ALS相關SOD1基因突變的檢測方法及其引物組與流程

文檔序號:18145644發布日期:2019-07-10 11:47

本發明涉及分子生物學基因技術領域和醫學領域,涉及用分子生物學方法對肌萎縮側索硬化癥(ALS)相關SOD1基因突變進行檢測的引物組,特別涉及用Ion Torrent半導體芯片測序技術對ALS相關SOD1基因突變進行定性、定量檢測的相關引物組及其試劑盒。



背景技術:

肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)也叫運動神經元?。∕ND),是一種選擇性侵犯上、下運動神經元的致死性神經退行性疾病,以皮質、腦干、脊髓運動神經元進行性死亡導致肌無力、肌萎縮和呼吸肌癱瘓為特征?;颊叱霈F進行性加重的肌無力和肌肉萎縮,多在起病后3~10年內因呼吸功能衰竭死亡。ALS按其起病方式可分為散發性ALS(Sporadic ALS, SALS)和家族性ALS(Familial amyotrophic lateral sclerosis , FALS),SALS占90%~95%,FALS占5%~10%,兩者在臨床表現上并無明顯區。

ALS多為成人隱襲起病,慢性進行性發展,兼有上下運動神經元受損的癥狀和體征,表現為肌無力,肌萎縮和錐體束征,一般無感覺障礙以及大小便障礙。

關于ALS的發病機制有較多理論,其中對SOD1基因(銅鋅超氧化物岐化酶基因)致病機制研究最多,但具體發病機制尚不清,目前的共識是SOD1基因突變導致蛋白毒性功能獲得(Toxic gain of function)而不是功能喪失(Loss of function)。家族性肌萎縮側索硬化(family amyotrophic lateral sclerosis, FALS)中有15%~20%的家系是SOD1基因突變家系,到目前為止,在FALS患者中已發現SOD1基因有超過150多個突變位點。

SOD1基因定位于21q22.11,基因組DNA全長11kb,含有5個外顯子,編碼一種153個氨基酸的SOD1蛋白。該蛋白是一種自由基清除酶,在神經組織、肝臟、紅細胞中高表達,主要功能是清除細胞內的超氧自由基。約20%的FALS和5%的SALS與該基因突變有關,主要為點突變,其中錯義突變占絕大多數。

目前檢測ALS相關SOD1基因突變位點的方法有PCR-SSCP、經典測序等,存在通量低、成本貴等問題,對PCR產物長度也有一定限制。

Ion Torrent半導體芯片測序技術是新一代的測序技術,它的核心技術是使用半導體技術在化學和數字信息之間建立直接的聯系。在半導體芯片的微孔中的微球上固定DNA鏈,隨后依次摻入單核苷酸dGTP、dCTP、dATP、dTTP。隨著每個堿基的摻入,釋放出H+,H+在它們穿過每個孔底部時能被檢測到,通過對H+ 的檢測,實時判讀堿基。由于其化學測序原理自然簡單,無修飾的核苷酸、無激光器或光學檢測設備,因而可達到極小的測序偏差和出色的測序覆蓋均衡度,一臺儀器即可適合各種測序通量需求的科學研究,在較短的時間內獲得真實可靠的實驗結果。

Ion Torrent半導體芯片測序技術與傳統Sanger法及二代測序技術比較,Ion Torrent技術有以下優勢:系統無激光光源,無光學系統,無照相系統;使用無標記的核苷酸及酶進行測序,本底干擾低;通過對 H+的檢測,可以改善堿基判讀準確性;測序通量大、速度快,完成1G通量的測序檢測僅需2~3小時,是傳統Sanger測序方法通量的數千倍以上,同時彌補了已有二代高通量測序方法工作時間過長的缺陷。

目前尚沒有報道Ion Torrent半導體芯片測序技術專門用于ALS相關SOD1基因突變的檢測。



技術實現要素:

本發明的目的是為了彌補現有技術的不足,提供針對ALS相關SOD1基因突變的定性、定量檢測的方法及其引物。

為解決上述問題,本發明采取以下技術方案:

利用生物信息學知識和相關生物信息學軟件,對公開數據庫中所能檢索到的ALS相關SOD1基因突變區域序列,用Primer Express Software 5.0軟件設計PCR引物。

用于檢測SOD1基因序列片段1的引物,是由序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2組成的引物對。

上游引物:5’- agtagaattaggaaccaggacctcggc -3’ SEQ ID No: 1;

下游引物:5’- cctcgcaaacaagcctcc -3’ SEQ ID No: 2。

用于檢測SOD1基因序列片段2的引物,是由序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4組成的引物對。

上游引物:5’- agtagaattactccaacttcgcacttttctta -3’ SEQ ID No: 3;

下游引物:5’- cagcacagcacaacaccca -3’ SEQ ID No: 4。

用于檢測SOD1基因序列片段3的引物,是由序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6組成的引物對。

上游引物:5’- agtagaattagggagttttagcagtgtttctttt -3’ SEQ ID No: 5;

下游引物:5’- gctatcgccattattacaagagtta -3’ SEQ ID No: 6。

用于檢測SOD1基因序列片段4的引物,是由序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8組成的引物對。

上游引物:5’- agtagaattagccctaatccatctgatgctt -3’ SEQ ID No: 7;

下游引物:5’- ttatgcttatccttttatgaaaacttac -3’ SEQ ID No: 8。

用于檢測SOD1基因序列片段5的引物,是由序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10組成的引物對。

上游引物:5’- agtagaattaaagagtgactgcggaactaagg -3’ SEQ ID No: 9;

