圖16為Rbm24敲除小鼠的心電圖。

圖17為野生小鼠和Rbm24敲除小鼠的Titin表達。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述。

1、Rbm24基因誘導性條件敲除小鼠獲得和鑒定

建立tamoxifen誘導下的敲除Rbm24基因小鼠模型,并與Cre-Ert小鼠交配,獲得條件敲除性小鼠F1,進而回交獲得F2純合子,tamoxifen(1mg/day腹膜注射,連續注射5d)誘導敲除,Western-blot檢測Rbm24基因敲除小鼠中Rbm24蛋白的表達(圖1)。

2、對Rbm24條件敲除小鼠進行表型分析:

1)解剖觀察Rbm24基因敲除后小鼠心臟的形態,如圖2所示,和正常小鼠相比,Rbm24敲除小鼠的心室壁變薄,心腔擴大。

2)超聲分析心功能的變化:小鼠分別經腹腔注射麻醉或口鼻吸入氣體麻醉,待其后肢反射消失后,仰臥位固定于39℃恒溫生理信息監測臺上,四肢涂抹少量耦合劑后分別固定于金屬探測片上,左胸前脫毛后進行經胸壁超聲探測,拍攝小鼠心臟超聲圖(圖3和4)。M-Mode超聲心動圖探頭置于小鼠左側胸前,向小鼠右肩旋轉30-45°,在乳頭肌最大切面應用M-Mode超聲記錄左心室運動情況,記錄心率(圖5),測量舒張期室間隔厚度(圖6),收縮期室間隔厚度(圖7),左室舒張末內徑(圖8),左室收縮末內徑(圖9),舒張期左室前壁厚度(圖10)和舒張期左室后壁厚度(圖11);每只小鼠做6次測量,取6個心動周期的平均值。然后計算左室射血分數(圖12),左室舒張末容積(圖13),左室收縮末容積(圖14),等。結果顯示,Rbm24敲除小鼠的射血分數下降,心室壁變薄,心室腔變大。

3)檢測小鼠心電的變化選擇潔凈、室內溫度比較恒定、無噪音的實驗室。連通心電圖機電源,打開機器預熱5min,調好基線,待穩定后將正常小鼠用1%戊巴比妥鈉,進行腹腔麻醉。待小鼠安靜后,取小鼠仰臥位,電極連線分為紅色(R)右上肢,黃色(I)左上肢,黑色(RF)右下肢,綠色(LF)左下肢,將針電極分別刺入其四肢皮下,記錄小鼠心電圖和心率。結果表明(圖15和16),Rbm24基因敲除小鼠心電圖中QRS波變寬,傳導阻滯。

4)Rbm24調控的下游靶基因。將Rbm24敲除小鼠和正常小鼠麻醉處死后,摘取心臟,用RT-PCR的方法檢測,發現其下游靶基因表達發生了明顯改變(基因見受Rbm24基因調控的下游靶基因列表),例如Rbm24敲除后,Titin基因兩個轉錄本(N2BA和N2B)中N2BA的表達變少(圖17)。

以下給出DNA堿基序列:

以下給出蛋白質氨基酸序列:

受Rbm24基因調控的下游靶基因列表參見表1。

表1

本發明公開一種RNA結合蛋白Rbm24(RNA binding motif protein 24)基因在心肌病和心律失常中的應用,屬于基因的功能與應用領域。經研究結果顯示,Rbm24基因與心肌病和心律失常密切相關。Rbm24基因特異性敲除后,小鼠的心室腔明顯擴大,表現出擴張型心肌病的功能性、病理性變化和心律不齊,表明Rbm24的基因缺失導致了心肌病和心律失常的產生。本發明表明Rbm24基因可以作為診斷和治療心肌病及心律失常的新靶點。

序列表

<110> 廈門大學

<120> RNA結合蛋白Rbm24基因在心肌病和心律失常中的應用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2467

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

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<210> 2

<211> 236

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

Gly Lys Ser Arg Gly Tyr Gly Phe Val Thr Met Ala Asp Arg Ala Ala

50 55 60

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65 70 75 80

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Pro Gly Phe Ala Phe Gly Val Gln Gln Leu His Pro Ala Leu Ile Gln

100 105 110

Arg Pro Phe Gly Ile Pro Ala His Tyr Val Tyr Pro Gln Ala Phe Val

115 120 125

Gln Pro Gly Val Val Ile Pro His Val Gln Pro Thr Ala Ala Ala Ala

130 135 140

Ser Thr Thr Pro Tyr Ile Asp Tyr Thr Gly Ala Ala Tyr Ala Gln Tyr

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165 170 175

Pro Tyr Ala Ala Ser Pro Ala Ala Ala Gly Tyr Val Thr Ala Gly Gly

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235

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