下游引物:5’- gggctcagactacatccaagg -3’ SEQ ID No:10。

采用多重PCR的方法用上述引物組對待檢測樣本進行PCR擴增。

將PCR擴增產物進行擴增子文庫的構建、ISP(Ion Sphere? Particles, Ion微球)模板的制備,在Ion Torrent PGM系統上進行測序,并用軟件對相關測序序列進行分析。

本發明利用多重PCR方法結合Ion Torrent半導體芯片測序技術同時對ALS相關SOD1基因突變進行并行檢測,其優勢在于通量大,特異性及靈敏度高,結果穩定,重復性好,檢測速度快的優點。

具體實施方式

本發明結合具體實施例做進一步說明。應理解,這些實施例僅用于說明目的,而不用于限制本發明范圍。

實施例1、用于ALS相關SOD1基因突變檢測的引物組的設計。

利用生物信息學知識和相關生物信息學軟件,對公開數據庫中所能檢索到的ALS相關SOD1基因突變區域序列,用Primer Express Software 5.0軟件設計PCR引物,引物序列為如下。

用于檢測SOD1基因序列片段1的引物,是由序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2組成的引物對。

上游引物:5’- agtagaattaggaaccaggacctcggc -3’ SEQ ID No: 1;

下游引物:5’- cctcgcaaacaagcctcc -3’ SEQ ID No: 2。

用于檢測SOD1基因序列片段2的引物,是由序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4組成的引物對。

上游引物:5’- agtagaattactccaacttcgcacttttctta -3’ SEQ ID No: 3;

下游引物:5’- cagcacagcacaacaccca -3’ SEQ ID No: 4。

用于檢測SOD1基因序列片段3的引物,是由序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6組成的引物對。

上游引物:5’- agtagaattagggagttttagcagtgtttctttt -3’ SEQ ID No: 5;

下游引物:5’- gctatcgccattattacaagagtta -3’ SEQ ID No: 6。

用于檢測SOD1基因序列片段4的引物,是由序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8組成的引物對。

上游引物:5’- agtagaattagccctaatccatctgatgctt -3’ SEQ ID No: 7;

下游引物:5’- ttatgcttatccttttatgaaaacttac -3’ SEQ ID No: 8。

用于檢測SOD1基因序列片段5的引物,是由序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10組成的引物對。

上游引物:5’- agtagaattaaagagtgactgcggaactaagg -3’ SEQ ID No: 9;

下游引物:5’- gggctcagactacatccaagg -3’ SEQ ID No:10。

每個檢測序列片段的上游引物5’端均包含一段用于識別樣本信息的barcode序列5’- agtagaatta-3’。

實施例2、 ALS相關SOD1基因突變的檢測。

1)樣本基因組DNA的獲取

用細胞裂解法提取口腔黏膜脫落細胞中的DNA,懸浮于1mL生理鹽水中,2000×g離心10min;棄上清,每管加1mL生理鹽水重復洗滌1次,再2000×g離心10min;棄上清,每管加400μL細胞裂解緩沖液(10mmol/L Tris-HCl, PH8.0; 0.1mol EDTA, PH8.0; 0.5%SDS),放在50℃水浴中溫育30min;然后冷卻至室溫,加等體積的酚—氯仿—異戊醇(體積比25:24:1),混勻,5000×g離心10min;轉移上層水相到另一離心管中,重復抽提1次;再轉移上層水相到另一Eppendorf管中,加1/10體積的3M NaAc(PH5.2),混勻;加入2.5倍體積的95%冷乙醇,混勻,-20℃沉淀DNA30min;10000×g離心15min,棄上清;加1mL70%冷乙醇清洗沉淀,10000×g離心15min,棄上清;37℃溫箱30min烘干;將DNA沉淀溶于20μL TE緩沖液中,加1μL RNA酶,37℃ 30min,置于-20℃保存。

2)PCR的擴增和測序

以步驟1)提取的樣本基因組DNA為模板,在實施例1所述引物的引導下,進行多重PCR擴增(95℃ 5 min; 95℃ 15 s,60 ℃ 1 min,共40個循環),獲得的擴增產物依次進行擴增子文庫的構建,ISP(Ion Sphere? Particles, Ion微球)模板的制備,以及芯片上樣和在Ion Torrent PGM系統上進行測序。

3)分析并獲得結論

用IGV2.0軟件對測序結果進行分析,統計以下五個SOD1基因片段的讀序結果,根據檢測結果對每個突變位點進行判斷其為野生型或突變性,如為野生型,則結果提示為“突變陰性”,如為突變型,則結果提示為“突變陽性”。

如在所有檢測位點中存在“突變陽性”結果,則本次檢測的結論為:“該受檢者所檢SOD1基因中檢出×××(突變位點)突變,提示肌萎縮側索硬化癥ALS”。

如在所有檢測位點中均為“突變陰性”結果,則本次檢測的結論為:“該受檢者所檢SOD1基因中未檢出突變”。

檢測樣本一個,檢測結果及結論見下表。

序列表

<110> 上海聯吉醫學檢驗所有限公司

<120> ALS相關SOD1基因突變的檢測方法及其引物組

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtagaatta ggaaccagga cctcggc 27

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctcgcaaac aagcctcc 18

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtagaatta ctccaacttc gcacttttct ta 32

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cagcacagca caacaccca 19

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtagaatta gggagtttta gcagtgtttc tttt 34

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctatcgcca ttattacaag agtta 25

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agtagaatta gccctaatcc atctgatgct t 31

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttatgcttat ccttttatga aaacttac 28

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agtagaatta aagagtgact gcggaactaa gg 32

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gggctcagac tacatccaag g 21

再多了解一些
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